材料和试剂

1. 10厘米组织培养板（康宁，目录号：430293）。

2. 1.5毫升微量离心管（美国科学公司，目录号：1615-5510）。

3. 15毫升锥形管（Thermo Scientific，目录号：339651）。

4. 豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶(Sigma-Aldrich，目录号：T5398)

5. MOPS [3-(N-吗啉基)丙磺酸] (Sigma-Aldrich，目录号：M1254)

6. 生物素-戊基胺（EZ-LinkTM戊基胺-生物素）（Thermo Scientific，目录号：21345）。

7. 生物素-TVQQEL（又名A25肽）（Zedira，目录号：B001）。

8. 罗氏全套蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma，目录号：11697498001）。

9. 二硫苏糖醇（DTT）（Sigma，目录号：D9163）。

10. PMSF（苯基甲烷磺酰氟）（Sigma，目录号：78830）。

11. Western印迹材料

a. 4-12%聚丙烯酰胺凝胶（Thermo Scientific目录号：NW04120BOX）。

b. 迷你凝胶罐（Thermo Scientific目录号：A25977）。

c. 硝酸纤维素或PVDF膜

d. 电泳转移装置（GE Biosciences TE-22）。

12. 三(羟甲基氨基甲烷)碱(Fisher，目录号：BP152-500)

13. HMGB1(高流动性群盒蛋白1；Genscript，目录号：Z02803)

14. PBS（磷酸盐缓冲盐水）（Thermo Scientific，目录号：10010049）。

15. 氯化钠(Sigma-Aldrich，目录号：S7653)

16. 乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma，目录号：E9884)

17. 脱氧胆酸钠(Sigma，目录号：D6750)

18. 十二烷基硫酸钠(SDS)(Sigma，目录号：L3771)

19. NP-40（又名Igepal CA-630）（Sigma，目录号：I8896）。

20. 甘油(Sigma，目录号：G6279)

21. 链霉菌素-马-萝卜过氧化物酶(Streptavidin-HRP)

22. 蛋白酶抑制剂25倍液（见配方）。

23. 二硫苏糖醇(DTT)1M原液(见配方)

24. 交联反应缓冲液(见配方)

25. TG2重组缓冲液（见配方）。

26. 修改后的RIPA缓冲区（见配方）。

27. 6x SDS加载缓冲液（见配方）。

28. Tris/SDS pH 6.8（见配方）。

装备

1. 孵化器或加热块（Fisher Scientific，目录号：88-860-022）。

2. 电泳转移装置（GE Healthcare，目录号：TE-22）。

3. 冷藏台式离心机（Eppendorf，型号：5424R）。

4. 用于运行凝胶的凝胶盒（迷你凝胶罐）（Thermo Scientific，目录号：A25977）。

5. 平台振动器（VWR，目录号：10127-876）。

6. 组织培养箱（Thermo Scientific，型号：Steri-CycleTM i160）。

7. Western blot成像设备（胶片+显影机、Chemi-Doc、Licor等）。

流程

A. 细胞裂解液的制备

1. 从组织培养培养箱中取出细胞，并置于冰上。对于在10厘米板中生长的粘附细胞，丢弃组织培养基，用5毫升冰冷的PBS冲洗细胞单层两次。对于悬浮细胞，继续到步骤A3。

2. 虽然保持板（S）在冰上，加入1毫升冰冷的PBS，刮和转移分离的细胞在冰上预冷的微量离心管。

3. 收获细胞，在2,000 xg离心5分钟，在4℃下。丢弃PBS上清液。

4. 通过轻轻重悬细胞颗粒在适量的冰冷的改性RIPA裂解缓冲液（一般为一个10厘米板的50-70％汇合细胞200-500微升），并在冰上孵育10分钟。

5. 可选：如果细胞裂解在缓冲液中，释放染色质从核，超声将是必要的，以减少样品粘度。保持细胞裂解液在冰上，超声与3-5 1秒脉冲在50％的输出。

6. 离心裂解物在15,000 xg离心5分钟，在4℃下，以颗粒任何不溶性的细胞碎片。

7. 将上清液转移到新的微离心管中，在冰上预冷，并根据制造商的说明，通过双辛酸（BCA）检测评估蛋白质浓度。

B. 体外TG2的交联反应

1. 重组冻干的TG2酶在4 U/ml（= 4 mU/µl）在TG2重组缓冲液。对于1个单位小瓶的TG2，用250微升的缓冲液重组，最终浓度为4 U/ml。放在冰上，同时设置交联反应。

