材料和试剂

100 mm组织培养板（Corning，目录号：430167 ）
150 mm组织培养板（Corning，目录号：430599 ）
1.5 ml微管（Sarstedt，目录号：72.690.001 ）
15 ml离心管（Sarstedt ，目录号：62.547.205 ）
50 ml离心管（Sarstedt ，目录号：62.547.205 ）
聚丙烯圆底FACS管（Falcon，目录号：352063 ）
150毫升瓶顶部真空过滤器，0.45 微米的低蛋白结合（康宁，目录号：430625 ）
Amicon ultra-15离心过滤器单元（Merck Millipore，目录号：UFC903096 ）
野生型小鼠（C57BL / 6）或双重纯合的Clec9a Cre / Cre Rosa tdTomato / tdTomato （Clec9a-tdT）小鼠（Rosa 等，2018）
人胚肾（HEK）293T细胞系（ATCC，目录号：CRL-3216 ）
40 µm无菌细胞过滤器（Corning，目录号：431750 ）
猪皮肤A型明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890 ）
聚乙烯绝缘体升亚胺（PEI）转染试剂（Sigma-Aldrich公司，目录号：408727 ）
海美溴铵（聚凝胺）（Sigma-Aldrich公司，目录号：H9268 ）
盐酸强力霉素（DOX）（Sigma-Aldrich，目录号：D9891 ）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200-056 ）
TrypLE Express（1x）无酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：12604-021 ）
HyClone 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）（GE Healthcare，目录号：SH30256.01 ）
HyClone 高葡萄糖Dulbecco改良的Eagles培养基（DMEM）（GE Healthcare，目录号：SH30243.01 ）
Opti -MEM还原血清培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070 ）
HyClone公司万U /米升青霉素万微克/米升链霉素溶液（笔/ 链霉素）（GE Healthcare公司，目录号：SV30010 ）
HyClone 胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，目录号：SV30160.03 ）
大鼠血清（GeneTex ，目录号：GTX73226 ）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418 ）
质粒pMD2.G（Addgene ，目录号：12259 ）
质粒psPAX2（Addgene ，目录号：12260 ）
质粒FUW-M2rtTA（Addgene ，目录号：20342 ）
包含编码PU.1，IRF8和BATF3（PIB）重编程因子的三顺反子盒的质粒pFUW - TetO -PIB （Rosa 等，2018）。瑞典隆德大学分子医学与基因治疗学系造血与免疫实验室的细胞重编程。
4'，6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542 ）
Hoechst染色液（Sigma-Aldrich，目录号：H6024 ）
APC共轭抗小鼠CD45单克隆抗体（Biolegend ，目录号：103112 ）
PE-Cy7共轭抗小鼠MHC-II单克隆抗体（Biolegend ，目录号：107630 ）
DMEM完全培养基（请参阅食谱）
解离解决方案（请参阅食谱）
0.1％明胶溶液（请参阅食谱）
洗涤液（请参阅食谱）
染色溶液（请参阅食谱）
冻结解决方案（请参阅食谱）

设备

无菌解剖剪刀（Sigma-Aldrich，目录号：S3146 ）
无菌不锈钢钳（Sigma-Aldrich，目录号：Z168777 ）
冷冻容器Nalgene Frosty先生（Sigma-Aldrich，目录号：C1562 ）
血细胞计数器细胞计数室（Marienfeld Superior，目录号：13444890 ）
4-16K冷冻离心机（Sigma ）
FACSCanto II流式细胞仪分析仪（8色，蓝色/红色/紫色）（BD Biosciences ）
BD FACSAria III细胞分选仪（BD Biosciences ）
Heracell 150i CO 2 培养箱（Thermo Scientific ）
ScanLaf Mars 2级层流罩（LaboGene ）
IX70倒置组织培养显微镜（奥林巴斯）
Celldiscoverer 7倒置显微镜（Zeiss ）

