材料和试剂

通过体外转录生产未修饰的酵母tRNA Phe
对于tRNA 体外转录

1. 商业或内部生产的T7 RNA聚合酶（在-20°C下以1 mg / ml的浓度在20 mM 磷酸钠pH 7.7、100 mM NaCl ，10 mM DTT，1 mM EDTA，50％（v / v）甘油）。

2.无RNase的水（双蒸馏水或MilliQ 水18.2MΩ）

3. 准备在pH 8.0的水中以100 mM 使用ATP，UTP，GTP，CTP （Jena Bioscience，目录号：NU -1014L）

4. 准备在pH 7.8的水中使用15个N-标记的UTP和GTP，浓度为100 mM （Eurisotop ，目录号：NLM-4270-CA，NL M-4268-CA）

5. DNA模板

5 ' TGGTGCGAATTCTGTGGATCGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCGCTATAGTGAGTCGTATTA 3 ' （Eurogentec的，1个微摩尔合成规模的，PAGE纯化）

6. T7启动子引物：5 ' TAATACGACTCACTATAG 3 ' （Eurogentec的，0.2 Myumol 的合成比例，脱盐）

7. 280 毫米MgCl 2 （在水中制备）（CAS编号7791-18-6）

8. 80 mM GMP （在pH 7.5的水中制备，pH用浓盐酸调节）（Sigma-Aldrich，目录号The：G8377-56）

9. 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）（在pH 8.0的水中制备，pH用浓NaOH 调节）（CAS编号60-00-4）

10. 0.1 M亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：05292）

11.1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43816）

12. Triton TM X-100溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）

13. 20倍T7转录缓冲液（TB）（请参阅食谱）

用于变性尿素-PAGE

尿素（Euromedex，目录号：EU0014-B）
40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19：1）溶液（Euromedex，目录号：EU0076-B）
以10％（w / v）的水溶液形式制备的过硫酸铵（APS）（Euromedex ，目录编号：EU0009-B）
N，N，N'，N'- 四甲基乙二胺（TEMED）（Euromedex ，目录号：50406）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
二甲苯氰（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
牛逼Oluidine蓝（CAS编号92-31-9，西格玛- Aldrich公司，目录号：198161）
绝对乙醇（CAS号64-17-5，Millipore / Merck，目录号：1070172511）
10x TBE缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：T4415-1L）
2x RNA加载染料（请参阅食谱）
甲苯胺蓝染色液（请参见配方）

用于tRNA 转录本纯化和NMR样品制备

无菌注射器过滤0.22 微米（VWR，目录号：514-0073）
透析袋Spectra / Por 3透析管MWCO <3.5 kDa （Spectra / Por ，目录号：132724）
标准瓶盖用于透析袋（频谱® ，目录号：132735）
集中器的Amicon ® 超15 3000 MWCO（Millipore公司/ Merck公司，目录号：UFC900308 ）
Na H 2 PO 4 和Na 2 HPO 4 12H 2 O （CAS号7558-80-7和10039-32-4 ，Sigma-Aldrich，目录号：S3139和71649 ）
UltraPure TM 5 M NaCl （例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：24740011）
1 M MgSO 4 （在水中制备）（CAS编号7487-88-9）
1 M MgCl 2 （在水中制备）（CAS编号7791-18-6 ）。
纯化缓冲液A（请参阅配方）
纯化缓冲液B（请参阅配方）
NMR缓冲液（请参阅食谱）

通过在大肠杆菌中体内重组表达生产修饰的酵母tRNA Phe
用于修饰的酵母tRNA Phe 体内表达和提取

基因脉冲仪® / MicroPulser TM 电穿孔比色皿0.2cm间隙的（Bio-Rad公司，目录编号：1652082）
50ml锥形管（例如，隼TM ，产品编号：352070）
电感受态细菌大肠杆菌JM101Tr菌株（Mechulam et al。，1987）
注意：或者，也可以使用大肠杆菌JM101或JM109菌株。

