材料和试剂

1. MF MilliporeTM膜过滤器，0.22µm孔径（默克公司，目录号：GSWP04700）

2. 感兴趣的蛋白质

待测蛋白质必须经过纯化和浓缩，然后稀释到流动缓冲液中。其中一种需要检测其相互作用的蛋白质必须含有组氨酸标签，而另一种则不需要组氨酸标签。

笔记：

a。在任何情况下都必须调整蛋白质浓度：在这个方案中，我们提供了一个工作蛋白浓度得到优化的具体例子。作为起点，我们建议使用两种不同的蛋白质浓度（例如，50nm和500nm）。一系列稀释液可以在随后的实验中进行测试。

b。考虑要标记哪个蛋白质：考虑哪种蛋白质将被固定在芯片表面（配体），哪一种会流过（分析物）。许多因素会影响固定化的选择，如纯度、可用量、化学计量和理论反应。理想情况下，这两种蛋白质都可以被标记和未标记，并且两种方向都可以被检测。还应考虑是否将六组氨酸标签放置在蛋白质的N-端还是C-端（例如，如果预测蛋白质会在C-端附近结合，则应将蛋白质连接到N-端的芯片上）。同样重要的是，未标记的蛋白质不能直接与芯片结合。

3. HEPES（梅尔福德，目录号：H75030-1000.0）

4. 氯化钠（默克公司，产品目录号：1064041000）

5. 吐温®20（默克，产品目录号：P9416-100ML）

6. NiCl26H2O（默克公司，产品目录号：203866-5G）·

7. EDTA（VWR化学品，目录号：20302.260）

8. NaOH（默克公司，产品目录号：221465）

9. 运行缓冲区（见配方）

10. 0.5 mM NiCl2（见配方）

11. 再生溶液（见配方）

设备

1. BiacoreTM T200 SPR仪器（GE Healthcare，目录号：28975001）

注：此方法可用于不同的仪器：虽然本文介绍的方法是使用BiacoreTM T200 SPR仪器实现的，但它可以适用于任何SPR仪器。

2. BiacoreTM传感器芯片系列S NTA（GE Healthcare，目录号：28994951）

注：可以使用不同品牌的NTA芯片：我们使用GE Healthcare NTA芯片。然而，这种方法可以使用任何兼容的NTA芯片。

3. Direct Detect®红外光谱仪（默克公司，目录号：DDHW00010-WW）

注：可以使用不同的方法来测量蛋白质的浓度：由于我们在示例中使用的一些蛋白质不含芳香族残基，因此我们使用Direct Detect®红外光谱仪测定浓度。但是，也可以使用其他标准方法，如布拉德福德或280 nm处的吸光度。此外，His标记蛋白的浓度不一定要知道，因为它们的浓度可以通过结合到芯片上的反应来评估。

软件

1. BiacoreTM T200评估软件（GE Healthcare）

2. R studio（R核心开发团队，2018年），采用ggplot2软件包（Wickham，2016年）

程序

对于所有的实验，将NTA芯片连接到SPR仪器中，并用运行缓冲区对其进行预处理。对接前，NTA芯片需要在室温下平衡10-30分钟，以防止冷凝。一旦对接，有四个流动单元可与Biacore T200一起使用。在本实验中，使用两个这样的流动细胞，流动细胞1作为参考（FCref），没有固定化-d配体和流动细胞2作为测试细胞（FCtest）。对于所有实验，在试管中装入适当量的溶液，并按照BiacoreTM T200控制软件中的详细说明放置在机架中。

注：将参考单元格留空：在本方案中，参考流池为空白，分析物注入两个池中，这将显示分析物与芯片的任何非特异性结合，随后将从最终结果中减去。理想情况下，分析物与芯片表面的结合很少或没有。

A、配体蛋白的制备

该方法使用六组氨酸标记的蛋白质（Magnaporthe oryzae AVR-Pik，在我们的例子中为C-末端标记），它被捕获到标准NTA芯片的表面（图1）。我们纯化了Maqbool等人描述的蛋白质。（2015）和De la Concepcion等人。（2018年和2019年）。

图1。结合实验的四个步骤的动画表现和实例结果。（1）用镍激活NTA芯片。（2）他标记的蛋白质配体和芯片的结合。（3）蛋白质分析物的结合。（4）用EDTA再生芯片，去除一切束缚，重新开始循环。步骤1和2仅在流动池2上执行，而步骤3和4在两个流动单元上执行。所示的传感器图代表减去的FC2-1传感器图的典型轨迹。

