材料和试剂

移液器技巧
封口膜
1层Kimwipes 精致任务刮水器（Kimberly-Clark Professional，货号：06-666）
150毫米TC处理过的细胞培养皿（Corning，Falcon，目录号：353025）
24孔TC处理的微孔板（Corning，Falcon，货号：353847）
5 ml圆底聚苯乙烯管（Corning，Falcon，目录号：352008）
15 ml锥形底部离心管（Corning，Falcon，目录号：352196）
50 ml锥形底部离心管（Corning，Falcon，目录号：352070）
3 ml BD Luer-Lok 吸头注射器（Becton Dickinson，目录号：309657）
30毫升BD Luer-Lok 尖头注射器（Becton Dickinson，目录号：302832）
25毫米无菌PES注射器过滤器，孔径为0.45 µm（Thermo Fischer Scientific，目录号：7252545）
40 µm细胞过滤器（Corning，Falcon，目录号：352340）
70 µm细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：22-363-548）
Amicon Ultra-15离心15 ml样品量过滤器NMWL 100KDa（EMD Millipore ，目录号：UFC910008）
U-100胰岛素注射器，1毫升，26克（BD Biosciences，目录号：329652）
U-100胰岛素注射器，0.5毫升，29克½（Exelint 国际，目录号：26028）
金毛动物柳叶刀，5毫米（Medipoint ，目录号：NC9891620）
用于阴性细胞选择的LS色谱柱（Miltenyi Biotec ，目录号：130-042-401）
6-12周龄的C57BL / 6骨髓供体小鼠和同龄C57BL / 6骨髓受体小鼠（至少6周龄）（杰克逊实验室，目录号：000664）
293T细胞（ATCC，目录号：CRL-32 16）
pCL- Eco逆转录病毒包装载体（Addgene ，目录号：12371）（Naviaux 等，1996 ）
pMSCV-NOTCH1-L1601P-ΔP （Chiang 等，2008 ）
JETPEI DNA转染试剂提供用150mM 的NaCl 溶液（Polyplus ，目录号：101-10N）
PBS：不含钙和镁的细胞培养磷酸盐缓冲盐水（1x）（Corning，目录号：21040CV）
DMEM（Corning，目录号：10-013-CV）
Opti-MEM I降低血清培养基，GlutaMAX 补充剂（Gibco ，目录号：51985）
胎牛血清（FBS），热灭活和无菌（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
青霉素（10,000 IU）和链霉素（10,000 µg / ml），工作浓度为100倍（Corning，目录号：30002CI）
HEPES 1 M（Gibco，货号：15630080）
0.5 M EDTA（Lonza，货号51201）
β- 巯基乙醇，55 mM （Gibco ，目录号：21985023）
台盼蓝（Gibco，货号：15250061）
ACK裂解缓冲液（Quality Biologicals，目录号：118-156-721）
CD117小鼠微珠（Miltenyi Biotec ，目录号：130-091-224）
小鼠谱系细胞耗减试剂盒（Miltenyi Biotec ，目录号：130-090-858）
聚乙烯感染/转染试剂（EMD密理博，目录号：TR-1003-G）
用于流式细胞术的CountBright 绝对计数珠（Invitrogen，目录号：C36950）
重组鼠IL-3（Peprotech ，目录号213-13）
重组鼠IL-6（Peprotech ，目录号：216-16）
重组鼠IL-7（Peprotech ，目录号217-17）
重组鼠Flt3-L（Peprotech ，目录号：250-31L）
重组鼠SCF（Peprotech ，目录号：250-03）
重组鼠TPO（Peprotech ，目录号315-14）
抗小鼠Sca-1（Ly-6A / E）单克隆抗体（克隆D7），PE-Cyanine7共轭物（eBioscience ，目录号：25-5981）
（可选）抗小鼠CD4单克隆抗体（克隆RM4-5），APC偶联物（BD Biosciences，目录号：561091）
（可选）抗小鼠CD8单克隆抗体（克隆53-6.7），PE-Cyanine7共轭物（BD Biosciences，目录号：561097）
DAPI（4'，6-Diamidino-2-Phenylindole，Dilactate）（Invitrogen，目录号：D3571）
肝素，1,000 USP单位/ ml（Sagent Pharmaceuticals，目录号：25021-400-30）
盐酸氯胺酮注射液（100 mg / ml：受控物质）; 咨询机构的兽医
赛拉嗪无菌溶液（20 mg / ml：AKORN Animal Health;目录号：139-236）; 咨询机构的兽医
染色介质（SM；请参见食谱）
293T培养/转染培养基（请参阅食谱）
补充生长因子的转导培养基（请参见食谱）
氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉鸡尾酒（请参阅食谱）