软件

1. GraphPad PRISM 6，https：//www.graphpad.com/

2. FlowJo V10，https： //www.flowjo.com/

3. ZEN 3.1（蓝色版本），https：//www.zeiss.com/

4. Adobe Photoshop CS6，https： //www.adobe.com/cn

程序

本文所述的直接重编程协议的示意图可在图1中找到。

图1.将小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为树突状细胞的方案示意图。从C57BL / 6野生型13.5天大的胚胎中分离出小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。胚胎解剖，以除去所述头部（灰色），肝脏和心脏（红色）和离解为单个- 细胞悬浮液。将MEF铺板并使其生长至汇合（第0代，P0）。将细胞解离并通过荧光激活细胞分选术（FACS）进行纯化，以去除造血细胞（CD45 + 或MHC-II + ），并扩增至3到4代。如果使用了报道基因，如双重纯合子Clec9a Cre / Cre Rosa tdTomato / tdTomato 和tdTomato + 细胞也被移除。250000分的MEF每100mm明胶包被铺板的Petri 培养皿，并用慢病毒颗粒的编码转导的PU.1两次，IRF8和BATF3（PIB）重编程因子（FUW- TETO -PIB），和M2rtTA（FUW-M2rtTA）。将强力霉素（DOX）添加到培养基中（第0 天，d0）以诱导PU.1，IRF8和BATF3的表达，并在重编程第5 天（d5），第7天（d7），第8天（d8）进行流式细胞术重编程）和9（d9）。射诱导的树突状细胞（iDC中）可以通过FACS进行纯化，并通过mRNA的测序（mRNA- SEQ ），逆转录酶定量实时- 时间PCR（RT-qPCR的），免疫荧光，扫描电子显微镜（SEM）和在重编程功能测定第9天

小鼠胚胎成纤维细胞的分离
注意：MEF可以从Sigma和ScienCell 等供应商处购买。在这种情况下，解冻并扩增成纤维细胞，纯化（步骤A26），并将其用于重编程实验中，直到第3代（P3）或P4。备选地，可以如以下方案中所述从怀孕小鼠中分离MEF 。

为野生型（C57BL / 6）或双重纯合子Clec9a Cre / Cre Rosa tdTomato / tdTomato （Clec9a-tdT）小鼠设置定时交配（Rosa 等，2018）。
注意：如果使用从Clec9a-tdT报告基因小鼠中分离的细胞，则tdTomato 表达的激活将有助于在重编程过程中追踪DC命运。

在第二天早晨，检查阴道塞。如果检测到这些，将隔离的雌性个体隔离在单独的笼子中，并将该时间点视为胚胎日（E）0.5。
注意：插头可能很难检测到。作为替代方案，每周交配一次，让两名雌性和一名雄性过夜，然后第二天将其移出。

在隔离MEF之前，请在E13.5处检查隔离的雌性插头，以确认怀孕。
通过吸入CO 2 牺牲孕妇，然后进行颈脱位。
用70％的乙醇消毒孕妇的腹部。用无菌剪刀和镊子解剖腹腔，用双手拉皮肤揭露腹壁。
用新的剪刀和镊子切开腹膜，露出包含胚囊的子宫角。隔离用剪刀子宫并将其转移到用30毫升冰的50毫升离心管中- Ç 老PBS。
注意：子宫可在冰上放置数小时，但应使用补充有10％FBS的PBS。

在细胞培养罩内，用无菌冰冷的PBS清洗子宫两次，然后将其转移至装有5 ml无菌冰冷的PBS的100 mm皿中。
注意：通常，每位怀孕的女性可回收6-8个胚胎。

用无菌剪刀和镊子在子宫角上切开一个切口，以隔离携带胚胎的囊。
注意：请勿进行深切，以免刺破胚胎。

使用镊子，从胎盘中分离出胚胎，并轻轻切开每个单独的囊。
将分离的胚胎转移到一个新的100 mm培养皿中，该培养皿中含有5 ml的冷PBS，并在完成剩余解剖的同时置于冰上。
用镊子取出胚胎头。如果需要，该组织可用于胚胎基因分型。
定位红-下方钳子颜色内脏器官（胎肝和心脏）和为了避免MEF培养物与造血细胞的广泛污染除去它们。
将解剖的胚胎转移到没有PBS的新的100毫米培养皿中。用剪刀将剩余的胚胎组织切成小块。每个胚胎添加1.5 ml解离溶液（请参阅“ 食谱” ），并将组织转移至50 ml锥形管中。每个胚胎用另外的1.5 ml解离溶液冲洗平板，并在37孵育 °C 20分钟。
每个胚胎添加额外的3 ml解离溶液，上下吸管以帮助组织解离，并在37 °C 下再孵育20分钟。
每个胚胎添加6 ml DMEM完全培养基以使胰蛋白酶失活，并上下吸移几次以帮助组织解离。
孵育在室温下（20 5分钟- 25 ℃下）不搅拌以存款细胞碎片。通过40μm 无菌细胞过滤器将上清液过滤到新的50 ml锥形管中。
以350 x g 离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜完全培养基中。
计数细胞数并将细胞浓度调整为每毫升DMEM完全培养基10 6个细胞。
注意：每个胚胎平均可获得10 7个细胞。或者，可以跳过细胞计数步骤，每100毫米培养皿接种一个当量的胚胎细胞。

用5 ml的0.1％明胶溶液预涂100 mm的组织培养皿，并在37 °C 下孵育15分钟。
吸出明胶溶液，将10 ml细胞悬液（每培养皿10 7个细胞，或一个胚胎当量）转移至预涂的100 mm组织培养皿中，并在37 °C 和5％CO 2 下孵育24小时。
第二天，更换培养基以除去漂浮细胞，并在倒置的组织培养显微镜下检查细胞密度。
注意：由于胰蛋白酶的消化，预计会导致一些细胞死亡，但平板应至少融合60-70 ％。如果回收的细胞较少，请考虑将解离孵育时间缩短至15分钟。此时，MEF的尺寸很小，每个培养皿可铺10 7个细胞。后的通道，将MEF将增加的大小和变得平坦，并应每皿被镀覆的细胞的数量减少。