1. His标记（配体）蛋白稀释液的制备

测量将固定在芯片上的蛋白质浓度，并在缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5）中稀释，以获得2 ml 2μM的储备溶液。

注：储备溶液可能因实验而异：在我们的例子中，我们准备的储备溶液的数量比需要的大。这是因为在这个例子中使用的蛋白质可以大量生产，是稳定的，并且可以在冰上保存几天。如果待测蛋白质产量不足和/或不稳定，我们建议每次运行前准备一份体积较小的新鲜储备溶液。

2. 配体蛋白工作液的制备

从储备液中取25μl，用975μl流动缓冲液稀释，得到50nm的稀释度。配体溶液的体积将根据设置的循环次数而变化，并由BiacoreTM T200 SPR控制软件指示。

B、手动运行以估计固定在芯片上的蛋白质量

一旦准备好作为配体的蛋白质，通过手动操作来测试与芯片的结合。在我们的实验中，我们的目标是对每个要测试的配体使用250±50个响应单元（RU）的最终捕获水平。

注：配体RUs值：在本实验中，我们的目标是配体固定化水平为~250ru，该值足以产生足够大的响应，即使对于较弱的粘合剂也可以测量。这个值是通过数据分析部分的Rmax计算选择的，得到的理论响应和这两种蛋白质的分子量和芯片上固定的His标记蛋白的量有关。因此，我们首先建议确定每个配体的最佳固定化水平。如果配体的结合水平与期望的RU相差太大，可以通过降低或增加工作溶液中配体的浓度来校正。如果要测试多个His标记的蛋白质，则需要针对每个蛋白质优化在芯片上捕获的浓度。

1. 选择流动单元

使用流动池1和2进行实验。配体被捕获在流动池2中，分析物被注入两个流动池中。最后的结果（传感器图）是从流动池2 min cell 1（FC2-1）减去响应。

2. 芯片激活

以30μl/0μl的流速注入30μl/l的芯片。此步骤仅适用于流动池2。

3. 配体的固定化

以30μl/min的流速将30µl C-末端His标记的AVR-Pik注入流动池2中。与芯片表面的Ni2+结合的记录为（RU）。另外一项检查应该在不使用NiCl2激活的情况下进行，以确保蛋白质不会非特异性结合到芯片表面。

4. 再生

在两个流动池中注入30μl 0.35 M EDTA，流速为30μl/min，去除芯片上的任何物质，使传感器芯片再生。

C、蛋白质分析物的制备一旦手动操作完成且每个配体与芯片的结合量约为250±50 RUs，则制备蛋白质分析物的工作稀释液。在我们的例子中，我们生产了纯化的Pik-HMA结构域，如De-la-Concepcion等人所述。（2018年和2019年）。

1. 分析蛋白原液稀释液的制备

测量蛋白质浓度后，在缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5）中稀释，以获得2 ml储备溶液，如上文所述，用于蛋白质配体。

2. 分析蛋白工作液的制备

连续稀释蛋白质储备，以获得4nm、40nm和100nm的最终浓度。总容积取决于循环次数，并由BiacoreTM T200 SPR控制软件指示。

注：调整分析物工作浓度：分析物的工作浓度在每种实验情况下都会有所不同，这取决于蛋白质之间相互作用的强度。我们建议从50nm和500nm的浓度开始寻找合适的浓度。理想情况下，应在结合饱和的情况下使用最高浓度，以测试最强的相互作用。

D、设置循环参数和Rmax运行

在实验中，将芯片固定在仪器中，并用运行缓冲区对其进行预处理。我们在25°C下进行实验，但样品在4°C下储存。我们使用30μl/min的流速。

注：调整实验温度和流量：最佳温度和流速可根据待测蛋白质的不同而变化。该协议使用的参数是标准的，但有些蛋白质可能需要不同的温度和/或更高的接触时间（通过较低的流速实现）才能成功地相互作用。同样，蛋白质储备可在4℃下储存的时间取决于蛋白质。作为标准，我们不建议冻融蛋白质小份（最好使用一次性小份蛋白质）。