设备

1 ml / 200 µl / 20 µl 移液器
研钵和研杵
细胞培养培养箱，37 °C / 5％CO 2
解剖工具：剪刀，镊子，手术刀刀片（推荐来源：Fine Science Tools www.finescience.com）
血细胞计数器（推荐）或自动细胞计数器
层流生物安全柜
配有离心桶转子和平板适配器的冷冻离心机
MACS MultiStand （Miltenyi Biotec ，目录号：130-042-303）
MidiMACS 分离器（Miltenyi Biotec ，目录号：130-042-302）
带有绿色荧光蛋白（GFP）激发/发射滤光片的荧光显微镜
具有蓝色（488 nm），紫色（405 nm），绿色（561 nm）和红色（633 nm）激光的流式细胞仪仪器（推荐：LSRFortessa ，BD Biosciences）
伽马射线源或替代性小动物辐照器

软件

FlowJo（FlowJo LLC，美国俄勒冈州阿什兰）
GraphPad Prism软件（美国加利福尼亚拉荷亚，www.graphpad.com）

程序

逆转录病毒转导和骨髓移植的这种方法可用于过表达任何目的致癌基因，从而在小鼠中产生淋巴样或髓样白血病。转化效率，疾病进展动力学和肿瘤穿透性将取决于所用致癌基因的致瘤性和实验变量，例如移植的转导的造血干细胞的数量。

注意：请参阅说明部分该协议的额外的信息，并请参阅图4 为所述的比较的pMSCV-NOTCH1-L1601P-ΔP 和ΔE-NOTCH1 白血病模型（推荐的细胞数，白血病发展和外显率的动力学）。

这里描述的程序已经过优化，可用于建模由NOTCH1受体的L1601P-ΔP突变体形式特别驱动的T-ALL发育。例如，当使用较大的构建体，例如pMSCV-NOTCH1-L1601P-ΔP-ires-GFP（> 15 kb）时，对293T细胞的转染进行了修饰，以解决降低的转染效率，并抵消了病毒滴度的降低。此外，该协议还建议除胫骨和股骨外，还应从髋骨和脊椎中分离出骨髓。这种方法大大增加了可用于后续转导的骨髓干细胞和祖细胞的总数，同时减少了所需实验动物的数量。尽管此协议中列出的所有小鼠（供体和受体小鼠）均处于C57BL / 6背景上，但如果骨髓供体和受体小鼠处于同基因遗传背景下，则可以使用其他小鼠品系。但是，重要的是要记住，每个菌株都有独特的背景等位基因，它们可能与突变，转基因或其他遗传插入物相互作用并改变其表达（https://www.jax.org/news-and-insights/2006/ 6月/基于小鼠的生物医学研究中的遗传背景的重要性）。

请注意，在此协议中概述的实验方法需要动手活性（日6连续天小号0 - 5）中，用随后的随访第21天（图小号1A 和1个B;图4）。

重要提示：所有实验程序都必须经过当地动物保健委员会的批准。

笔记：

在开始实验方案之前，请根据所需的受体动物数量计算所需的骨髓供体小鼠数量。作为“经验法则”，仅从时收获骨髓2个后腿，n = 1个的骨髓供体是足够用于移植成n = 2 - 3 接受者动物; 从所有骨骼（后肢和前肢，骨盆骨和脊柱）收获骨髓时，n = 1的骨髓供体足以移植到n = 6-8的接受动物中。
在方案的第5天，还需要另一只未经治疗的同基因野生型小鼠作为辅助性骨髓细胞的来源。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902520--1179 Agnieszka Wendorff 729498 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.从小鼠造血干细胞生成致癌的NOTCH1驱动的T-ALL的实验设计。一。关键实验步骤的卡通表示。乙。实验策略的时间表。

293T细胞的瞬时转染

第0天：

在转化前24-48 h接种293T细胞，其密度应达到转染时约60-70％的融合度（对于293T培养基；请参见食谱）。解冻新鲜小瓶的活冻n细胞后，使用传代不少于2次的293T 细胞。总共不得超过20个段落。仅使用经过测试的支原体阴性细胞（Young 等，2010 ）。

注意：应根据培养板的大小和用于生产病毒的293T细胞的生长动力学来优化接种密度。以下值已针对150 mm组织培养板进行了优化，其中293T培养板与供体小鼠和用于骨髓分离的总骨数的保守比例为1：1。