2. 准备体外交联反应，通过添加试剂在下面列出的顺序到微量离心管。TG2酶的浓度，总的反应体积，和底物浓度应优化为每个应用程序。一些典型的试剂在反应缓冲液中的最终浓度如下所述。

a. 含蛋白酶抑制剂的反应缓冲液

b. 交联底物：细胞裂解液（0.25 µg/µl）或纯化的重组蛋白（10-20 ng/µl）。

c. TG2酶(0.05-1.0 mU/ml)

d. 氯化钙（2-5毫摩尔）

3. 将反应在37℃下孵育60分钟。

4. 通过加入SDS-PAGE加载缓冲液至1倍浓度来淬灭交联反应，然后在95℃加热块上加热5分钟。

5. 通过SDS-PAGE评估样品的蛋白质交联情况，然后进行Western印迹。

当使用体外交联反应测试新的潜在TG2底物时，阳性和阴性对照也很重要。使用先前建立的交联底物作为阳性对照，将确保反应按预期工作。任何具有已知TG2底物活性的市售蛋白质都可以使用，但有一点需要注意；蛋白质应该同时具有谷氨酰胺和赖氨酸交联位点。否则就需要加入一种只有谷氨酰胺供体位点和赖氨酸受体位点的蛋白质的混合物，以确保交联的发生。我们的实验室通常使用重组Y-box 1 (YB-1)蛋白，它同时含有谷氨酰胺和赖氨酸交联位点，并且可以在体外与自身交联(Willis等人，2013年和未发表的数据)，或者HMGB1，它只含有赖氨酸接受位点，但在体外与TG2的谷氨酰胺636交联(Willis等人，2018年)。

C. 基质结合检测

对于底物结合检测，纯化的重组蛋白与TG2酶孵育，如上所述，但在生物素-戊基胺（BP），TG2赖氨酸供体底物，或生物素-TVQQEL（A25肽），TG2谷氨酰胺供体底物的存在。然后将反应混合物在SDS-PAGE上进行尺寸分馏，并通过Western印迹分析底物与链霉菌素-HRP的结合情况。

反应的设置方式与上述TG2交联反应类似。

1. 重组冻干的TG2酶在4 U/ml的TG2重组缓冲液。放置在冰上，同时设置底物结合测定。

2. 设置底物加入反应，通过添加试剂到微量离心管中，他们在下面列出的顺序。

a. 含蛋白酶抑制剂的反应缓冲液

b. 纯化的重组蛋白交联底物(10-20 ng/µl)

c. BP或A25肽(2mM)

d. TG2酶(1.0 mU/ml)

e. 氯化钙（2-5毫摩尔）

3. 在37℃下孵育60分钟。

4. 停止反应，通过加入浓缩的SDS加载缓冲液至最终的1倍浓度，并在95℃下加热5分钟，在加热块上。样品准备通过SDS-PAGE分离。

数据分析

1. TG2交联反应。

在SDS-PAGE上运行并通过Western印迹分析。TG2底物蛋白将显示出一个大小转移，通常在凝胶顶部附近形成一个较慢的迁移，较高分子量的变体（或变体）。这通常伴随着单体底物的信号降低（Willis等人，2013和2018）。图2所示为以重组HMGB1为底物的交联反应的代表性数据。

图2.体外TG2交联反应的代表性Western blot结果。代表性的Western印迹结果为体外TG2交联反应。在纯化的重组HMGB1（rHMGB1）交联底物（20 ng/µl）的存在下，TG2酶（0.2 mU/µl）在37℃下孵育60分钟（车道3）。分别将仅含TG2和仅含重组HMGB1的对照品装入车道1和2中。请注意，在车道3中，约29 kDa HMGB1信号相对于车道2减弱，这与凝胶顶部附近的交联HMGB1低聚物的形成相吻合。在4-12%聚丙烯酰胺凝胶上分离样品，转移到硝酸纤维素膜上，用HMGB1抗体进行探针检测。