当细胞汇合时（考虑该传代0或P0），除去培养基，用PBS洗涤一次，并通过在37 °C 和5％CO 2中孵育5至10分钟，与每板3 ml TrypLE Express 分离。细胞分离后，添加7 ml DMEM完全培养基，并通过上下移液几次重悬细胞。将细胞悬浮液转移到15 ml的标准管中。
注意：此时可以在冷冻溶液中冷冻MEF P0。据推荐，以悬浮每毫升冷冻溶液的MEF中的1个汇合的平板。1ml细胞悬浮液应转移到一个离心管在-80和冷冻过夜℃下使用雾先生冷冻容器。对于长期储存，冷冻管应转移至-150 ℃的超低冰箱或液氮。

使用血细胞计数器计数细胞并以350 x g 离心5分钟。
弃去上清液，将细胞沉淀重悬于每10 6个细胞100μl 的染色溶液中（请参见食谱），并在4 °C 下孵育30分钟。
在10 ml冰冷的洗涤缓冲液中洗涤细胞，并以350 x g 离心5分钟。
丢弃的上清液和重悬的细胞沉淀在300 微升每10个洗涤缓冲液6 细胞。
纯化CD45 - MHC-II - MEF，或者在使用报告子（例如Clec9a-tdT MEF）的情况下，也通过荧光激活细胞分选（FACS）去除罕见的造血细胞，排除tdTomato + 细胞。
注意：在FACS纯化，我们建议使用100微米喷嘴和在涂布有500聚丙烯圆底FACS管收集纯化的MEF 微升FBS的补充有笔/ 链霉素稀释1：100。通常情况下，污染的造血细胞在纯化前仅占不到1％的MEF（Rosa等人，2018），但在重编程实验期间可能是混杂的种群。FACS分选后的MEF人口应> 99％CD45 - MHC-II - 。

FACS纯化后，将纯化的MEF转移至含有10 ml DMEM完全培养基的50 ml标准管中，并以350 x g 离心5分钟。
丢弃的上清液和重悬的细胞在新鲜的完全培养基沉淀。计数细胞数并将细胞浓度调整为每毫升DMEM完全培养基10 6个细胞。
将细胞悬浮液转移至装有9 ml DMEM完全培养基（每个培养皿10 6个细胞，最终体积10 ml）的明胶预包被的100 mm组织培养皿中，并在5％CO 2 于37 °C 孵育24小时。将此视为第一段。
第二天，更换培养基以去除漂浮的死细胞并检查细胞密度。
注意：通常，此步骤可达到50-60％的细胞融合度。

汇合后，将细胞以1：4的比例稀释至新的明胶预涂100毫米组织培养皿中。考虑该通道2。对于重新编程实验，请使用3-4通道中的MEF，以避免细胞衰老。
如果需要，可以从融合板上冷冻纯化的MEF。每个融合板在1 ml冷冻溶液中准备1小瓶（如步骤A22中所述）。

慢病毒生产
注意：在专门的层流通风橱中在生物安全性2级实验室中进行慢病毒生产，并将所有被病毒污染的废物（管子，尖端，板）放在适当的生物危害材料残留容器中。

用20 ml DMEM完全培养基在150 mm平板中扩增HEK 293T细胞。当汇合时，除去该介质，用PBS，并用6ml的解离洗一次的TrypLE 快车通过在37温育℃下用5％CO 2 为5至10分钟。
注意：HEK 293T细胞为半贴壁细胞，因此需要缓慢除去培养基并用PBS洗涤，以避免细胞脱离。

加入6 ml DMEM完全培养基，并通过上下移液几次重悬细胞。将细胞转移到50 ml标准管中，并以350 x g 离心5分钟。转染前48小时，以1：6的稀释度去除上清液并将细胞分裂至新的150 mm组织培养皿中。
在15ml管中，加入10 微克的pFUW - TETO -PIB（可诱导慢病毒构建与三顺反子盒编码PU.1，IRF8和BATF3重编程因子）或FUW-M2rtTA，对于被转染以150毫米的菜。到两个管添加7.5 微克包装psPAX2和2.5 微克信封pMD2.G质粒。通过添加Opti -MEM 将最终体积调节至2 ml 。加入60 微升的聚乙烯绝缘体升亚胺（PEI）转染试剂（1毫克/毫升），涡旋并彻底在室温下30分钟温育转染混合物，以允许所述DNA-脂质复合物的形成。
注意：慢病毒转移质粒pFUW- TetO在强力霉素反应性启动子的控制下驱动PU.1，IRF8和BATF3的表达。FUW-M2rtTA慢病毒质粒在组成型活性人泛素C启动子的控制下驱动逆四环素反式激活因子M2rtTA的表达。在该系统中，当两种载体在强力霉素存在下共表达时，M2rtTA蛋白将强力霉素桥接至强力霉素诱导型启动子，从而诱导PU.1，IRF8和BATF3的表达。推荐将诱导型系统用于DC重编程实验，因为它可以定时诱导转基因表达。