第一天：

在晚上，进行293T细胞的瞬时转染（表1）；有关一般指南，请参见https://www.polyplus-transfection.com/wp-content/uploads/2015/09/CPT_101_jetPEI_vU.pdf。

在无菌条件下，在单独的试管中制备DNA和转染混合物：

表1. 每1x 150 mm 293T细胞板推荐的转染试剂和逆转录病毒构建体的量（根据需要扩大）

管＃1

每150毫米板的数量

jetPEI 转染试剂

50微升

氯化钠

450微升

总容积/板

500微升

2号管

每150毫米板的数量

pMSCV-NOTCH1-L1601P-ΔP逆转录病毒构建体

20微克

pCL- 生态包装结构

15微克

NAC 升

X微升

填充至总体积/板

500微升

将1号试管的内容物添加至2号试管（始终向DNA混合物中添加转染试剂，反之亦然），轻轻涡旋并在室温下静置20-30分钟。
将混合物逐滴添加至293T细胞；每150毫米平板1毫升。
孵育过夜（12-16小时）。

第二天：

293T细胞的瞬时转移，继续
在早晨，除去转染培养基，并轻轻用13-15毫升新鲜293T培养基更换。放在培养箱中直到第二天。

笔记：

一个。293T细胞将在转染后12小时内开始产生GFP。为了确认成功的转染并获得转染效率的定性评估，建议在转染后16-24小时使用荧光显微镜验证GFP的产生；转染的产病毒细胞呈现出明亮的荧光。

b。进行所有培养基更换时要格外小心，因为细胞已被转染试剂敏化，并通过连续培养更容易从平板上脱离。

C。从此以后，在处理BSL-2危险材料时，请遵守所有安全要求。

分离骨髓细胞和CD117 + 细胞富集
笔记：

该方案建议通过使用研钵和研杵压碎骨头来隔离骨髓，这种方法可产生更高和更一致的细胞产量，同时保持高细胞活力。对于新手研究人员来说，从髋骨和脊椎中分离骨髓显得比较麻烦，但它极大地提高了每只小鼠的细胞产量，并减少了提取骨髓所需的实验动物的数量，这是使用转基因小鼠模型时的关键考虑因素。尽管从实验小鼠中解剖胫骨和股骨在该领域已经很成熟，但获得髋骨和小腿椎骨的情况却很少见。我们强烈建议您在采用这种方法之前，先阅读由Lo Celso和Scadden （2007）发布的视频教程。
小鼠骨髓细胞的逆转录病毒转导最常使用总谱系阴性骨髓细胞的阴性选择进行。如此处所述，对CD117 + 细胞的阳性选择使造血干细胞的转导规模增加，这导致具有自我更新潜能的目标人群的转化效率提高。
始终将染色培养基（SM）和骨髓细胞悬液（BM）放在冰上。在4 °C下执行所有离心步骤。
以下提供的值基于从n = 1只成年小鼠（约8-10周龄）的所有骨骼中分离出的总BM，并应根据骨髓供体动物的目标数量适当放大。

牺牲供体小鼠：建议进行CO 2 窒息，然后颈脱位。
解剖每只供体小鼠的胫骨，股骨和骨盆骨；总的预期骨髓细胞产量约为120 x 10 6 /只动物，但随供体动物的年龄而变化。如果需要，可以通过额外隔离脊椎将总细胞产量提高到160 x 10 6 -200 x 10 6 /动物。
使用手术刀刮擦肌肉组织，清洁骨骼。使用Kimwipes /纸巾擦拭手指之间的骨头，以去除残留的组织。建议通过脱位而不是切割骨头来轻柔地折断膝盖骨和其他关节的软骨，因为这样可以保留骨头的完整性，提高产量并降低污染的风险。如果要隔离脊椎，请将椎骨分成3-4个单独的部分，然后除去脊髓。用Kimwipes 擦拭彻底清洁。将清洁的骨头放在冰上的冷SM中。
尽管不是绝对必要，但建议在无菌条件下在层流生物安全柜中执行所有后续步骤，以防止污染。使用研钵和研杵在5毫升冷SM中将骨头粉碎（粉碎而不是研磨，以保持高细胞活力）。反复抽吸并使用3 ml注射器弹出细胞悬液，以生成单细胞悬液，然后将其通过40 µm细胞过滤器进入置于冰上的50 ml收集管中。向研钵中加入5 ml SM，并重复此过程约3次，直到骨头被完全压碎并呈现半透明/白色。
在最后一轮压碎后，用5 ml SM洗涤滤网；这导致每只供体小鼠约40 ml单细胞骨髓悬浮液。
在4 °C下以500 rcf的速率沉淀细胞7分钟。
吸出/倒出SM（沉淀物将显示为红色）。
通过将沉淀物重悬于5 ml ACK缓冲液中进行红细胞裂解，并在室温下孵育5分钟。使细胞悬液通过70 µm细胞过滤器进入置于装有至少20 ml SM的冰上的50 ml锥形管中，以终止裂解反应，然后用SM充满该管，以进一步稀释ACK裂解缓冲液。
在4 °C下以400 rcf的速率沉淀细胞10分钟。
吸出/倒出上清液（沉淀现在应该出现在WHITE附近），并小心地将细胞沉淀重悬于5 ml冷SM中。加入15 ml冷SM并轻轻脉冲涡旋以获得20 ml均匀的细胞悬液。
通过使用血球计数器或自动细胞计数器进行手动细胞计数，确定存活细胞的数量（锥虫蓝排除）。
注意：由于总骨髓细胞的异质性，前一种方法可以更准确地量化细胞数量。