2. 基质结合试验。

对于底物整合检测，使用纯化的重组蛋白底物的反应系统有利于通过Western印迹直接分析结果。存在生物素阳性信号在预期的分子量为感兴趣的底物表示生物素化探针被纳入底物。较慢的迁移/更迟钝的信号表明存在多个谷氨酰和/或赖氨酰交联位点，因为随着纳入的探针分子数量的增加，带状迁移更迟钝（见Willis等人，2018）。也可以从凝胶中切除蛋白质，并通过质谱法绘制特定的交联位点，如Willis等人，2018年指出。

该检测也可以在原位进行，将活细胞与膜渗透性生物素化探针孵育（Willis等，2018）。在细胞裂解后，生物素标记的候选底物可以用链霉菌素珠分离;通过Western印迹鉴定底物可以被解释为（在适当的对照背景下）阳性结果。另外，蛋白质可以从链霉菌素珠中洗脱出来，并进行质谱分析以确定分离的蛋白质的身份。

笔记

1. 细胞裂解液、TG2酶和/或生物素化探针的浓度范围可以使用。最终浓度应根据经验确定。注意，较高浓度的生物素化探针已被证明具有抑制剂的功能(Lorand等，1992)，因此应注意不要使用过高浓度的标记探针。

根据转酰胺化底物的丰度和其他因素，应使用和不使用生物素标记的探针测试一系列TG2酶和蛋白质底物组合。

虽然重组后的TG2在4℃下储存至少几周后仍能保持酶的活性，但最好在当天就重组并使用新鲜的酶。

如果感兴趣的蛋白质底物包含多个转酰胺供体位点，共价加入一些探针将导致SDS-PAGE上的大小移动，与加入的探针分子数量成正比。

2. 体外交联反应的重要对照。

a. 无TG2酶：仅反应输入（细胞裂解液或重组蛋白）。[对于内源性转酰胺活性较高的细胞或组织裂解液，应通过加入2mM EGTA（钙螯合剂）或10mM碘乙酰胺（不可逆的TG2转酰胺抑制剂）来抑制]。

b. TG2酶只。

c. 无底物：包括缺乏纯化的重组底物的反应，或细胞或组织裂解物来源的细胞或组织裂解物，其中没有表达或表达的putative substrate被敲除。

食谱

1. 蛋白酶抑制剂25倍液

a. 将1片罗氏完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片溶于2毫升蒸馏水中。

b. 小量等分试样在-20℃下保存

2. 二硫苏糖醇(DTT)1M原液。

a. 称取1.54克DTT，加入到15毫升的锥形管中。

b. 加入蒸馏水10毫升，完全溶解。

c. 小量等分试样在-20℃下保存

3. 交联反应缓冲液

注：实验当天新鲜制备；*使用前立即添加PMSF和DTT。

50mM MOPS，pH值7.5。

0.2mM PMSF*

1mM DTT*

1x 蛋白酶抑制剂（罗氏完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。

4. TG2重组缓冲液

注：实验当天新鲜制备；*使用前立即添加DTT。

50mM MOPS，pH值7.5。

300 mM氯化钠

0.5mM EDTA

10mM DTT*

5. 修改后的RIPA缓冲区

注：配制后可在4℃保存；*使用前立即加入蛋白酶抑制剂、PMSF和DTT。

50mM MOPS，pH7.5。

150mM氯化钠

0.5%脱氧胆酸钠

0.1% SDS

1% NP-40

0.2mM PMSF*

1mM DTT*

1x 蛋白酶抑制剂（罗氏完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。

6. 6x SDS加载缓冲液（配方为20毫升）。

注：提前做好准备，在-20℃下分小等份保存。

14 毫升 Tris/SDS pH 6.8

6.0毫升甘油

2克 SDS

1.86克DTT

7. Tris/SDS pH值6.8（用于制作6倍的SDS装载缓冲液

注：提前准备，常温保存。

50毫升1M Tris，pH值6.8。

4 毫升 10% SDS

46毫升dH2O

参考文献

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