材料和试剂

史密斯医疗TM Portex TM 细口径的聚乙烯管（参考：800/100/200，0.58 毫米内径0.96 毫米外径）
23 G针和1 ml注射器
PEN（聚萘二甲酸乙二醇酯）膜片（徕卡，11505158 ;应用乙Iosystem，目录号：LCM0522 ）和幻灯片信箱
薄壁0.5 ml Eppendorf管（Invitrogen，目录号：Q32856 ）。
小鼠（C57BL或其他）
苯巴比妥溶液（例如，Pentoject ，Animalcare limited，英国）
70％乙醇
干冰或液氮
PBS片剂（Sigma，目录号：P4417-100TAB）
蔗糖
RNaseZAP 解决方案（赛默飞世尔，目录号：AM9780 ）
乙醇溶液（100％，95％，75％，50％）
裂解缓冲液（试剂盒中提供）（Applied Biosystems，目录号：KIT0204 ）。
Picopure RNA分离试剂盒（Applied Biosystems，目录号：KIT0204 ）。
量子® RNA HS（高灵敏度）测定试剂盒（Invitrogen公司，目录号：Q32852）
Agilent RNA 6000 Pico试剂盒（Agilent，目录号：5067-1511 ）。
OCT（最佳切割温度）复合溶液（任何品牌，例如Fisher Scientific，目录号：12678646）和PBS（请参见食谱）

配套设备

Qubit机器
暗室
低温恒温器
镊子和剪刀，细绳
徕卡激光显微切割镜LMD 6500
磁带站或Agilent 2100生物分析仪
-80 °C 冰柜

程序

肺组织收集离子
夹带的小鼠[ 第7天L / d（12 小时光照/ 12 ，随后1天d / d（12小时黑暗））小时黑暗/ 12 小时黑暗）] 被屠宰在d / d通过要么叶。注射苯巴比妥（200 μl /只小鼠或颈部脱臼。每个时间点使用一只小鼠，每4 h 收集样品48 h，一旦它们死了，将尸体移至手术区域。
注意事项：

在先前的肺昼夜节律基因分析研究中，病情因L / D，D / D和L / L（12 h光照/ 12 h光照）而异。
首选前一种方法，因为有时气管可因颈部脱位而受损。
尽管文献中经常使用从几只小鼠（如n = 3）中收集的样本进行此类研究，但我们的研究数据表明这可能不是必需的。当小鼠存量有限时，可以以不同的方式淘汰小鼠实验（例如，在一个实验中仅收集CT0-32样本，而从另一个实验中收集其余样本）。我们对结果没有太大影响；甚至组织也相距近6个月。
用70％的乙醇喷洒小鼠，从腹部到下巴垂直切开皮肤，刺穿胸膜以打开胸膜腔并去除肺上方的肋骨，提起并切断胸腺以暴露气管，然后可以围绕气管结缔组织被钝钳剥开。
用弹簧剪刀在气管上部切开一个缺口，然后将装有23 G针的BAL灌洗管插入气管中。可用细绳系结以固定插入物。
注意：这样做不是绝对必要的，因为可以使用镊子代替，但这在肺切除的后续步骤中很有帮助。

填充约0.8μm 升OCT 溶液[ 50％（V / V）OCT在PBS溶液（用DEPCħ制成2 O）用5％的蔗糖] ，在1 毫升注射器。并缓慢注入溶液通过气管膨胀肺。
取出肺部，用镊子或扎带闭合气管。修剪心脏和胸腺，然后在干冰或液氮中冷冻肺部。用箔纸盖住的肺部放入-80 °C的冷冻器进行保存。
注意：液氮中冷冻的样品由于质地变得非常脆而难以切割，干冰和液氮冷冻样品中的RNA质量相当，没有明显变化。

肺切片
切除前，取出肺部并将其放在低温恒温器中30 分钟。
将肺垂直安装，将冠状切片切成10 µm的厚度，每个PEN膜玻片3-4个切片。
注意：可以使用无RNase的PEN玻片或普通的PEN玻片。对于后者，可以通过在细胞培养罩中暴露30分钟的紫外线或使用RNaseZap 清洁PEN膜。

可以从室温直接将组织切片直接放入载玻片中，但是一旦将切片放在载玻片上，就将其留在低温恒温器中。解剖区域的示例如图所示。
通常，每只小鼠要切10张玻片用于RNA序列研究（显微解剖后总RNA产量为150-450 ng）。
注意：用量取决于构建测序文库的方法。对于Illumina Trueseq 试剂盒，最低RNA量要求为100 ng。使用扩增步骤时，所需材料少得多，即使在象形图范围内也需要总RNA 。

2-3张载玻片的产量足以在qPCR研究中获得RNA。
将幻灯片放在封闭的幻灯片邮箱中，并将幻灯片存储在-80中 °C冰柜，建议在2周内完成玻片显微切割。

激光捕获显微切割
将标本载玻片从干冰中取出，并迅速放入酒精溶液中，如下所示：
100％乙醇1 分钟，75％乙醇3次浸入，50％乙醇3次浸入，95％乙醇30 秒，100％乙醇30 秒，100％乙醇2-5 分钟。对于乙醇溶液，请避免将其放置太长时间防止水从空气中进入并在长时间使用后更换新溶液。可使用化学物质进一步干燥乙醇。必须使最后的乙醇溶液保持100％，因为RNase 不能没有水就不能工作。