按照制造商的说明（https://www.miltenyibiotec.com/US-en/resources/technical-documents/data-sheets.html ），继续使用抗CD117微珠进行CD117 + 阳性细胞选择。在最后一步中，洗脱到15 ml Eppendorf管中，然后加入10 ml SM。沉淀细胞，在4 ℃下在500 5分钟RCF 。
将CD117 + 细胞富集的沉淀重悬于2 ml冷SM中，并进行细胞定量。将细胞放在冰上。
在该方案的此步骤中，建议使用血细胞计数器手动计数细胞并用锥虫蓝排除死细胞，以确保准确的细胞计数。当从所有骨骼中收获细胞时（如上所述），总预期产量约为5 x 10 6 CD117 + 细胞/供体动物。
在密度为0.5 x 10 6 细胞/ ml的2 ml / 孔补充生长因子的培养基（对于GF培养基，请参见食谱）中，在24孔组织培养板上富集CD117 + -的细胞，并培养过夜。

第3天：第一轮病毒收集和骨髓祖细胞转导

首次收集和浓缩293T培养物中的病毒上清液
注意：在2级生物安全柜中于室温下执行以下步骤，并遵守处理BSL-2有害物质的所有安全要求。

收集并过滤病毒上清液：
从293T培养物中收集病毒上清液（VSN），并通过70 µm过滤器进入50 ml锥形收集管中以除去大细胞碎片。
在第4天第二次收集VSN，用13-15 ml新鲜293T培养基仔细补充培养物。
通过将VSN穿过0.45 µm PES注射器过滤器来清除小碎片和聚集物（最容易的方法是将VSN从50 ml锥形收集管中抽吸到装有60 G ，18 G½ 规格大针头的30-60 ml注射器中，向上旋转注射器以防止溢出和污染，并在将VSN喷射到新的50 ml圆锥形底部收集管中之前用注射器过滤器更换针头）。
注意：两个连续的过滤步骤将除去所有可能导致下一步堵塞Amicon Ultra浓缩柱的颗粒。

病毒上清液浓度
将VSN转移到Amicon 过滤柱管中，以达到最大容量（Amicon Ultra = 15 ml）。
在室温下以2500 rcf的速度离心，直到约80％的VSN通过了过滤单元（典型的最终浓缩物体积/ 15mL VSN体积= 200µl）。如果从> 1 x 150毫米293T产病毒皿中收集了VSN，请使用相同的过滤单元重复步骤A2a-A2b ，直到达到所需的VSN最终体积。将最终体积的浓缩VSN转移到Eppendorf管中。丢弃Amicon 过滤装置。
注意：为含有2ml的CD117 + 富集的骨髓的24孔培养板的每个孔产生100 µl VSN（浓度为20x）。我。例如，如果在方案第2天将富含CD117 +的骨髓细胞接种在12孔中，则将VSN浓缩至最终体积为1200 µl。用新鲜的OptiMEM 细胞培养基根据需要调节体积。切记添加适量的聚烯烃（下面的步骤B1 ）。