预先用酵母tRNA Phe DNA基因序列克隆的pBSTNAV 质粒（Addgene ，目录号：45801）（参见注释1和图3）
溶原性肉汤（LB）培养基Gibco公司® （热Fisher Scientific公司，目录号：10855021）
SPECTRA 9培养基（15 N，98％）（Eurisotop ，目录号：CGM-3030-N-1）
Celtone ® 基础粉末（15 N，98％+）（Eurisotop ，目录号码的：C GM-1030P-N-0.5）
氨苄青霉素，现成的解决方案，100毫克/毫升，0.2 微米过滤（Sigma-Aldrich公司，目录号：A5354-10ML）
pH 6.6的水饱和苯酚（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9710）
无水乙醇（例如，默克，目录号：1070172511）
UltraPure TM 5 M NaCl （例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：24740011）
1 M NaCl 溶液（例如，FisherScientific ，目录号：S25877）
2 M Tris-HCl pH 8.0
1 M醋酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：63052）
不含RNase的水（双蒸馏水或MilliQ 水18.2MΩ）
提取缓冲液（请参见配方）

用于修饰的酵母tRNA Phe 纯化和NMR样品制备

微量管0.2 ml
透析袋Spectra / Por 3透析管MWCO <3.5 kDa （Spectra / Por ，产品编号：132724）
标准瓶盖的透析袋（谱® ，产品编号：132735）
集中器的Amicon ® 超15 3000 MWCO（Millipore公司/ Merck公司，目录号：UFC 900308 ）
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg 色谱柱（GE Healthcare，目录号：28989334）
Mono Q 10/100 GL色谱柱（GE Healthcare，目录号：17516701）
苯基取代HR 10/10柱（GE Healthcare）
注意：或者，使用HiPrep 16/10 Phenyl HP色谱柱（GE Healthcare，目录号：29018184）。

HiPrep 26/10脱盐柱（GE Healthcare，目录号：17508701）
0.5 M NaOH 溶液（Fisher Scientific，目录号：15614900）
RN 无硒水（双蒸馏水或MilliQ 水18.2MΩ）
硫酸铵粉（Fisher Scientific，目录号：10325410）
40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19：1）溶液（Euromedex，目录号：EU0076-B）
1 M Tris-HCl pH 6.8
1 M Tris-HCl pH 8.8
20％（w / v）十二烷基硫酸钠溶液（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：05030-1L-F）
以10％（w / v）的水溶液制备过硫酸铵（APS）（Euromedex ，目录号：EU0009-B）
N，N，N'，N'- 四甲基乙二胺（TEMED）（Euromedex ，目录号：50406）
Tris -Glycine-SDS缓冲液10x浓缩液（TGS）（Sigma-Aldrich，目录号：T7777）
2-巯基乙醇（CAS号60-24-2，Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
甘油（CAS号56-81-5，Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
在水中的5在100μM互补的DNA寡核苷酸' TCGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGCGCTCT 3 ' （Eurogentec的，0.2 微摩尔合成规模的，脱盐）
2个Laemmli 加载缓冲区（请参阅食谱）
甲苯胺蓝染色液（请参见配方）
纯化缓冲液C（请参阅配方）
纯化缓冲液D（请参见配方）
纯化缓冲液E（请参阅配方）
NMR缓冲液（请参阅食谱）

设备

通过体外转录生产未修饰的酵母tRNA Phe
对于tRNA 体外转录

水浴

用于通过尿素-PAGE变性进行转录分析

用于垂直PAGE的电泳室，载玻片，垫片，夹具和梳子（例如，Bio - R ad Mini-PROTEAN），电源（例如，Bio - R ad PowerPac ）。

用于tRNA 转录本纯化和NMR样品制备

ÄKTAPurifier （GE Healthcare）或类似的色谱系统
MonoQ 10/100 GL色谱柱（GE Healthcare，目录号：17516701）
离心机（例如，贝克曼库尔特，型号：Allegra X-30R）
NanoDrop TM 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-2000）

通过在大肠杆菌中体内重组表达生产修饰的酵母tRNA Phe
用于修饰的酵母tRNA Phe 体内表达和提取

2L的三角烧瓶（例如，费舍尔品牌TM ，费舍尔科学，目录NU MBER：15459103）
孵化器（例如INFORS-HT Minitron ）
MicroPulser TM 电穿孔仪（Bio-Rad公司，CA talog号：1652100）
对于文化升离心机（例如，Beckman Coulter公司，型号：阿凡提® JE）
管旋转器（Thermo Fisher Scientific ，目录号：88881002）
涡旋混合器（例如，Scientific Industries SI TM ，型号：V ortex-Genie TM 2，目录号：SI-0236）