将不含FBS和Pen / Strep的10 ml DMEM更换为HEK 293T细胞培养基。将转染混合物滴加到细胞中，并在37 °C 和5％CO 2中孵育6小时。
用20 ml DMEM完全培养基替换转染的HEK 293T细胞的培养基，并将细胞在37 °C 和5％CO 2 下孵育24小时。
第二天，用12 ml新鲜的DMEM完全培养基替换HEK 293T细胞培养基，并在5％CO 2 下于37 °C 孵育细胞。
转染到50 ml 聚丙烯管中后36 h，48 h和60 h收获病毒上清液，将病毒上清液保存在4 °C，并在收获之间用12 ml新鲜DMEM完全培养基代替培养基。
注意：每150毫米平板总共可收获36毫升病毒上清液。病毒颗粒在37 °C下不稳定，但在4 °C下可持续1-2周。通过在三个时间点收获，病毒滴度达到最大。

通过含有病毒颗粒过滤器收获上清液150毫升瓶顶0.45 微米的低蛋白结合过滤器PES系统。
注：低蛋白结合过滤器应被用于最小化的病毒颗粒通过过滤器损失吸附。

吸取12 ml过滤的病毒上清液到Amicon ultra-15离心过滤器中，在4 °C下以2,000 x g 离心30分钟，并丢弃流通液。
添加额外12毫升过滤病毒上清液，以在过滤器单元中的浓缩的病毒量，混合管的内容和离心机中以2000 X 克在4 ℃下进行的30分钟。丢弃流通物。
将剩余的过滤后的病毒上清液添加到留在过滤器中的浓缩病毒溶液中，通过颠倒试管来混合内容物，并在4 x 2,000 x g 下再次离心20至40分钟。最后一次离心时间应被调整以获得600-800 微升的所述的在过滤浓缩的病毒总体积。
注意：如果最终体积大于800 微升，在2再次混合所述浓缩物和离心机，在4 000×g离心℃下进行一个附加的10至20分钟。

在制备等分试样的微管在冰（50-200 微升取决于未来重新编程实验大小）每种类型的浓缩慢病毒和商店中的在-80 ℃下长期储存（1-2岁）或在4 ℃下进行短期储存（1-2周）。浓缩或非浓缩慢病毒也可以新鲜使用。
注意：在-80 °C 冷冻浓缩的病毒一次可导致病毒滴度降低约10-20％。不要反复冷冻和融化，因为这样会降低滴度。

树突状细胞重编程
每块板用5 ml 0.1％明胶溶液预涂100 mm组织培养皿，并在5％CO 2 下于37 °C 孵育至少15分钟。
在37 °C下解冻MEF小瓶。细胞溶液解冻后，将细胞滴加到10 ml在37 °C 预热的DMEM完全培养基中，小心混合。
以350 xg离心5分钟。吸去上清液和重悬的细胞沉淀在10ml每小瓶DMEM完全培养基中。
吸取预先孵育的100 mm平板的明胶溶液。每个预先涂明胶的100 mm组织培养皿分配10 ml MEF悬浮液，并在5％CO 2 下于37°C 孵育过夜。如果需要，扩增成纤维细胞以增加起始细胞数，直到达到传代3-4。
注意：通常，可以从汇合的100 mm平板上回收2至5 x 10 6个MEF，具体取决于通过次数。

要开始DC重新编程实验，在10 ml DMEM完全培养基中，将每个明胶预涂100 mm平板接种250,000个MEF，并在5％CO 2 下于37°C 孵育过夜。
注意：根据所需的iDC 数量或实验目的，可通过从大量100 mm平板开始（例如，纯化50至100个平板以纯化iDC 以进行功能测定）来扩大重编程方案，或缩小至6孔板（即，测试的不同培养条件在DC重编程效率的影响），调整细胞数和根据病毒体积的表面积。

在接下来的一天的下午，通过用10ml DMEM完全培养基中补充有更换介质执行第一慢病毒转导的聚凝胺（8 微克/毫升）和30至60 微升FUW-的1混合：1的TETO -PIB和FUW-M2rtTA浓缩慢病毒。在5％CO 2 和37°C下孵育过夜。
注意：对于DC重编程实验，建议定义慢病毒混合物的最佳体积，以进行有效的重编程而不损害细胞活力（图2 ）。取决于实验的目的，这对于最大化协议末尾获得的重编程细胞的数量可能很重要。具有较高通过次数的MEF可能需要更多数量的病毒。