首次转导富含CD117 +的骨髓祖细胞
注意：将离心机预热以进行旋转感染至28 °C 。将减速速度（中断）设置为0。

向装有浓缩VSN的Eppendorf管中加入Polybrene试剂，使其终浓度为80 µg / ml（20x）。
将100 µl含20x Polybrene的20x VSN加到含有2ml GF培养基的CD117 + 富集的骨髓细胞的24孔板的每个孔中。
用石蜡膜密封板，以防止旋转感染过程中离心机受到污染。
在28 °C下以1,100 rcf 离心90分钟。
小心取出封口膜，然后将板放回TC培养箱中。让细胞恢复至少6小时。
6-8小时后，轻轻取出1/2的介质，约 1毫升（轻轻倾斜平板；使用1毫升移液器，并在吸液时保持移液器吸头与培养基表面齐平，以防止吸出骨髓细胞）。
加入1 ml新鲜的GF补充转导培养基，并使细胞恢复过夜（12-16小时）。

第4天：第二轮病毒收集和骨髓祖细胞转导

第二次从293T培养物中收集和浓缩病毒上清液
在协议的第3天，重复步骤A1a-A1c和A2a-A2b 。

富含CD117 +的骨髓祖细胞的第二次转导，先前在第3天进行转导，并在添加GF的培养基中培养过夜。
在实验方案的第3天重复步骤B1-B7 。

辐照受体小鼠
笔记：

尽管可以接受6-12周的范围，但建议使用8周龄的小鼠作为受体。由于应在移植前至少8小时对受体小鼠进行辐照，因此该方案建议在移植前一天的晚上进行辐照。单次剂量可提供900 Rads的全身剂量（TBI），相当于减少暴露（致死率<100％）。致死剂量因小鼠品系而异，如本规程中所用，900 Rads TBI最适合成年C57BL / 6品系。
辐照后，必须将接受动物的动物置于抗生素/止痛剂补充的饮用水中1周；必须在您实验室批准的动物实验规程中对此进行概述。

第5天：转导的骨髓细胞的定量和移植

辅助骨髓细胞的分离和谱系耗竭
从与整个实验方案中使用的动物相同的品系/遗传背景（同基因）的野生型成年小鼠的两个后肢中分离出骨髓。遵循第2天概述的骨髓分离方案的步骤B1-B11 。
笔记：

从2个后肢骨髓的隔离（胫骨+ 呜呜ERI 只）后红细胞裂解的产率50成年小鼠（约8周龄）的×10 6 - 7个0 ×10 6 细胞。
许多实验室选择完全绕开此步骤，而另一些实验室则采用补体介导的T细胞耗竭方法（供体和受体小鼠是100％同基因的）。由于实验室之间的小鼠转移和回交的严格方法不同，我们建议使用谱系耗竭的辅助细胞稍微麻烦一些的方法，以避免在供体-受体移植环境中发生任何可能的免疫反应。
使用所选方法进行绝对细胞定量（使用血细胞计数器和台盼蓝排除法或自动细胞计数器进行手动细胞定量；前者是首选方法）。
按照制造商的说明（https://www.miltenyibiotec.com/US-en/resources/technical-documents/data-sheets.html ）执行基于磁性珠的辅助骨髓沿袭耗竭。该方法依赖于阴性选择，即与阳性CD117细胞富集（第2天B 部分）不同，它将从磁柱收集的流通液收集到置于冰上的15 ml锥形底管中。的总预期产量的大号中- 从一个成年小鼠的2个后肢分数为5×10 6 细胞。
将细胞在500 rcf 和4 °C下沉淀5分钟。
重悬林- 在1ml SM细胞，并通过使用血球台盼蓝排除量化的绝对活细胞数目（参见步骤A2 ）。将细胞保持在冰上，直到准备进行下面的骨髓移植步骤为止。
轻轻地将辅助骨髓脉动涡旋以获得均匀的单细胞悬液。将适当数量的细胞转移到一个15 ml的新鲜试管中，每只受体小鼠需要2 x 10 5 -3 x 10 5个辅助骨髓细胞（即，如果将10只受体小鼠用于移植，则收集一个包含相当于2 x 10 6 -3 x 10 6个单元的体积）。
前进到步骤B13 的第2天的协议。

收集和定量转导的骨髓干细胞和祖细胞
在层流柜中，使用1 ml移液器重悬pMSCV-NOTCH1-L1601P-ΔP转导的骨髓祖细胞（第3天，步骤B7 ）。在15 ml / 50 ml锥形管中合并来自24孔板的细胞悬液。
通过在室温下500 rcf 离心5分钟来沉淀细胞。
在没有生长因子的已知体积的OptiMEM 转导培养基中重悬细胞，并通过使用血球计数器和台盼蓝排除死细胞进行手动计数来定量活细胞的绝对数量。重悬液的体积取决于细胞沉淀的大小（如果最初从所有骨骼中收获细胞，则约为5 ml）。
将细胞悬液的两个100μl等分试样转移到1.5 ml Eppendorf管中进行染色和定量（该等分试样应包含不少于50,000-100,000个细胞，以确保在下一步中进行准确定量）。将转导细胞的悬浮液保存在37 °C TC培养箱中，直到完成定量。
注意：松开15 ml / 50 ml锥形收集管的螺帽，使空气自由流通。