用于修饰的酵母tRNA Phe 纯化和NMR样品制备

ÄKTAPurifier（GE Healthcare）或类似的色谱系统
样品环5毫升（（GE Healthcare，目录号：18114053）
Superloop 10 ml和50 ml（ÄKTA设计）（GE Healthcare，目录号：18111381和18111382）
用于垂直PAGE的电泳室，载玻片，垫片，夹具和梳子（例如Bio - R ad Mini-PROTEAN），电源（例如Bio- R ad PowerPac ）。
干浴培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：88870004）
离心机（例如，贝克曼库尔特，型号：Allegra X-30R）
NanoDrop TM 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-2000）

程序

通过体外转录生产未修饰的酵母tRNA Phe
小规模tRNA 体外转录
最佳的体外转录条件在很大程度上取决于MgCl 2 和NTPs的浓度。应调整[MgCl 2 ] / [ NTP]的比例以优化目标RNA的产量（图1）。反应量表（例如，40 Myueru ）大规模生产RNA（5-20毫升）之前。在实践中，氯化镁的浓度2 是变化的小规模反应中所描述的在表1中。产率的tRNA 转录物是随后表1是确定最佳MgCl 2 浓度的第一个起点。T7 RNA聚合酶，DNA模板的浓度和GMP在2-6 mM的添加也可以进一步优化。第二步。

如表1所述，在PCR 微管中准备40μl的小规模反应测试。
将反应液在水浴中于37°C 孵育3小时。〜1 小时后，焦磷酸镁白色沉淀的出现是有效转录反应的迹象。
通过向每个小规模反应中添加5μl0.5 M EDTA pH 8.0来终止反应。
储存在-20°C或通过Urea-PAGE分析反应（步骤A2）。

表1. 40 µl的小规模反应测试，以确定最佳的MgCl 2 浓度

条件

最后

浓度

＃1

＃2

＃3

＃四

＃五

＃6

＃7

＃8

[MgCl 2 ] / [NTPs]

0.3

0.5

0.9

1.3

1.7

2.0

2.5

3

DNA温度+ T7反应（1μM）

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

200 nM

TB 20倍

2 微升

2 微升

2 微升

2 微升

2 微升

2 微升

2 微升

2 微升

1倍

NTP（100毫米）

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

8 微升

20毫米

氯化镁2 （280毫米）

0.9 微升

1.4 微升

2.6 微升

3.7 微升

4.9 微升

5.7 微升

7.1 微升

8.6 微升

6-60毫米

高氧2

20.1 微升

19.6 微升

18.4 微升

17.3 微升

16.1 微升

15.3 微升

13.9 微升

12.4 微升

--

T7 RNA pol。

1 微升

1 微升

1 微升

1 微升

1 微升

1 微升

1 微升

1 微升

25 微克/ 毫升

总容积

40 微升

40 微升

40 微升

40 微升

40 微升

40 微升

40 微升

40 微升

--

通过尿素-PAGE变性进行转录分析
为了分析转录的产品，采用相同的材料如那些用于蛋白质制备尿素PAGE凝胶SDS-PAGE analysis.For 的tRNA 〜75个的NTS ，制备具有7M尿素的凝胶混合物和14％（W / V）丙烯酰胺：将16.8克尿素，14毫升40％（w / v）丙烯酰胺：双丙烯酰胺19：1和4毫升10x TBE混合，并用H 2 O将最终体积调节至40毫升，以使19：1 双丙烯酰胺。这种混合可以在室温下储存数月）。取6毫升该混合物，并添加60 微升10个％的APS和6 微升只是放置在玻璃板之间凝胶前TEMED，并立即把梳子。
取每个小规模反应的等分试样（通常为2.5 微升），并加入2.5 微升2×RNA上样染料（配方2）.Load您的样品中的孔中，并在在1×TBE缓冲液200伏运行凝胶1个小时。
然后通过甲苯胺蓝染色进行可视化，小心地从玻璃板上移开凝胶，使其在甲苯胺蓝染色溶液（配方3）中染色5-10分钟，然后将染色溶液倒入储液瓶中，然后脱色用water.Destain 数次用新鲜水，直至凝胶的背景颜色是清楚的。
拍照与对应于所述测定法常规camera.The凝胶表1中所述和甲苯胺蓝染色显示在图1中示出了用于酵母的最佳产量的tRNA 的Phe 被用于条件下获得＃5和＃6与[的MgCl 2 ] / [的NTPs] = 1.7-2.0，即，[氯化镁2 ] = 34-40 毫和[的NTPs] = 20 毫米。因此，这些浓度被用于此的大规模制备的tRNA 。
RNA的产率生产通过体外TR anscription有时是氯化镁的浓度非常敏感2 。我们建议来执行这些小规模试验，一个新的DNA模板在每次使用时，新的NTPs每次使用时，实际上，最好不同来源的NTP的MgCl 2 浓度可能略有不同，尤其是15个N标记核苷酸的最佳MgCl 2 浓度可能略有不同，因此必须根据将用于大规模转录反应的实际NTP确定。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903018--1435 Pierre Barraud 813029 \ Figs jpg \ figure1.jpg

