材料和试剂

玻璃盖玻片（中国风帆品牌）
大肠杆菌 BL21（DE3）（-80°C）
pQE80L-POI或pET28a-POI质粒（Supplemetal文件中的矢量信息）。
Milli-Q水（18.2MΩ/ cm）
Luria-Bertani（LB）培养基（BD Difco ）
六水合氯化铁（99％，能源化工）
Ç Alcium氯化物水合物结晶集合物（99.9965 Pasento，阿尔法Aesar公司）
（3- 一个Minopropyl）三乙氧基硅烷（APTES，99％，Sigma-Aldrich公司）
小号Ulfosuccinimidyl 4-（N- 马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC，Thermo Scientific）进行
氯化钠（NaCl）（99 ％，BBL生命科学）
Ť RIS（羟甲基）氨基甲烷至（Ť RIS ，> 99.9％，生工Biotech）的
EDTA（99.5％，Macklin）
5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（99％，Alfa Aesar ）。
氨苄西林钠盐（99％朱艳生物）。
卡那霉素（≥ 750 MYU ģ /镁，金刚石）
硫酸镁（MgSO 4 ）（AR，上海凌风化学试剂有限公司）
氯化钙（CaCl 2 ）（AR，阿拉丁）
D（+）-葡萄糖（AR，阿拉丁）
IPTG（异丙基-β-d- 硫代吡喃半乳糖苷）（99％朱艳生物）
DNA酶（来自牛胰腺，活动≥ 500 Kunitz结构U /毫克，生工Biotech）的
RNase（牛胰腺中，活性≥60 U / mg，Sangon Biotech）
PMSF （朱彦生物）
铬酸钾（99.5％，Macklin）
浓硫酸（AR，国药化学试剂有限公司）
乙醇（AR，国药化学试剂有限公司）
咪唑（99％阿拉丁）
尿素（AR，国药化学试剂有限公司）
TEV蛋白酶（由我们自己生产）
OaAEP 1 （由我们自己生产）
的BamH 我（TaKaRa公司）
Bgl II （TaKaRa ）
Kpn I （TaKaRa ）
T4连接酶（TaKaRa ）
甘油（99％，Macklin）
M9中号（请参阅食谱）
铬酸（请参阅食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
DTNB解决方案（请参阅食谱）
TEV蛋白酶溶液（请参阅食谱）
AFM测量缓冲区（请参阅配方）

配套设备

Avanti JXN-30离心机（贝克曼库尔特）
AKTA FPLC系统（GE Healthcare）
Mono Q 5/50 GL（GE Healthcare）
纳米d 罗普2000分光光度计（Thermo Scientific的）
Nanowizard 4 AFM（JPK Instruments AG）
氮化硅悬臂（MLCT，Bruker Corp）
声波发生器（Biosafer 650-92）

软体类

JPK数据处理（由JPK Instruments AG开发）
Igor Pro 6.12（波制）

程序

基因克隆
三限制使用消化酶系统的BamH 我-POI - 的Bgl II -Stop密码子KPN 我。连接不同蛋白片段的基因这种酶系统使用的Bgl II 和KPN 我文摘要生产向量和使用的BamH 我和KPN 我为了产生文摘的插入。作为的BamH 我消化的Bgl II 消化导致相同的粘性末端（GATC），它可以使用T4连接酶连接载体和插入。
通过测序确认所有基因。

目的蛋白的表达和产生
注意：在实验操作中，要始终注意无菌操作，不同的蛋白质在大肠杆菌中的保存期限不同，有必要测试特定蛋白质的保存期限。

将pQE80L-POI或pET28a-POI质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中。
将细菌溶液应用于含有pQE80L质粒的氨苄青霉素钠盐（100μg / ml ）或用于pET28a质粒的卡那霉素（50μg / ml ）的LB平板中，并在37°C下孵育14-16 h。
单菌落成拾15米升LB培养基含有氨苄青霉素钠盐（100 微克/米升）或卡那霉素（50 微克/米升），保持在200rpm在37℃下振荡℃下16-20小时。
生长饱和度，稀释后的过夜培养进入800米大号新鲜LB培养基（添加到LB培养基的比例为1 ：50）包含。各抗生素（抗生素的浓度同上）作为金属蛋白，离心文化在1,8 00 ×g的和再悬浮沉淀- 16进制大号M9培养基中，然后加入800种大号含M9介质好各抗生素。
在37°C下以200 rpm的速度摇动培养物，直到600 nm（OD 600 ）的光密度达到0.6-0.8（这大约需要2.5- 3 h，而M9 培养基总是需要大约5-6 h）。保留100- MYU 大号样的文化作为预感应控制对于检测蛋白表达。
加入IPTG（异丙基-β-d- 硫代巯基乳糖吡喃糖苷）至终浓度为1 mM以诱导蛋白质表达，而金属蛋白质始终需要一些额外的金属离子，并在37℃下以200 rp m 摇动培养物4-6 h 。
在4°C下以13 000 x g的浓度收获培养物25分钟，并在纯化前在-80°C下储存。