每个实验循环包括4个步骤，如下所述，如图1所示。这个循环可以自动重复多次，使用不同浓度的分析物在不同的配体上测试。

1. 芯片激活

第一步，在流动池2上注入流速为30μl/min的0.5 mM NiCl2溶液以激活芯片。

2. 配体固定化

芯片激活后，将His标记的蛋白质（配体）注射到流动细胞2（FCtest）上进行测试（在我们的例子中，C-末端标记AVR-Pik效应器）。60秒作为注射时间，以在该浓度下获得所需的响应。在配体固定化后，缓冲液流过FC1和FC2，以确保任何非特异性的his标记蛋白被去除，并在分析物注射前达到稳定的基线。

3. 分析物注入

一旦配体与芯片表面结合，在两个流动池（FCref和FCtest）上注入给定浓度的测试分析物（或仅限缓冲液控制）。以120 s的接触时间为标准，以确保最大浓度（理想情况下）达到稳定状态。注射蛋白质后，系统切换回缓冲液流，结合蛋白将开始解离。一般来说，120秒的缓冲液只能用来观察这种分离。由于通常更紧密的相互作用需要更长的时间才能分离，因此感测图的这一区域可用于评估分析物蛋白质之间的差异。

4. 切屑再生

将分析物注入流动池后，以30µl/min的流速将0.35 M EDTA的再生溶液通过两个流动池（FCref和FCtest）。这将从芯片中剥离Ni2+和与之结合的蛋白质。在该步骤之后，响应应返回到与步骤D1之前的水平相似的水平。

对于每个分析物，我们在4 nM、40 nM和100 nM的工作浓度下设置每个循环的3个重复。此外，仅使用缓冲液作为分析物进行两次启动循环。11个循环的总运行时间约为4小时，每个配体被测试，一旦启动，不需要进一步的用户干预。涉及不同配体和分析物的多个运行可以在一次运行中堆叠在一起。

实验完成后，NTA芯片可以从仪器中取出，并在4℃的缓冲液中储存，直到下次使用。该芯片可以多次重复使用，用于不同的实验。每次芯片被重复使用时，镍和他的标记蛋白的捕获量都会被检查。只要这是预期的，芯片可以再次使用。在极少数情况下芯片失效，很明显镍和他的标记蛋白不再被捕获。

数据分析

为了比较多个循环之间的结果，必须根据不同蛋白质的分子量，通过校正不同的捕获水平对数据进行标准化。为此，计算每次运行分析物饱和时的理论最大结合（Rmax）值（Buckle，2001；Majka和Speck，2007）。这个值以响应单元（RU）度量，这就是绑定事件在SPR中的记录方式。其计算公式如下：

Mw是与芯片（配体）结合的蛋白质分子质量，蛋白质流过芯片（分析物）。通过蛋白质之间结合的化学计量学和固定在芯片表面的配体数量作为响应单位（RU）来纠正这一点。

注：例如，如果结合化学计量比为2:1分析物：配体，则与假设1:1结合相比，最终%Rmax可能高于100%。如果化学计量学不为其他技术所知，我们建议假设为1:1结合，如果最终结果表明不是这样，则进行校正。

一旦我们为每次运行建立了Rmax，我们可以将绑定级别表示为Rmax的百分比，计算如下：

式中，RUmax是在分析物注射结束后立即测量的结合反应，用响应单位（RU）表示。

关于Pikm-HMA和AVR-PikD（1:1结合化学计量学）之间结合的结果，见De la Concepcion等人。（2018年和2019年），计算如下（表1）：

表1。从De la Concepcion et al.中提取的RMax计算的结合值示例。（2018年）

配体

分子量（配体）

分析物

MW（分析物）

浓度分析物（nM）

钌捕获（配体）

最大值

钌捕获（分析物）

%RMax最大

AvrD公司

11786.3

皮公里

8536.9

0

299.58

217.0

-1.54

-0.7

AvrD公司

11786.3

皮公里

8536.9

4

301.43

218.3

35.89

16.4

AvrD公司

11786.3

皮公里

8536.9

40

301.17

218.1

146.33

67.1

AvrD公司

11786.3

皮公里

8536.9

100

301.26

218.2

158.59

72.7

为了可视化，导出SPR数据并使用Rv3.4.3绘制它(https://www.r-project.org/)以及函数ggplot2（Wickham，2009）。SPR盒图如De la Concepcion等人所示。（2019年）可生成如下：