图1. T7的灵敏度聚合酶体外RNA生产镁concentration.Urea -PAGE揭示的表示的表1的小规模转录实验对应于未修饰的生产酵母的分析甲苯胺蓝染色的tRNA 的Phe .The 的MgCl 2 浓度从6 MM 到60 MM 不等，凝胶上方的数字对应于表1中的条件1至8。

未修饰的酵母tRNA Phe的大规模体外转录
对于大规模体外转录，向上缩放的最佳条件，如步骤A测定1用小规模reactions.In我们手中，未修饰的酵母的浓缩NMR样品的tRNA 的Phe 15 的N-拉贝带领我们和GS 可以得到由如下所述制备的10ml转录反应。

如下准备在50 ml试管中的10 ml的大规模转录反应：
40 微升DNA模板与T7启动引物以1预混合：1的比例（股票以50 μM ）

500 微升的20×T7转录缓冲液（TB）。

5 00 微升未标记的ATP（股票，在100 毫米）

500 微升的非拉贝的主导CTP（股票，在100 毫米）

500 微升的15 N-标记的（在100股票UTP 毫）

500 微升的15 Ñ 标记的GTP （股票，在100 毫米）

1300 微升氯化镁的2 （股票在280 毫）

500 微升（在80股票的GMP 毫）

250 微升T7 RNA聚合酶（以1mg / ml母液）

不含RNase的水至10毫升

将反应液在37 °C的水浴中孵育3-4小时。
加入1-1.5 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。
如步骤A4所述，保存在-20°C直至纯化或容易纯化。

未修饰酵母tRNA Phe的纯化和NMR样品制备
纯化是在执行一个在AKTA纯化（或其它FPLC纯化系统）4 ℃。转录的tRNA 对核糖核酸酶敏感，因此应该小心操作该纯化在无RNA酶的conditions.For的是，清洗净化系统和用0.5 M NaOH 色谱柱，并用水充分冲洗，然后在缓冲液A中平衡MonoQ HR 10/100色谱柱。

过滤步骤A3的大规模转录样品与0.22 微米的过滤器。
将5-6 ml转录样品上样到先前用缓冲液A平衡过的MonoQ 色谱柱上。
备注：我吨不建议更大量的加载的tRNA 到column.The纯化根据需要用于大规模吨确实变得困难，由于洗脱peaks.Perform步骤A4B到A4D多次变宽超过ranscriptions 5毫升。

所述的纯化的tRNA 转录物使用梯度，用10倍柱体积（CV）的长度，并且以3ml / min的流速来实现从20％到缓冲液B的80％。收集1ml级分。转录酵母的tRNA 的Phe 是通常洗脱缓冲液B的50％至55％。
如步骤A2所述，通过变性Urea-PAGE 分析级分的含量，并合并含有目标tRNA 的级分（通常是5 ml的1 ml级分）。不要添加55％缓冲液B后完成的tRNA Phe 级分，它们通常包含较长的RNA转录本，该转录本源自转录本3'- E Nd处的非模板核苷酸加成。
在1mM 磷酸钠pH 6.5 的透析袋中广泛透析收集的酵母tRNA Phe 馏分，通常将其在2 L透析液中透析至少2 h，然后用新鲜溶液更换3次。
在50 ml塑料管中回收透析的tRNA Phe ，并通过将样品在95°C加热5分钟并在室温下缓慢冷却来重新折叠。
添加浓缩的缓冲储备溶液（例如，0.5M磷酸钠pH值6.5和1 中号的MgCl 2 ）放置在最终NMR缓冲器重折叠的样品（即，10 毫磷酸钠pH为6.5 ，10 毫的MgCl 2 ）。
使用Amicon 3,000 MWCO 将未修饰的酵母tRNA Phe 样品在NMR缓冲液中浓缩至约1.5-2.0 mM，在我们手中，经过10 ml转录，在Us 和Gs 上标记15 N- ，通常可以得到最终的NMR样品300 微升在〜1.8 毫（即，0.5-0.6μ 摩尔）。
将样品储存在-20 °C或直接用于NMR光谱测量（请参阅注2）。