图2.优化慢病毒混合物体积以有效地进行树突状细胞直接重编程。CLEC9A-TDT 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）与转分别增加体积（30〜60 微升编码PU.1，IRF8和BATF3（PIB）转录因子（FUW-浓缩合并的慢病毒颗粒的）TETO 与M2rtTA -PIB），一起（ FUW-M2rtTA），比例为1：1。重编程的细胞以进行分析d AY 通过流式细胞术9以限定转导树突细胞重编程的最佳的体积。tdTomato + 细胞的百分比（A）表示重新编程效率，DAPI阴性细胞的百分比（B）表示细胞活力。未转导的Clec9a-tdT MEF用作阴性对照。在该例子中，45 微升合并病毒颗粒的诱导而不会损害细胞活力的最大重编程效率。

孵育16小时后，用新鲜的DMEM完全培养基替换培养基。在5％CO 2 下于37°C孵育6-8小时，以使细胞恢复。
如步骤C6 所述进行第二次慢病毒转导。在5％CO 2 和37°C下孵育过夜。
注意：转导混合物（DMEM完全与FUW- TETO -PIB，FUW-M2rtTA和聚凝胺）可以用于转导二者来制备，并保持在4℃。

孵育16小时后，用新鲜的DMEM完全培养基补充DOX（1μg / ml）替换培养基。
注意：FUW - TetO -PIB和FUW-M2rtTA是DOX诱导的慢病毒系统。因此，添加补充有DOX的DMEM完全培养基将启动PIB重编程因子的表达。将其视为第0 天的重新编程。

在DC重编程培养期间（9天），每2-3天用补充有DOX的DMEM完全培养基替换培养基。
注意：建议在倒置显微镜下进行重编程期间遵循细胞培养。重新编程相关的细胞死亡，预计在DOX补充后的第一天，这取决于小号在MEF通道，并用于病毒体积。由于未转导的和未重编程的MEF 的增殖，细胞在重编程的后期将逐渐变得更加融合。当使用Clec9a-tdT MEF时，在添加DOX约30小时后开始检测到tdTomato +细胞（Rosa等人，2018）。在重新编程的整个过程中，iDC 始终保持不变。

所述Ë 的合并的iDC DC重新编程期间可在不同的时间点进行分析。为了这个目的，除去了介质，用PBS洗一次，并解离用3ml 的TrypLE 每板快速通过在37温育C° 与5％CO 2 为5至10分钟。
细胞分离后，添加7 ml DMEM完全培养基，并通过上下移液几次重悬细胞。将细胞悬浮液转移到15 ml的标准管中，并以350 x g的速度离心5分钟。
弃去上清液，并在200μl 洗涤缓冲液中重悬1板当量细胞沉淀，以通过流式细胞仪或FACS进行下游分析，以便进行显微镜检查，mRNA测序或RT-qPCR分析。

数据分析

可以在第0 天和第9 天之间的不同时间点评估DC重新编程（图1）。所述Ë CD45的合并+ MHC-II + 表示的iDC 重编程效率，并且可以通过流式细胞术在重新编程来检测日0，5，7，8和9（图3A-3B）。如果使用记者如CLEC9A-TDT，所述的出现tdTomato + MHC-II + 的iDC 可以在同一时间点（图3C）之后通过流式细胞术。在第0 天未在转导的MEF中或在第9 天在M2rtTA转导的MEF中检测到CD45，MHC-II或tdTomato （图3B-3C）。在日9，将iDC 可以通过显微术（图进行分析小号3D-3E ）。对于更详细的形态分析，可以通过FACS纯化tdTomato + 细胞，并通过扫描电子显微镜（SEM）进行分析（图3F）。

图3. 通过直接重编程小鼠胚胎成纤维细胞产生的诱导树突状细胞的流式细胞仪和显微镜分析。A.门控策略进行分析的诱导的树突状细胞（出苗的iDC 重新编程期间）通过流式细胞术。使用FSC和SSC选择种群，然后排除双峰和死细胞（DAPI + ）。B. 该Ë CD45的合并+ MHC-II + 的iDC 用流式细胞仪5天（D5），7天（D7），8定量天（D8）和9天（D9）PU.1，IRF8和诱导后野生型（C57BL / 6）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的BATF3（PIB）。包括在第0天的转导MEF和在第9 天的M2rtTA转导的MEF 作为对照。CD45 + MHC-II + 的门控策略是基于单执行- 细胞染色为CD45和MHC-II在野生型MEF中PIB的诱导后9天。C. 在Clec9a-tdT MEF中诱导M2rtTA和PIB后，在d5，d7，d8和d9 时tdTomato + MHC-II + 细胞的流式细胞术分析。包括在第0天的转导MEF和在第9 天的M2rtTA转导的MEF 作为对照。D. tdTomato 和Hoechst的免疫荧光（蓝色）突出了tdTomato + 细胞的出现和频率。在第9 天将M2rtTA转导的MEF 包括在内作为对照。比例尺= 500 微米。E.诱导M2rtTA或M2rtTA和PIB后9天的C57BL / 6MEF的明场显微照片。比例尺= 100μm 。F. 在Clec9a-tdT MEF中引入M2rtTA和PIB 后9天，对tdTomato + 细胞进行扫描电子显微镜分析。在第9 天将M2rtTA转导的MEF 包括在内作为对照。比例尺= 10μm 。