感兴趣蛋白的纯化
将细胞重悬在25男大号裂解缓冲液（所含0.06的Mg DNA酶，0.06 mg RNase，0.08 mg PMSF）并使用Biosafer 超声仪（15％振幅）在冰上裂解30分钟。以19,6 00 x g f 澄清细胞裂解液或在4 °C澄清40分钟并收集前体级分。
聚包准备柱1-1.5米大号（床体积）有限公司-NTA或Ni-NTA亲和柱，洗它十柱体积（CV）中的Milli-Q水，然后10个人简历洗涤液（通过重力流量）。
通过重力流将流加载到色谱柱上并收集流路;通过重力将流路加载到色谱柱上并收集二级流路; 通过重力将次级流路加载到色谱柱上并完成样品加载。
用50 CV 的洗涤缓冲液洗涤色谱柱。
用3 CV 的洗脱缓冲液在4°C下洗脱结合的蛋白质15分钟，此外，在4°C下使用带有Mono Q柱的AKTA用AKTA 对纯金属形式的氧化还原蛋白进行阴离子交换纯化。
通过SDS-PAGE 分析洗脱液和对照组的样品。
使用埃尔曼方法来确认电子学习产品的浓度，在这里10 MYU 大号蛋白孵育20 MYU 大号DTNB溶液中30分钟，在室温与解决方案合成随着10 MYU 大号洗脱缓冲液中，20 MYU 大号DTNB解决方案担任为了检测空白吸光度蛋白及DTNB反应溶液在412nm处（Ipushiron = 13700中中号-1 厘米-1 ）通过纳米d 罗普2000分光光度计。

盖玻片表面Preparatio官能Ñ
注意：功能化的盖玻片应立即使用，或在制备后于4°C下保存一个月。

在80°C的铬酸中浸泡30分钟，清洁并活化玻璃盖玻片，先用水，然后用乙醇冲洗盖玻片上的铬酸痕迹，再用氮气流干燥盖玻片。
将盖玻片在室温下浸入1％（v / v）APTES甲苯溶液中1小时，以使其氨基化，避免光照。
用甲苯和无水乙醇清洗盖玻片，并用氮气干燥盖玻片。
在80°C下烘烤盖玻片15分钟。
200添加MYU 大号磺基-SMCC（1毫克/米大号）之间的两个固定化盖玻片二甲基亚砜（DMSO）溶液压脚提升盖玻片在冷却至室温，并孵育1个小时避光在室温下。
清洗每一件COV来Erslips凭借15米大号d MSO 首先，然后用无水乙醇以去除残留的硫代-SMCC。使用流的氮干盖玻片小号。
将清洁的石英环粘在盖玻片的功能面上，以形成一个腔室。
200吸取 MYU 大号200 MyuM GL-ELP 50NM -C蛋白溶液涂布到官能盖玻片在腔室中并孵育约3 H.
用Milli-Q水清洗反应室，以除去未反应的GL-ELP 50nm -C。

功能化悬臂表面处理
注意：氮化硅悬臂用作力探针，悬臂的表面化学性质与盖玻片相似。

通过铬酸处理将悬臂在80°C的温度下浸泡10分钟，先用水先去除痕量铬酸，然后再去除乙醇，然后用滤纸吸干痕量乙醇。
清洁后悬臂功能化通过氨基- 硅烷化随着APTES和共轭然后悬臂要硫代-SMCC物的方法，提到在小号挠度d，官能盖玻片苏Rface准备。
所述沉浸官能悬臂用Cys-ELP 50NM -NGL在200的浓度 MyuM 的表面处理，将马来酰亚胺基团的Sulfo -SMCC 1.5 H.
用Milli-Q水洗涤盖玻片以去除未反应的Cys-ELP 50nm -NGL，并将悬臂存储在-20°C。
在AFM实验之前，浸入甲ELP- 官能d 悬臂在50 MyuM GL-CBM- XDOC 蛋白质溶液和200 NM OaAEP1 对于20-30分钟，在25° C，再洗去未反应的蛋白质15-20中号大号AMF缓冲区。