当使用推荐的PE-Cyanine7偶联的抗Sca-1抗体时，向100微升细胞等分试样中加入500微升SM和1微升抗Sca-1抗体。在第二等分试样的细胞中，仅添加500 µl SM（此阴性对照可在进行后续流式细胞术分析时更准确地区分Sca-1阳性人群和Sca-1阴性人群）。
注意：使用替代的荧光染料偶联物时，所有抗体应在使用前进行滴定，尽管1：200的稀释度对于大多数市售抗Sca-1偶联物效果很好。对于此协议中列出的特定抗体，已根据经验确定了此步骤中的1：600稀释度（请参见材料和试剂）。

在黑暗中在冰上将细胞染色45-60分钟。
加入1 ml SM洗涤细胞，并在4 °C下以500 rcf 离心5分钟。吸出上清液时要非常小心，因为沉淀可能很小。
将沉淀重悬于500 µl SM + 25 µl CountBright 定量珠中。加入5 µl DAPI（在H 2 O中预先稀释至0.5 mg / ml ）以排除死细胞。
注意：使用CountBright 珠子时，请使用移液器彻底重悬细胞，并仔细记录最终的重悬体积，因为该体积将在下一步中用于计算转导细胞的绝对数量。同样，请确保将CountBright 珠子充分涡旋，并注意所添加的准确体积用于定量，以及所使用的CountBright 珠子批号中的珠子数量/微升。

在流式细胞仪上运行样品，以确定转导的GFP + Sca-1 + 细胞的频率。一定要在活细胞门只（DAPI - ），并使用“无抗的Sca-1抗体”控制旋钮设置门。在CountBright 珠的总体上绘制一个额外的门（图s 2A- 2 D）。
注：活细胞群（DAPI - ）将包含GFP的混合- （未转）细胞和GFP + （转）细胞。成功转导的骨髓干细胞和祖细胞（Sca-1 + ）的预期百分比应不少于10-15％（GFP + Sca-1 + 双阳性细胞）。请参阅注释部分以获取其他注释。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902520--1179 Agnieszka Wendorff 729498 \ Figs jpg \图2.jpg

图2。基于流式细胞仪的逆转录病毒转导的骨髓祖细胞的定量。该图描述了A 的逐步门控策略。总的体外扩增CD117 + 富集细胞和CountBright 定量珠。B.双重排除；C.死细胞排除（DAPI - ）; D.被转导的造血干细胞和祖细胞的频率（HSPC：GFP + Sca-1 + ）。

根据目标群体中的细胞数和收集的CountBright 珠子数，计算GFP + Sca-1 + 双阳性细胞的绝对数。按照制造商的说明进行细胞定量（请参阅数据分析和图5 ）。
除去单元F ROM中的TC培养箱（步骤B3 的第5天通过吹吸），并再悬浮和向下/轻轻脉冲- 涡旋得到均匀的单细胞悬浮液。
根据第5天的步骤B4-B10 中执行的计算，取出等分的转导细胞。您将需要100,000个GFP + Sca-1 + 细胞/收件人小鼠。我们先前已经确定，移植100,000个转导的细胞会导致70-80％的肿瘤渗透率（不建议超过150,000个GFP + Sca-1 + 细胞，因为这会导致多个克隆形成肿瘤）。例如：如果10％的转导细胞是GFP + Sca-1 + ，并且总细胞悬浮液包含1.5 x 10 6个细胞/ ml，则您将需要0.67 ml /收件人动物。因此，如果要移植10只受体动物，则需要6.7-10 ml的总细胞悬浮液进行移植。
池一起适当体积transduc ED的Sca-1 + GFP + 来自前一步骤中制备的辅助骨髓所需体积的细胞的步骤A6 的第5天AB OVE。辅助骨髓的体积由细胞悬液的浓度和受体小鼠的目标数量决定（每只受体小鼠2 x 10 5 -3 x 10 5个辅助骨髓细胞）。
在4 °C下以500 rcf沉淀细胞5分钟。
将细胞彻底重悬在无菌的冷PBS中（储存于4 °C 或在冰上预冷），然后通过40 µm过滤器除去碎屑/团块。PBS的总体积由受体动物的数量决定，即，通过眼眶后注射进行移植时，将细胞重悬于100-50 µl PBS /受体小鼠中。
注意：建议使用20％过量的细胞重悬于等效20％的体积中（即，如果移植n = 10只受体小鼠，则准备足以容纳n = 12只受体小鼠的细胞悬液）。切记使用1 ml移液器从40 µm过滤器的底部收集所有残留的细胞悬液，因为使用小体积时，仅靠重力拉动，整个细胞悬液就不会通过滤网。