此外，可以在重编程第9 天（iDC 第9 天）和脾MHC-II + CD11c + CD8a + cDC1s进行纯化的tdTomato + CD45 + MHC-II + iDC的mRNA测序，以进一步验证成功的重编程（Rosa 等， 2018）。在iDC 第9天和cDC1s 中检测到编码重编程因子的基因（Spi1 [ 编码PU.1 ] ，Irf8 和Batf3 ）的高表达水平（图4A）。成纤维细胞特异性基因Actg2 和Col9a2 在iDC 第9 天被下调，而在cDC1中不表达（图4B）。在MEF中未检测到DC基因Xcr1 ，Clec9a ，Cd207 ，Naaa ，Ucp2 ，Ifi205 ，Cd74 ，Ciita ，H2-aa 和H2-dmb1的表达，在第9 天的iDC中被激活并在脾脏cDC1中表达（图4C）。这套标记可用于通过mRNA测序或RT-qPCR评估成功的重编程。可以在FACS纯化后对iDC 进行进一步的功能评估，包括：炎性细胞因子的分泌，死细胞吞噬，抗原输出到胞质溶胶和抗原交叉呈递到OT-1 CD8 + T细胞（Rosa 等，2018）。

图4. 评估成功的树突状细胞重编程的基因标记。编码重编程因子PU.1 A.基因，IRF8和BATF3（PIB）在诱导的树突状细胞（表达的iDC 在重新编程）日9（tdTomato + CD45 + MHC-II + ），并在常规树突细胞1型（cDC1s， MHC-II + CD11c + CD8a + ）。B.成纤维细胞相关基因Actg2 和Col9a2 在重新编程的第9 天在iDC 中被下调，而在cDC1中不表达。C.树突状细胞基因Xcr1 ，Clec9a ，Cd207 ，Naaa ，Ucp2 ，Ifi205 ，CD74 ，Ciita ，H2-aa 和H2-dmb1 在重编程第9 天的iDC 和cDC1 中表达。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中诱导PIB后，将iDC （tdTomato + CD45 + MHC-II + ）和脾cDC1s（CD11c + MHC-II + CD8α + ）进行FACS分选，并通过mRNA测序定量基因的表达（Rosa 等人，2018 ; GSE103618）。基因表达在条形图中显示为基因计数的平均值± 标准偏差。作为替代，RT-qPCR可用于量化该基因集的表达并评估成功的重编程。

菜谱

DMEM完全培养基
DMEM补充有10％（v / v）热灭活的FBS和10,000 U / m l 青霉素，10,000μg / m l 链霉素储备溶液的1：100稀释液

解离溶液
在相同体积的PBS中稀释0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液（稀释度为1：2），最终浓度为0.125％胰蛋白酶-EDTA

0.1％明胶溶液
将0.1g明胶的在100毫升的MilliQ -grade水和高压釜

洗涤液
PBS补充2.5％FBS

染色液
洗涤溶液补充有大鼠血清（1/100），抗小鼠CD45单克隆抗体（每100 0.25微克微升）和抗小鼠MHC-II单克隆抗体（每100 0.25微克微升）

冷冻液
热灭活的FBS辅以10％DMSO

致谢

该项目由Cancerfonden （CAN 2017/745），瑞典研究委员会（2018-02042），Crafoord Foundation（20190561），NovoNordisk Fonden （0056527）和FCT（CENTRO-01-0145-FEDER-030013）共同资助。Knut和Alice Wallenberg基金会，隆德大学的医学系和斯科讷地区得到了慷慨的财政支持。FFR和CFP和FFR分别由FCT博士（SFRH / BD / 130845/2017）和博士后（SFRH / BPD / 121445/2016）奖学金提供支持。该协议改编自Rosa 等。，2018。

利益争夺

FábioF . Rosa，Cristiana F.Pires 和Carlos-Filipe Pereira已于2018-04-05提交了一项专利合作条约（PCT），以保护此处所述的知识产权。

伦理

该协议是根据隆德大学研究伦理委员会的指导方针执行的，应根据个人机构指导方针进行。涉及动物实验的程序已获得瑞典伦理审查委员会（5.8.18-19343 / 2017）的批准。