具有受控序列的逐步多蛋白制备
注：使用15-20中号大号。AFM缓冲洗去残留的蛋白质每个反应步骤图1后给出了示意图的控制顺序多聚准备。

单位COH混合TEV-L-POI-NGL（50 MyuM）和OaAEP1（200纳米），加入60 MYU 大号到Functionaliazed盖玻片，链接结扎股COH-TEV-L-POI-NGL到官能盖玻片。
100添加 MYU 大号TEV蛋白酶溶液劈裂的TEV网站蛋白质组约1小时，在25 ° C. 而GL - 泛-NGL，玻璃将产生暴露的N终端GL残留。
重复步骤F1-F2 （N-1 ）遍才能得到蛋白质-聚合物GL-（泛）ñ -NGL-玻璃后。OaAEP 结扎最后的结扎股，别拿TEV裂解反应，得到COH - Tev来- L-（Ub ）n -NGL玻璃。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902794--1332彭正802285 \图jpg \图1.jpg

1.原理图图显示了阶梯式结扎和裂解步骤以产生序列控制下的多聚在玻璃表面和探索Sun Yatsen随着一个XDOC -蛋白Maker- 改性悬臂

AFM测量
注：牛逼他AFM实验参数（Z轴长度，Z速度，设定，采样率和持续时间）是可调的在不同的实验。

1米添加升AFM缓冲器Containing10毫米氯化钙2 -to腔室（图2）。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902794--1332彭政802285 \图jpg \图2.jpg

图2.带有1 ml AFM缓冲溶液的AFM腔室的照片图像。黑圈显示了多蛋白的位置。

激光移动d提示的功能化镨OBE （图3），使用均分定理校准弹簧常数（卡帕）每个Cantilev中尔与溶液中的精确值在实验前。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902794--1332彭正802285 \图jpg \图3.jpg

图3. AFM实验中悬臂尖端的CCD图片。红色环位于D尖端的三角形。红色环指出了D尖端的激光辐射位置。

悬臂尖端连接到样品表面，并在此位置保持一会儿，以形成粘着蛋白/ 泊坞蛋白对，如图4，片段0和片段1所示。
以400 nm s -1 的恒定速度从表面收回悬臂，同时以4,096 Hz的采样率记录距离和悬臂挠度，如图4所示，第2段。
如图4的第3部分所示，将悬臂保持一会儿以放松粘着蛋白/ 泊坞蛋白对。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902794--1332彭正802285 \图jpg \图4.jpg

图4.关于AFM实验参数设置的对话框。一个AFM测量包含四个步骤。段0使悬臂向样品表面移动。段1使悬臂保持在段0达到的高度持续一段时间。段2撤回在此期间，表面上的悬臂和蛋白质展开。段3在持续时间内将悬臂保持在段2达到的高度。

资料分析

使用JPK数据处理选择力-延伸轨迹。
使用伊戈尔临6.12 （Wavemetrics ）分析的数据痕迹。只有与数据路径包含所有特定的轮廓长度公差属于指纹蛋白结构域[ GB1（H18 nm）与CBM（H58牛米）] 和一种高断裂力从Cohesin-坞因子解离满足要求（超过200-300 PN ）（图5 ）。拟合曲线由蠕虫状链（WLC的）型号聚合物弹性与持效期长的〜0.4纳米。
使用高斯模型拟合展开力的直方图来确定最可能的展开力（）和轮廓长度增量（< ∆ Lc >）的值。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902794--1332彭铮802285 \图jpg \图5.jpg

图5.序列控制的多蛋白Coh-Ub 4的典型力与距离的关系曲线，包含CBM展开，dockerin-cohesin 对破裂和Ub的四个拷贝的信号

菜谱

裂解缓冲液
50 mM Tris

150毫米氯化钠

pH值7.4

洗涤缓冲液
20 mM Tris

400毫米氯化钠

2 mM咪唑

pH值7.4

洗脱缓冲液
20 mM Tris

400毫米氯化钠

250 mM咪唑

pH值7.4

DTNB解决方案
0.5 mM 5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）

1毫米EDTA

720万尿素

TEV蛋白酶溶液
0.4 mg / ml的TEV蛋白酶

75毫米氯化钠

0.5毫米EDTA

25 mM Tris-HCl，pH 8.0

10％[v / v]甘油

AFM测量缓冲器
100 mM Tris

100毫米氯化钠

pH值7.4

铬酸
20克铬酸钾

M 40 大号超纯水

中号360 大号浓硫酸

M9 中号
0.4％葡萄糖

0.1 mM氯化钙2

2毫米MgSO 4

致谢

自然科学基金国民的中国（批准号：小号。21771103，21977047），自然科学基金江苏省（批准号：BK20160639）。该协议被修改从以前的工作“酶法生物合成和固定多蛋白验证在单分子水平（邓等人，2019）。

竞争利益

作者声明没有利益冲突。

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