注意事项：

乙醇中的甲酚紫溶液可以用来染色切片，但在这里不是必需的。细支气管的结构很容易在光学显微镜下识别而没有任何染色。
此过程的目的是将OCT溶解在水中并使切片最终干燥以防止RNase活性。
徕卡LMD 6500激光捕获显微切割机是采用后滑轨干燥下来，他们被放置在片夹，对于组织收集，0.5 毫升薄壁PCR管用于在组织收集，用30 Myueru裂解液添加（广告d根据试剂盒协议，使用Picture RNA分离试剂盒，Life Technologies ，然后使用DTT 。
检查样本，寻找支气管航空公司在显微镜下W¯¯ Ith的6.7 X 或10倍放大倍率。支气管上皮被切断结终末细支气管和肺泡管道之间，近侧〜 200 Myuemu 沿细支气管。激光设置应该是测试版事前下图显示了我们实验室使用的显微剖视图和激光设置（图1）。

图1 ，图示激光捕获远端细支气管上皮细胞组成。该视图是在6.7 X 放大倍率随着2个细支气管航空公司显示在中间在A，B ，展示了如何切割线绘制与C ，显示了组织即等之后激光设置在D中显示。

检查收集解决方案约每1个小时，增加30 MYU 大号裂解缓冲区或DEPC ^ h 2 Ø之前的解决方案在帽上干运行，建议使用2个或3个收集管对于1个样品，以避免解决方案过于经过长时间的显微解剖后，这些样品管的厚度会增加。
注：对于Picopure RNA提取试剂盒，建议孵化样品在42 ℃，为30分钟，首个完全裂解组织这一步既可以做即时夹层或者只是RNA提取之前之后。

通常需要5-8它h至手动解剖10幻灯片。最后，将管子放干冰上，样品可以储存长期在-80 ℃下。
注意事项：

选择多个目标区域后可以选择自动切割，但是在闭合的切割位置上发现目标部分``悬挂''而不是掉下来并不罕见，这种情况下，使用手动点射击方法进行切割偏离目标区域。
每个载玻片需要30-45 分钟的时间进行显微切割。在显微切割过程中，可以同时进行粗略和精细的移动。建议在解剖每个载玻片后用显微镜再次检查切片，以免丢失目标区域。

RNA提取和研究
Picopure RNA提取试剂盒自Life Technologies抽提RNA用于根据封闭协议。在提取过程中，DNA柱上消化执行。如描述的协议。最终RNA洗脱在20 Myueru 容量低RNA结合的Eppendorf管建议拿着样品。

注：微的RNeasy试剂盒气根和EZNA Microelute 总RNA试剂盒VWR也可以用它也可以做提取糖原降水没有任何工具，但它可能需要更长的时间待办事宜。

量化方法，建议以1 Myueru RNA的稀释1 ：5在H 2 O.由此看来，使用1 Myueru 量化RNA量量子比特® 。RNA HS（高灵敏度）分析典型的浓度高于10 伍/ μl 。剩余的可以保存用于最终RNA seq数据的qPCR验证。对于RNA完整性的质量评估，请使用Agilent RNA 6000 Pico试剂盒或Tape station.RIN值通常在6-8左右。如果值太低，应收集新的小鼠肺部样本以重新开始该过程。

注意小号：

当浓度测定在一个正常的纳米d 罗普机，其浓度可以是非常不准确的。成功的QPCR应用做随着激光捕获Microddisected 材料从仅有2幻灯片时的浓度是在低于0纳克/ Myueru 范围内的纳米d 罗普。
如果量太低，可以使用更多的玻片进行显微解剖，最后使用该RNA溶液将RNA洗脱或汇集在一起，并检查步骤A3的扩增步骤，但是建议通过收集以下步骤避免这种情况首先，尽可能多的材料。
已知肺中的RNase含量很高，在其他组织（如脑）中，RIN值可高达8-9。
下图显示了典型的RNA质量，显示Club细胞富集的qPCR结果和显示昼夜节律基因表达的RNA seq结果（图2）。

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图2 。典型的RNA质量，QPCR和RNA SEQ结果。阿。磁带Station显示RNA质量。乙。与C 。富集所示QPCR。d俱乐部细胞标记和小血管内皮细胞的污染。和e 。BMAL1与Per3基因表达RNA seq的结果分析了激光捕获的显微解剖的Club细胞。

资料分析

使用这种方法的研究结果发表在FASEB期刊上（Zhang 等，2019）。

菜谱

OCT（最佳切割温度）复合溶液和PBS
含5％蔗糖的溶液（1x PBS溶液中的50％（v / v）OCT （由PBS片剂在DEPC H 2 O中制得））
在添加OCT之前先溶解蔗糖，这将使蔗糖更易于溶解

致谢

作者感谢BBSRC的，英国对于这种资助工作和方法是基于Betsuyaku和高级（2004年）和卡明斯等人。（2011）。

竞争利益

作者没有任何竞争利益。

道德规范

经曼彻斯特大学动物福利和伦理审查机构批准，所有动物实验均根据1986年英国内政部动物（科学程序）法和欧洲指令2010/63 / EU进行。

参考小号

Betsuyaku ，T.和Senior，RM（2004）。小鼠气道上皮的激光捕获显微切割和mRNA表征：方法上的考虑。微米35（4）：229-234。
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