B 通过在大肠杆菌中体内重组表达生产修饰的酵母tRNA Phe

修饰的酵母tRNA Phe 重组表达与提取
转化E. 大肠杆菌与tRNA的表达质粒和15 的N-标签编表达
下文提到的体积和数量是指1 L 培养物，我们建议种植数升培养物（即2-4 L），以增加按照本方案纯化的经修饰的酵母TRNA Phe 的数量，我们还建议种植500 Ml在2 L烧瓶中进行培养以获得足够的氧合，或者理想情况下使用发酵罐优化某些参数（例如，培养基的pH值，氧合...）。

使用100μl 等分的电感受态大肠杆菌JM101Tr菌株，加入2μl 质粒（50-200 ng / μl ）。
混合在将电穿孔杯中，电穿孔细胞，与机器设置为根据电比色皿和有机体被使用（即设置的电穿孔以“EC2”意“ 大肠杆菌0.2 1cm比色皿”），然后加入1毫升LB培养基，在37°C下孵育30分钟。
划分1.1毫升转化产物的两种，并直接倒每一半到含有0.5升的2个锥形烧瓶15 的N-标签编富生长培养基（即光谱9）补充有0.5克15 的N-标签编celtone 基础粉末50μg/ ml氨苄青霉素（总培养体积为1 L）。
使细菌在37 °C下生长〜20 h 。
通过以5,000 xg离心20分钟来回收细菌。
总小RNA提取
在50 ml锥形管中，用10 ml提取缓冲液重悬沉淀。
加入10毫升的水饱和苯酚，在室温下在试管旋转器上轻轻混合1小时。
在20°C下以8,000 xg离心30分钟。小心回收水相，该水相对应于位于苯酚相上方的上层相。
在苯酚相中加入1 ml提取缓冲液进行反萃取，轻轻混合15分钟，在20°C下以8,000 x g离心30分钟，然后小心地回收水相。
向步骤B1biii和B1biv的合并水相中添加0.1体积的5 M NaCl 和2体积的无水乙醇。
剧烈涡旋，然后在4°C下以8,000 xg离心20分钟。弃去上清液。
将沉淀重悬于5 ml 1 M NaCl中。在4°C下以8,000 xg离心30分钟。
回收浓缩物，并加入2.5体积的无水乙醇。
在4 °C下以8,000 xg 再次离心30分钟。所有小RNA现已浓缩。
在2 ml 2 M Tris-HCl pH 8.0中重悬沉淀，并在37°C下孵育3 h，以完全脱除tRNA 的3 ' 末端。
加入2体积的无水乙醇剧烈振荡，然后在4 °C下以8,000 xg离心30分钟，以沉淀脱酰基的RNA 。
将沉淀溶于5 ml纯化缓冲液C中。样品已准备就绪，可用于纯化步骤（步骤B2）。
修饰的酵母tRNA Phe 纯化和NMR样品制备
开始纯化之前，请使用0.5 M NaOH 洗涤纯化系统，环路和色谱柱，并用水彻底冲洗，以使其在无RNase的条件下工作。
凝胶过滤色谱
将5 ml样品（在步骤B1结束时获得）以0.5 ml / min的速度加载到事先用纯化缓冲液C平衡过的HiLoad 26/600 Superdex 75 pg 色谱柱上。
以0.5 ml / min的速度洗脱，每馏分收集3.5 ml。
凝胶电泳法鉴定含有酵母tRNA Phe 的馏分
设计一个DNA寡核苷酸序列，其与过表达的酵母特异性互补的tRNA 的Phe ，而不是在其他保守的大肠杆菌的tRNA 。在我们手中，它工作得很好，当互补的DNA寡核苷酸包括反密码子臂和D-和TψC的零件-臂（请参阅图2A）。
在0.2 ML- 微管，混合5 微升的每个级分用1 微升互补的DNA寡核苷酸（股票，在100μM）的，或具有1 微升水（阴性对照）的。
在干浴培养箱中于95°C加热样品2分钟，然后在冰上冷却。
添加6 微升的2×的的Laemmli 负载缓冲液样品中。
制备14％的SDS聚丙烯酰胺凝胶：对于分离胶，混合1.75毫升40％的丙烯酰胺/的双-丙烯酰胺（19：1）溶液，1.875毫升1 M的的Tris-HCl pH值8.8，25 微升的20％（重量/ v）的SDS并调节至5毫升water.Add 40 微升的10％APS和5 微升TEMED的只是在总height.For积层凝胶的2/3浇注在玻璃板之间凝胶之前，混合500 微升的40％的丙烯酰胺/ 双丙烯酰胺（19：1）的溶液，630 微升的1M的Tris-盐酸pH为6.8，50 微升的20％（W / v）SDS和调整至5ml与water.Add 40 微升10％的甲PS和5 微升TEMED的刚浇在聚合分离gel.Put紧接在10孔梳的顶部的凝胶之前。
将样品加载到14％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，在200 V的1x TGS缓冲液中迁移约1 小时30 分钟。
用甲苯胺蓝染色可视化级分中的RNA（如步骤A2c中所述）。在存在互补DNA寡核苷酸的情况下，可以通过较高分子量的附加条带的出现来轻松鉴定含有目标tRNA 的级分（（图2B）。
离子交换色谱
合并来自步骤B2b的包含步骤B2c中鉴定的酵母tRNA Phe 的馏分。
将池加载到事先用纯化缓冲液C平衡过的Mono Q 10/100 GL色谱柱上。
在30 CV上以2 ml / min的速度从45％到60％的缓冲液D梯度洗脱，收集1.5 ml的馏分。
如步骤B2c中所述，通过凝胶转移测定法鉴定含有酵母tRNA Phe 的馏分，并合并目标馏分。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903018--1435 Pierre Barraud 813029 \ Figs jpg \ figure2.jpg