逆转录病毒转导的骨髓细胞的移植
上述的最后一个步骤的结果是含有GFP转导的混合物的单细胞悬浮液+ 的Sca-1 + 细胞（100,000 /接受者）+未转导的祖细胞+林- 辅助骨髓细胞。

通过使用1 ml胰岛素注射器腹膜内注射100 µl氯胺酮/ 甲苯噻嗪鸡尾酒来麻醉受辐照的动物（第4天；C 节）。
注意：另外，尽管异氟醚的恢复期非常短，但不建议具有广泛先验经验的用户使用，但通常使用异氟烷进行吸入麻醉。

给动物完全镇静后，使用0.5 ml 29 G½ 胰岛素注射器将50-100 µl细胞悬液注入眼眶后窦（Yardeni 等，2011 ）。
注意：请参阅Yardeni 等。（2011）对小鼠进行眼眶后注射的全面技术概述。

严密监视动物并维持补充抗生素的饮用水7天。

第21天：检测外周血中的瞬时CD4 + CD8 + 双阳性白血病前细胞

笔记：

任何采血方法都必须经过当地动物保健委员会的批准，并在实验室批准的动物实验方案中进行概述。只有经过培训的人员才能执行此过程。
该方案建议通过下颌下穿刺采血，这是一种快速的技术，可以最大程度地减少对实验动物的伤害（图3 ）。

如果评估CD4和CD8表面表达（可选），请准备50 µl抗体混合物/外周血样品。当使用此方案中推荐的抗体时（请参见材料和试剂），按如下方法稀释SM中的抗体：抗CD4-APC 1：400和抗CD8-PeCy7 1：800。将抗体混合物在4 °C 的黑暗环境中放置，直到准备进行染色。
准备含有15 µl肝素的1.5 ml Eppendorf管（n = 上文第5天的受体小鼠数量）。
使用5 mm刺血针通过下颌下穿刺收集2-4滴/小鼠外周血，进入先前准备好的装有肝素的收集管中（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902520--1179 Agnieszka Wendorff 729498 \ Figs jpg \图3.jpg

图3.下颌下穿刺采血。一。“雀斑”有助于下颌下静脉的正确定位。乙。收集2-4滴血。Ç 。在此过程中获得的最大推荐外周血量。

准备包含1 ml ACK裂解缓冲液的4 ml圆底FACS管。
将约75 µl的外周血转移到ACK缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。
加入2 ml SM并在室温下以500 rcf 沉淀细胞5分钟。
将细胞沉淀重悬于1 ml ACK缓冲液中，并重复裂解和洗涤步骤3次，直到红细胞完全裂解为止（最终沉淀可能保持粉红色而不是白色；但是，建议不要减少裂解步骤，因为红细胞非常“粘”，经常导致流式细胞仪堵塞。
最后的洗涤步骤后，将沉淀重悬于50 µl抗体混合物中，并在冰上于黑暗中孵育45分钟。
用1 ml SM洗涤细胞，并以500 rcf 沉淀5分钟。重悬于500μlSM，再加DAPI（终浓度5μg/ ml）。
使用配有蓝色488 nm（GFP），绿色561 nm激光（PE-Cy7），紫色405 nm（DAPI）和红色633 nm（APC）激光的流式细胞仪仪器分析样品。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902520--1179 Agnieszka Wendorff 729498 \ Figs jpg \图4.jpg

图4.监视NOTCH1诱导的T-ALL的发展。一。外周血中GFP + 白血病前胚细胞的百分比。乙。NOTCH1-L1601P-ΔP逆转录病毒转导的鼠骨髓干细胞和祖细胞移植后21天，白血病前胚细胞CD4 / CD8表面表达。Ç 。移植100,000个NOTCH1 -L1601P-ΔP（纯黑色），100,000 pMSCV 空载体对照（黑色虚线）和50,000ΔE-NOTCH1-pMSCV所转导的小鼠造血干细胞和祖细胞（灰色）移植后几周的比较Kaplan-Meier生存曲线。