参考文献

Balan ，S.，Arnold- Schrauf ，C.，Abbas，A.，Couespel ，N.，Savoret ，J.，Imperatore ，F.，Villani，AC，Vu Manh ，TP，Bhardwaj，N.和Dalod ，M. （2018）。大规模人类树突状细胞分化揭示缺口依赖谱系分支和异质性。Cell Rep 24（7）：1902-1915 e1906。
Balan ，S.，Ollion ，V.，Colletti ，N.，Chelbi ，R. ，Montanana - Sanchis ，F.，Liu，H.，Vu Manh ，TP，Sanchez，C.，Savoret ，J.，Perrot，I 。，Doffin ，AC，Fossum ，E.，Bechlian ，D.，Chabannon ，C.，Bogen ，B.，Asselin-Paturel ，C.，Shaw，M.，Soos ，T.，Caux ，C.，Valladeau- Guilemond ，J.和Dalod ，M.（2014年）。与单核细胞衍生的树突状细胞相反，体外源自CD34 + 祖细胞的人XCR1 + 树突状细胞非常类似于血液树突状细胞，包括其佐剂反应性。Ĵ 免疫学193（4）：1622至1635年。
Bottcher ，JP和Reis，ESC（2018）。1型常规树突状细胞在癌症免疫中的作用。癌症趋势4（11）：784-792。
Carotta ，S.，Dakic ，A.，达米科，A.，庞，SH，基利，KT，纳特，SL和Wu，L.（2010）。Ť 他转录因子PU.1控制树突状细胞的发育和Flt3的细胞因子受体的表达以剂量依赖性的方式。免疫力32（5）：628-641。
Choi，KD，Vodyanik ，MA和Slukvin ，II（2009）。通过多能干细胞衍生的lin - CD34 + CD43 + CD45 + 祖细胞的扩增和分化产生成熟的人类粒单核细胞。J 临床投资119（9）：2818-2829。
Hildner ，K.，Edelson ，BT，Purtha ，WE，Diamond，M.，Matsushita，H.，Kohyama ，M.，Calderon，B.，Schraml ，BU，Unanue ，ER，Diamond，MS，Schreiber，RD，Murphy ，TL和Murphy，KM（2008）。Batf3不足揭示了CD8关键作用α + 细胞毒性T细胞免疫的树突细胞。科学322（5904）：1097-1100。
霍顿，C.，戴维斯，TJ，Lahiri ，P.，Sachamitr ，P.和Fairchild，PJ（2019）。从原代树突状细胞重编程的iPS 细胞为免疫疗法提供了丰富的免疫刺激性树突状细胞来源。干细胞38（1）：67-79 。
Inaba ，K.，Inaba ，M.，Romani，N.，Aya ，H.，Deguchi ，M.，Ikehara ，S.，Muramatsu ，S。和Steinman，RM（1992）。补充有粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子的小鼠骨髓培养物中产生大量树突状细胞。J Exp Med 176（6）：1693-1702。
Kirkling ，ME，Cytlak ，U.，Lau，CM，Lewis，KL，Resteu ，A.，Khodadadi-Jamayran ，A.，Siebel，CW，Salmon，H.，Merad ，M.，Tsirigos ，A.，Collin， M.，Bigley ，V.和Reizis ，B.（2018）。Notch信号传导促进交叉表达经典树突状细胞的体外生成。Cell Rep 23（12）：3658-3672 e3656。
李，J.，布雷顿，G.，Oliveira的，TY，周，YJ，Aljoufi ，A.，Puhr ，S.，卡梅伦，MJ，Sekaly ，RP，Nussenzweig ，MC和Liu，K。（2015）。人脐带血和骨髓中受限制的树突状细胞和单核细胞祖细胞。J Exp Med 212（3）：385-399。
Lu，L.，McCarslin ，D.，Starzl ，TE和Thomson，AW（1995）。骨髓来源的树突状细胞前体细胞（NLDC 145 + ，MHC II类+ ，B7-1 暗淡，B7-2 - ）诱导鼠T淋巴细胞同种异体抗原特异性低反应性。移植60（12）：1539-1545。
卢兹（MB），北库库奇（Kukutsch），阿拉巴马州奥吉维（Ogilvie），北卡罗来纳（Rossner），科赫（Koch），北罗曼尼（Romani）和舒勒（G）（1999）。一种从小鼠骨髓中产生大量高纯度树突状细胞的先进培养方法。Ĵ 免疫学方法223（1）：77-92。
Mayer，CT，Ghorbani ，P.，Nandan ，A.，Dudek ，M.，Arnold- Schrauf ，C.，Hesse，C.，Berod ，L.，Stuve ，P.，Puttur ，F.，Merad ，M.和Sparwasser ，T.（2014年）。从小鼠骨髓中选择性高效产生功能性Batf3依赖性CD103 + 树突状细胞。血液124（20）：3081-3091。