图2.使用互补DNA寡核苷酸进行的凝胶位移分析A. 用于鉴定纯化级分中酵母tRNA Phe 的互补DNA寡核苷酸的示意图，确切的序列在材料和试剂列表中给出。用甲苯胺蓝染色显示的Mono Q柱洗脱步骤的馏分（＃1-＃4）进行的14％SDS-PAGE位移分析，可以轻松鉴定出含有目标tRNA （即酵母tRNA Phe ）的馏分与没有互补DNA寡核苷酸的对照样品相比，在存在互补DNA寡核苷酸（标有星号）的情况下，在较高分子量下出现附加带。

疏水作用色谱
在步骤B2d的合并馏分中加入硫酸铵以达到1.7M的最终浓度。通过涡旋溶解盐。
将该样品以0.5 ml / min的浓度加载到事先用纯化缓冲液E平衡过的Phenyl superose HR 10/10色谱柱上。
在15 CV上以0.5 ml / min的速度从20％到45％的缓冲液C 梯度洗脱，收集2.5 ml的馏分。
如步骤B2c中所述，通过凝胶转移测定法鉴定含有酵母tRNA Phe 的馏分，并合并目标馏分。
脱盐样品
脱盐样品与的HiPrep 预先用NMR平衡26/10脱盐柱缓冲液或广泛透析样品靠在NMR buffer.For的是，人们通常dialyzes针对至少2小时的2L透析溶液样品，并用它改变新鲜溶液3次。

样品浓度
浓缩该修饰的酵母的tRNA 的Phe 在NMR样品缓冲至〜0.2-0.5 毫使用的Amicon 3000 MWCO。在我们手中，用2L的培养在15 的N-标签编富媒体，一个通常获得250的最终NMR样品微升在〜0.4 毫米（即，0.08-0.12μ 摩尔）。

将样品储存在-20 °C或直接用于NMR光谱测量（请参阅注2）。

笔记

由于Dégutet al。（2016）之前已经详细介绍了该方法和方案，因此本步骤中未介绍克隆步骤。简而言之，在磷酸化和杂交步骤后，设计了五个DNA寡核苷酸以产生对应的DNA插入片段酵母的tRNA 的Phe 基因侧翼由对应于突出端的EcoRI 和PstI位在5限制序列' - 和3 ' - 末端，分别（见图3）.The pBSTNAV 载体线性化的EcoRI 和PstI位并进行结扎古典协议。如Dégut 等人（2016）所述，可以使用SmaI 进行反选择步骤以增加带有酵母tRNA Phe 基因的阳性克隆的数量。通过测序检查阳性克隆。