数据分析

第5天，对GFP + Sca-1 + 双阳性细胞的绝对数量进行定量（图2 和图5）

根据生产商的说明，使用CountBright 绝对计数珠进行流式细胞仪定量。此计算需要以下值：

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C36950

获取的GFP的绝对数量+ 的Sca-1 + 细胞（图2D; 步骤B9 的第5天）。
的获取的珠的绝对数量（图2A; 步骤B9 的第5天）。
的绝对＃CountBright 珠添加至样品（步骤B8 的第5天）。
其中细胞再悬浮，用于流式细胞术分析SM的体积（步骤B8 的第5天）。
骨髓细胞悬浮液的等分试样用于定量体积（步骤B4 的第5天）。
绝对量，其中骨髓细胞再悬浮（步骤B3 的第5天）。
计算培养物中GFP + Sca-1 + 双阳性细胞的绝对数量。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902520--1179 Agnieszka Wendorff 729498 \ Figs jpg \图5.jpg

图5. GFP + -Sca1 + 绝对定量。基于CountBright 珠的方法可定量pMSCV-NOTCH1-L1601P-ΔP-GFP转导的造血干细胞和祖细胞的绝对数量（请参见上文，并遵循制造商的说明）。

笔记

1. 在此协议中，通过将293T细胞与T细胞进行瞬时共转染，产生了编码人NOTCH1 癌基因和可追踪GFP标记（绿色荧光蛋白；也可以是RFP，抗生素抗性基因等）的复制缺陷型逆转录病毒。pCL -Eco（表达gag-pol-env包装功能的质粒）。Ť 他293T细胞产生的亲嗜性反转录病毒特异性的小鼠细胞，但不是完全无效的人类细胞，这需要的BSL-2的生物危害的条件严格观察。

2. 使用jetPEI 转染试剂优化了该方案。替代转染系统可能会成功使用，但需要进行个别优化。

3. 在这里，我们概述了致癌的NOTCH1-L1601P-ΔP驱动的肿瘤的产生。由于该逆转录病毒构建体的大小> 15kb，因此很难实现超过10％（GFP + Sca-1 + ）的骨髓祖细胞的转导效率。鲁棒7 变换的0-80％频率100000个导的祖细胞，其通过45±20％GFP之前的移植后达到+ 预白血病胚细胞在外周血中在第21天（图小号4A 和4 B）。肿瘤进展通常会导致移植后12至25周的死亡率，与ΔE-NOTCH1驱动的T-ALL相比，反映出动力学上更具可变性的肿瘤发展（图4C）。当使用高度致癌的组成型活性ΔE-NOTCH1等位基因时，HSC的转导效率在30±10％范围内，导致100％的转化效率。随后的T-ALL发育发生在移植50,000个GFP + Sca-1 + 祖细胞后6-8周，而GFP + 白血病在移植后21天的白血病前胚细胞达到60-70％，因此存活率超过0％ 8周（图4C）。该方案也已成功用于生成白血病的其他小鼠模型，例如ΔE-NOTCH1，c - Myc 或Flt3-ITD过表达诱导的T-ALL和AML白血病，转导Lin - C57BL / 6 时具有100％的渗透性来源的骨髓细胞，然后在12周内移植50,000个具有100％渗透率的转导细胞（先前发表的数据），说明了其在多种谱系特异性癌基因中的功效。

菜谱

染色介质（SM）
PBS

2％FBS

1 mM 麻疹

0.5 µM EDTA

293T生长/转染培养基
记忆体

10％FBS

100 U / ml青霉素G

100 µg / ml链霉素

补充生长因子的CD117 + 细胞培养/转导培养基
Opti-MEM I降低血清培养基，GlutaMAX 补充剂

10％FBS

100 U / ml青霉素

100 µg / ml链霉素

55 µM 2-巯基乙醇（β- 巯基乙醇）

10 ng / ml重组小鼠IL-3

10 ng / ml重组小鼠IL-6

25 ng / ml重组小鼠IL-7

50 ng / ml重组小鼠Flt3-L

50 ng / ml重组小鼠SCF

25 ng / ml重组小鼠TPO

氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉混合物（1毫升）
150 µl氯胺酮（100 mg / ml）

150微升赛拉嗪（20毫克/毫升）

700微升PBS

致谢

由美国国立卫生研究院支持这项工作授予R35 CA210065（AF）和R01 CA155743（AF）。AAW得到了Rally基金会奖学金的支持。我们感谢D. Herranz 对协议的严格审查。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据NIH《实验动物的护理和使用指南》，将用于制定该方案的所有动物都安置在纽约州哥伦比亚大学医学中心欧文癌症研究中心的特定无病原体设施中。所有动物程序均获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

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