Merad ，M.，萨特，P.，Helft ，J.，米勒，J。和Mortha ，A.（2013）。树突状细胞谱系：处于稳态和发炎状态的树突状细胞及其亚群的发育，功能。免疫学年报（Annu Rev Immunol）31：563-604。
Naik ，SH，Proietto ，AI，Wilson，NS，Dakic ，A.，Schnorrer ，P.，Fuchsberger，M.，Lahoud ，MH，O'Keeffe，M。，邵，QX，Chen，WF，Villadangos ，JA，Shortman ，K. and Wu，L.（2005）。切削刃：代脾CD8的+ 和CD8 - 树突状细胞当量中Fms样酪氨酸激酶3个配体的骨髓培养物。Ĵ 免疫学174（11）：6592-6597。
佩雷拉，CF，长安，B.，邱，J.，牛，X.，Papatsenko ，D.，亨德利，CE，克拉克，NR，Nomura- 北林，A.，Kovacic ，JC，Ma'ayan ，A.，Schaniel ，C.，Lemischka ，IR和Moore，K.（2013）。在小鼠成纤维细胞中诱导造血程序。细胞干细胞13（2）：205-218。
Pereira，CF，Lemischka ，IR和Moore，K.（2012）。重编程细胞命运：组合方法的见解。Ann NY Acad Sci 1266：7-17。
Perez，CR和De Palma，M.（2019）。工程树突状细胞疫苗，以改善癌症的免疫疗法。Nat Commun 10（1）：5408。
皮雷（CF），罗莎（Rosa），法郎，库鲁奇金（I.）和佩雷拉（CF）（2019）。通过细胞重编程了解和调节免疫力。免疫学前沿10（2809）。
波林，LF，Salio ，M.，Griessinger ，E.，安霍斯-丰索，F.，Craciun ，L.，陈，JL，凯勒，AM，霞飞路，O.，Zelenay ，S.，奈，E.，乐Moine ，A.，Faure，F.，Donckier ，V.，Sancho，D.，Cerundolo ，V.，Bonnet，D.和Reis e Sousa，C.（2010）。人类DNGR-1的表征+ BDCA3 + 白细胞小鼠CD8的推定当量α + 树突细胞。Ĵ 精通医学207（6）：1261至1271年。
Proietto ，AI，Mittag ，D.，Roberts，AW，Sprigg ，N.和Wu，L.（2012）。人血和脾树突状细胞亚型的等价物可以在存在fms样酪氨酸激酶3配体和血小板生成素的情况下，从人CD34 + 干细胞体外产生。细胞分子免疫9（6）：446-454。
罗莎（Rosa），法郎（Pires），弗洛里斯（CF），库洛奇金（K. Reis e Sousa，C.和Pereira，CF （2018）。将成纤维细胞直接重编程为呈递抗原的树突状细胞。Sci Immunol 3（30）。
Schiavoni ，G.，Mattei ，F.，Sestili ，P.，Borghi ，P.，Venditti ，M.，Morse，HC，3rd，Belardelli ，F.和Gabriele，L.（2002）。ICSBP对于小鼠I型干扰素产生细胞的发展以及CD8α + 树突状细胞的产生和激活至关重要。J Exp Med 196（11）：1415-1425。
Senju ，S.，Haruta ，M.，Matsumura，K.，Matsunaga，Y.，Fukushima，S.，Ikeda，T.，Takamatsu，K.，Irie ，A. and Nishimura，Y.（2011）。从人诱导的多能干细胞产生树突状细胞和巨噬细胞，旨在进行细胞治疗。基因治疗18（9）：874-883。
Senju ，S.，Haruta ，M.，Y. Matsunaga，Y.，Fukushima，S.，Ikeda，T.，Takahashi，K.，Okita ，K.，Yamanaka，S.和Nishimura，Y.（2009）。从小鼠诱导的多能干细胞定向分化产生的树突状细胞和巨噬细胞的表征。干细胞27（5）：1021-1031。
Son，YI，Egawa，S.，Tatsumi，T.，Redlinger，RE，Jr.，Kalinski，P.和Kanto，T.（2002）。一种从小鼠骨髓细胞生成成熟树突状细胞的新型批量培养方法。Ĵ 免疫学方法262（1-2）：145-157。
Takahashi，K.，Tanabe，K.，Ohnuki ，M.，Narita，M.，Ichisaka ，T.，Tomoda ，K.和Yamanaka，S.（2007）。通过确定的因素诱导来自成年人类成纤维细胞的多能干细胞。细胞131（5）：861-872。
Takahashi，K.和Yamanaka，S.（2006年）。通过确定的因子诱导小鼠胚胎和成年成纤维细胞培养物的多能干细胞。细胞126（4）：663-676。
Wculek ，SK，Cueto ，FJ，Mujal ，AM，Melero ，I.，Krummel ，MF和Sancho，D.（2019）。树突状细胞在癌症的免疫学和免疫治疗中。Nat Rev Immunol 。
Xu J.，Du Y，and Deng，H.（2015年）。直接沿袭重编程：策略，机制和应用。细胞干细胞16（2）：119-134。
Yona ，S.和Mildner ，A.（2018年）。好事成全。Sci Immunol 3（30）。