用于在pBSTNAV中克隆酵母tRNA Phe 基因的寡核苷酸：

寡核苷酸＃1：5 ' AATTCGCGGATTTAGCTCAGTTGGGAGAG 3 '

寡＃2：5 ' CGCCAGACTGAAGATCTGGAGGTCCTG 3 '

寡＃3：5 ' TGTTCGATCCACAGAATTCGCACCACTGCA 3 '

寡聚＃4：5 ' GTGGTGCGAATTCTGTGGATCGAACACAGGACCTCCAGA 3 '

寡核苷酸＃5：5 ' TCTTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCGCG 3 '

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903018--1435 Pierre Barraud 813029 \ Figs jpg \ figure3.jpg

3.示意图图的克隆区域的PBSTNAV 向量和编码序列的酵母的tRNA 的Phe 插入之间的EcoRI 和PstI位限制位点。在PBSTNAV ，强组成LPP 启动子上游的中的tRNA 基因可以导致高水平的重组转录物的生产.The 5个寡核苷酸用于生成酵母的tRNA 的Phe 编码本身quence（寡核苷酸＃1〜＃5）的标签上的图ED和具有不同颜色的，为了清楚起见显示。

对于按照当前方案生产的酵母tRNA Phe 样品，我们在带有5mm Shigemi 管的Bruker AVIII-HD 600 MHz和AVIII-HD 700 MHz（配备TCI 5-mm低温探针）上测量了NMR光谱。在38 ℃下在NMR缓冲液（10 毫摩尔磷酸钠pH6.5的10 毫摩尔的MgCl 2 补充有5％）（v / v）d 2 可以明显地也可使用O.其它类型的核磁共振波谱仪和/或NMR管。
菜谱

用于通过体外转录生产未修饰的酵母tRNA Phe
20x T7转录缓冲液（TB）
1 M Tris-HCl pH 8.0 4毫升

100 mM 亚精胺1 ml

1 M DTT 0.5毫升

Triton TM X-100 10 微升

H 2 O至10毫升

以-20摄氏度的温度以1毫升等分试样的形式保存长达1年

2x RNA加载染料
尿素800万

0.01％（w / v）溴酚蓝

0.01％（w / v）二甲苯氰醇

储存在-20°C下，每份1 ml

甲苯胺蓝染色液
Ť Oluidine蓝，0.5 G

È THANOL 200毫升

Ç oncentrated乙酸5毫升

H 2 O至500 ml

商店在室温下

纯化和NMR缓冲液
缓冲液A

25 mM 磷酸钠pH 6.5

50 毫米氯化钠

5 毫米MgSO 4

0.22 微米过滤

缓冲液B

25 mM 磷酸钠pH 6.5

1 M 氯化钠

0.22 微米过滤

NMR缓冲液

10 mM 磷酸钠pH 6.5

10 毫米MgCl 2

用于p roduction 修饰的酵母的tRNA的苯丙氨酸通过体内重组表达在大肠杆菌
提取缓冲液
1 毫米Tris-HCl pH 7.4

10 毫米醋酸镁

2个Laemmli 加载缓冲区
125 mM的Tris-HCl pH 6.8

20％（v / v）甘油

4％（w / v）SDS

10％（v / v）2-巯基乙醇

0.004％（w / v）溴酚蓝

纯化和NMR缓冲液
缓冲液C

25 mM 磷酸钾pH 6.5

0.22 微米过滤

缓冲液D

25 mM 磷酸钾pH 6.5

1 M 氯化钠

0.22 微米过滤

缓冲液E

25 mM 磷酸钾pH 6.5

1.7 M（NH 4 ）2 SO 4

0.22 微米过滤

NMR缓冲液

10 mM 磷酸钠pH 6.5

10 毫米MgCl 2

致谢

这项工作得到了ANR NMR维生素Amin （ANR-14-CE09-0012），CNRS，巴黎大学和Labex DYNAMO（ANR-11-LABX-0011）的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考文献

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