1. 数据集准备

我们首先准备数据集以生成图形。我们指定了一个样本名称和一个位置，对应于作为配体的效应器（分别为1、2、3和4代表AVR-PikD、AVR-PikE、AVR-PikA和AVR-PikC）。当我们分别生成各自的图表时，我们标注了每个数据集的分析物浓度（4、40和100 nM）。Rmax对应于上述计算值。属于每个生物复制的数据分别按1、2和3排序。两种待比较的分析物（本例为野生型Pikp-HMA和Pikp-HMANK-KE）在HMA中被划分为A或B。

样本效应器Conc Rmax Replica HMA

名称1 40 67 1 A

名称B 140 66.6 1 B

2. 盒形图的生成

a、我们附加了数据集，并将X和Y轴上的因子定义为：

>图形<-ggplot（数据集，aes（x=因子（效应器），y=Rmax））

b、然后我们定义了每种分析物和不同生物复制品的颜色：

>colori2=c（“#8faadc”，“#c9a9ff”）

>颜色3=c（“#ff85ff”、“#00b4b5”、“#f8f300”）

c、图形的AESTERIC参数定义如下：

图形+几何框线图（aes（x=系数（效应器），y=Rmax，填充=系数（HMA）），位置=位置减淡（宽度=0.9），lwd=0.3，脂肪=4，离群值.shape=21，离群值.size=0.7，异常值。笔划=0)+scale_fill_manual（值=colori2）+主题_bw（）+主题(panel.grid.major面板=元素_blank（），面板.网格.次要=元素_blank（），面板.背景=元素矩形（fill=“transparent”），rect=元素矩形（fill=”transparent“）+缩放连续（breaks=seq（0,70,10），limits=c（0,70））+几何点（aes（x=因子（效应器），y=Rmax，fill=factor（HMA），colour=因子（replicate）），position=位置抖动(抖动。宽度=0.7条，抖动。高度=0, dodge.width=0.9），尺寸=0.7，形状=16）+秤颜色手册（值=颜色3）

d、最后，我们使用以下命令生成图形图像：

ggsave（'P-NK Rmax 35x3.png'，宽度=3.5，高度=3，dpi=300，bg=“透明”）

e、生成的图形将与下图类似（图2）：

图2。生成的Rmax表示结果。每个分析物（HMA A或B）与不同配体（效应器）结合的并排比较框图。每个配体的值的位置分布在X轴上，而计算的%Rmax值在Y轴上表示。中心线代表中值，框限为上下四分位数，晶须延伸至Q1-1.5×四分位间距（IQR）内的最大值，最小值在Q3+1.5×IQR内。所有的数据点都表示为每个生物复制的不同颜色的点（每个生物复制中有三个技术复制）。该图是根据De la Concepcion等人提出的结果生成的。（2019年）。

食谱

使用超纯水和分析级试剂制备所有溶液。使用前用0.22µm孔径的过滤器过滤所有溶液。溶液可在室温下储存。

注：该方案中的缓冲液已经针对特定的蛋白质子集进行了优化。运行缓冲液时，应根据缓冲条件，对感兴趣的蛋白质进行稳定处理。还必须包括相互作用所需的任何成分，例如溶液中是否存在金属。作为一个好的起点，我们建议使用标准浓度为150 mM的NaCl。

1. 运行缓冲器

20毫米HEPES pH值7.5

860毫米氯化钠

0.1%吐温®20

2. 0.5毫米NiCl2

a、在水中溶解0.24 g NiCl2·6H2O，制备10 ml 100 mM NiCl2储备溶液

b、使用前，将50μl储备液稀释到10 ml水中，制备0.5 mM NiCl2工作溶液

3. 再生液

a、将6.5 g EDTA溶解于50 ml水中制备0.35 M EDTA

b、必须用NaOH将pH值调节至8.0，以溶解EDTA

致谢

该协议已在johninnes中心生物物理分析平台上开发和实现。我们感谢朱莉娅·蒙迪（Julia.e。mundy@gmail.com网站)对于图1中的艺术作品。

班菲尔德实验室的研究得到了BBSRC（拨款BB/J004553、BB/P012574、BB/M02198X）、ERC（提案743165669926）和约翰·因内斯基金会的支持。J、 C.得到了约翰·因内斯基金会/约翰·因内斯中心/塞恩斯伯里实验室/厄勒姆研究所轮换项目的支持。本方案来源于De la Concepcion等人。（2018年和2019年）。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

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