材料和试剂

1. 15毫升锥形管（BD猎鹰，目录编号：352096）

2. 枪头（FISHERBRAND ，目录号小号：02-681-165，02-681-147或等同）

3. 带有功能性Mx1 等位基因的C57BL / 6小鼠（Horisberger 等，1983）

注意：由于Mx1基因缺陷，大多数实验室小鼠品系高度易感流感，这是干扰素刺激的重要基因，可抵抗流感（Iwasaki ，2016）。因此，我们更喜欢使用Mx1同基因B6小鼠研究宿主对流感的反应病毒。

4. 高毒力A / PR / 8/34（H1N1; hvPR8）（Grimm et al。，2007）

以前，hvPR8菌株是通过Mx1小鼠的连续肺传代产生的（Grimm et al。，2007）。

5. 1X PBS（Sigma，目录号的：D8537）

配套设备

环境室（Caron，型号7000-10 ）
雾化器（Schuco 联合医疗产品，型号：S5000）
鼠标馅饼笼（Braintree Scientific，型号：MPC-3 AERO）
体重秤（OHAUS，Scout Pro，型号：SP202）
移液器（DENVILLE，P1000，P200）

软体类

GraphPad Pris m 7.0（GraphPad软件; https://www.graphpad.com/）

程序

在环境室中对小鼠进行预处理
将小鼠转移到级别2生物安全（BSL2）适应性饲养3-7天。划分小鼠随机用于容纳不同湿度条件下在20 ℃下，5只小鼠的每个组。
将小鼠放在放置在相对湿度为20％或50％的室内的笼子中放置5-7天。

通过气溶胶暴露感染流感（在BSL2条件下进行）
用PBS 稀释hvPR8 2 x 10 5 pfu / ml，并准备4 ml稀释的病毒溶液。
注：（LD这种病毒的浓度为致死剂量50 50 ）。在这项研究如果您更改流感病毒或小鼠品系，你应该确定LD 50 为你的条件及实验继此协议通用实验测量LD之前，50 是Zhao等人（2018）报道。

将小鼠（最多同时容纳12只小鼠）放入饼笼中。
设置雾化器，倒入4毫升稀释的病毒溶液（3 毫升的确切体积将在15分钟的气雾剂输送期间使用）。
打开雾化器的开关，暴露15分钟（图1和视频1）。

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1.表示图如何感染流感病毒在小鼠中使用喷雾器。一。小鼠对角放入饼凯奇如果号码小鼠少比12 乙。图片连接饼凯奇和雾化器。

视频1.通过气雾剂感染

将小鼠放回笼子里，并放置在各自的环境下。
监测小鼠的体重和死亡2周（图2和视频2），按照动物保护和使用委员会的指导对动物实施安乐死。

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图2.体重测量鼠标放在体重秤上以测量体重

视频2.测量体重

资料分析

使用GraphPad Pr ism 分析存活曲线和体重减轻（图3）。

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图3 。低相对湿度导致更严重的疾病。（A）的重量和（B）存活率监测11天数据代表五个实验和手段±SEM。* P <0.05;单因素方差分析;时序（Mantel - Cox）（改编自Kudo 等人，2019）。

致谢

这项工作得到了内华达基金会（Condair Group）和内藤基金会（EK）赠予的霍华德·休斯医学研究所（AI）的部分支持。该协议的缩写版本最初发表在“环境湿度低会损害屏障功能和先天性抵抗力”上。预防流感感染” （工藤等，2019）。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

道德规范

本研究中使用的所有程序均符合耶鲁动物保健和使用委员会的联邦和机构政策（协议编号10365）。

参考文献

阿隆索，WJ，Yu，C.，Viboud，C.Richard，SA，Schuck-Paim，C.Simonsen，L.，Mello，WA和Miller，MA（2015）。全球半球流感疫苗推荐图。关于病毒循环的局部模式》，科学代表5：17214。
Clark，JD，Gebhart，GF，Gonder，JC，Keeling，ME和Kohn，DF（1997）。1996年实验动物的护理和使用指南。ILAR Journal 38（1）：41-48。
格林（D.Grimm），斯坦赫利（Staeheli），胡夫鲍尔（M.Hufbauer），科恩纳（Koerner），马丁内斯-索布里多（L.Martinez-Sobrido），佐治亚（Sororzano），A。。）。复制健身确定高毒力A型流感病毒在小鼠具体功能的Mx1抗性基因国家科学院院刊USA 104（16）：6806-6811。
Horisberger，MA，Staeheli，P。和Haller，O。（1983）。干扰素在小鼠细胞中诱导一种独特的蛋白质，该蛋白质带有对流感病毒具有抗性的基因， Proc Natl Acad Sci USA 80（7）：1910-1914。
Iwasaki，A.（2016）。近交小鼠的抗病毒反应。Nat Rev Immunol 16（6）：339。
约翰逊（NB），海斯（Hayes），LD，布朗（K.），胡（Hoo），欧共体（EC），埃西尔（Ethier），KA，疾病预防控制中心（2014）.CDC国家卫生报告：发病率和死亡率以及相关行为风险和保护性疾病的主要原因因素-美国，2005-2013年 .MMWR增刊63（4）：3-27。
E.Kudo，Song，E.Yockey，LJ，Rakib，T.，Wong，PW，Homer，RJ和Iwasaki，A.（2019）。低环境湿度会削弱屏障功能和对流感感染的固有抵抗力 .Proc Natl美国科学院院报116（22）：10905-10910。
Lakdawala，SS和Subbarao，K.（2012）。对抗流感的持续斗争：流感传播的挑战。Nat Med 18（10）：1468-1470。
Lowen，AC，Mubareka，S.，Steel，J.和Palese，P.（2007）。流感病毒的传播取决于相对湿度和温度， Plos Pathogens 3（10）：1470-1476。
Moura，FE，Perdigao，AC和Siqueira，MM（2009）。热带地区流感的季节性：巴西东北部的独特模式。Am J Trop Med Hyg 81（1）：180-183。
Shaman，J.，Pitzer，VE，Viboud，C.，Grenfell，BT和Lipsitch，M.（2010）。美国大陆的绝对湿度和流感的季节性发作。PLoS Biol 8（2）：e1000316。
Shek，LP和Lee，BW（2003）。热带地区呼吸道病毒感染的流行病学和季节性。Paediatr Respir Rev 4（2）：105-111。
Tamerius，JD，巫师，J.，阿隆索，WJ，布卢姆-费什巴赫，K.，Uejio，CK，科姆里，A。和Viboud，C.（2013）。环境预测结果的季节性流感流行跨温带和热带气候。公共科学图书馆病理9（3）：e1003194。
Zhao，B.Shan，J.，Xiong，R.，Xu，K. and Li，B.（2018）.H1N1 病毒的产生和感染。生物协议8（20）：e3062。