材料和试剂

套件
高纯质粒分离试剂盒（Roche，目录号：11754777001）
Gene-Clean Turbo试剂盒（Q-BIOgene，货号：1102-400）

酵素
Pfu DNA聚合酶（Promega ，目录号：M7741）
T4 DNA连接酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0202L）
限制性酶Nhe I（新英格兰生物实验室，目录号：R3131S）
限制性内切酶Bsr GI（新英格兰生物实验室，目录号：R3575S）
限制酶Spe I（新英格兰生物实验室，目录号：R3133L）

化学品及其他消耗品
00:22 μm滤膜（默克，目录号：GSWP02500）
多孔微量滴定板，96 - 孔平底中（Falcon，目录号：353072）
50毫升塑料管（猎鹰）
2-ml离心管小号
1.5 ml微量离心管
铝箔
培养皿
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378-25G）
硫酸卡那霉素（罗氏（Roche），目录号：10106801001）
绝对乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：1009832500）
85％（v / v）g 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：1040942500）
NaCl（Merck，目录号：1.06404.1000）
NaOH（Merck，目录号：1.06498.0500）
CaCl 2 （Merck，目录号：1.02382.1000）
RbCl（Sigma-Aldrich，目录号：R2252-100G）
MnCl 2 （Merck，货号：1.05927.0100）
醋酸钾（默克（Merck），目录号：1.04820.1000）
醋酸（冰醋酸）（默克（Merck），目录号：1.00063.1000）
MOPS（Sigma-Aldrich，目录号：M1254-250G）
3-甲基苯甲酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：89890）
琼脂（康达（Conda），货号：1806）
琼脂糖D1（Conda，目录号：8019.22）
Bacto TM 胰蛋白（（BD ，目录号：211705）
Bacto TM 酵母菌（BD ，目录号：212750）
感受态大肠杆菌DH10B细胞（请参阅食谱）
DH10B感受态细胞TBFI的解决方案（请参阅食谱）
DH10B感受态细胞TBFII的解决方案（请参阅食谱）
30 mg / ml氯霉素和50 mg / ml卡那霉素（请参阅食谱）
LB汤（请参阅食谱）
含30μg/ ml氯霉素和/或50μg/ ml卡那霉素的LB琼脂（请参见食谱）
0.5 M 3-甲基苯甲酸酯（请参阅食谱）
50％（v / v）和70％（v / v）乙醇（请参阅食谱）

设备

ABI Prism 377自动DNA测序仪（Applied Biosystems Inc.）
电穿孔仪（Gene Pulser，伯乐（Bio-Rad）公司）
奥比塔尔振动筛
烧瓶（50毫升，1升）
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN P2，P10，P20，P100，P200，P1000，P5000）
离心机（Tomy，型号：MX-301）
热循环仪（Applied Biosystems，型号：2720Thermal Cycler）
温度室（Taitec，型号：Thermo minder SM-10R）
水浴摇床（Taitec，型号：Personal-11）
酶标仪（Corona，型号：MTP - 880Lab）
高压灭菌器（精工通美，型号：LSX-500）

软件

Microsoft Excel（Microsoft）
BioEdit序列比对编辑器
ApE-A质粒编辑器（https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape）

程序

根据FENIX系统标记的靶基因的设计和构建可分为以下4个步骤（A到D），总结于图1 。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1903046--1448贡萨洛·杜兰特714707 \图jpg \图2.jpg

图1 。FENIX系统的原理和构建，可一步一步克隆和标记单个目标蛋白。编码靶多肽（感兴趣的基因，该基因GOI ）是通过PCR与特异性寡核苷酸扩增，我nclude 的Nhe I和BSR GI限制性位点。产生的扩增子可以直接克隆到质粒pFEN IX· 用这两种限制性内切酶消化后的gfp * （包含nia / ssrA 标记的绿色荧光蛋白版本，请参见表1 和补充文件）。所述的Nhe I限制位点位于betwee n中的RBS和的ATG GFP 基因如此的N末端区域的GOI WIL L一直没有任何修改，并且C- 末端区将包含八个额外的碱基（红色）之间GOI 和nia 序列，翻译为XYK氨基酸（X可以是L，M或V氨基酸，取决于goi 的最后一个bp ）。一压脚提升结扎，新质粒pFENIX· 印度政府被转化感受ê 。大肠杆菌DH10B细胞。在所有pFENIX质粒，所述的表达NIA / SSRA -标记的变体GOI 依赖于组成型P TETA 启动子。

表1.细菌菌株和质粒

菌株或质粒

描述

参考资料

大肠杆菌

DH10B

克隆宿主；˚F - λ - endA1 recA1 的galK 嘎鲁 （ARA-LEU ）7697 araD139 DeOro nupG RPSL  80（lacZ启动 M15 ）McRae的 （MRR-hsdRMS-的McrBC ） lacX74

Durfee 等。（2008年）

质粒

pSEVA238

表达载体；oriV （pBBR1），XylS / Pm 表达系统；公里[R

Silva-Rocha 等。（2013年）

pS238·Nia

用于调节nia的表达的载体pSEVA238的衍生物，其编码杯状病毒NIa蛋白酶；XylS / Pm → 尼亚; 公里[R

Durante-Rodríguez 等。（2018）

pS341T· gfp

用于gfp 组成型表达的pSEVA341T载体的衍生物; P tetA → gfp ; 厘米[R

Durante-Rodríguez 等。（2018）

pS341T· gfp *

用于构建性表达gfp（gfp *）的pSEVA341T载体的衍生物; P tetA → gfp * ; 厘米[R

Durante-Rodríguez 等。（2018）

pFENIX· gfp *

质粒pS341T· gfp *的衍生物，其中gfp 已被nia 和ssrA 识别靶标标记；厘米[R

Durante-Rodríguez 等。（2018）

pFENIX质粒的构建，用于单个目标蛋白的一步克隆和标记
选择编码目标多肽的基因（目的基因goi ）。
设计特定的寡核苷酸以扩增goi ，分别包括5'和3'项中的Nhe I（5'-GCTAGC-3'）和Bsr GI（5'-TGTACA-3'）限制性位点。
设置一个100 μμ 利用校对PCR反应的Pfu DNA聚合酶（Promega）中。可以按照供应商手册中Pfu DNA聚合酶的描述使用标准反应条件。在大多数情况下，热循环条件如下：在98°C加热5分钟后，设置30个周期，在98°C下持续30 s（变性），在57°C下持续30 s（退火，温度根据实际情况而变化） Tm所用的寡核苷酸），并在72°C下放置1分钟（延伸时间取决于要扩增的goi 的大小，通常为2分钟/ kb）。
使用Gene-Clean Turbo试剂盒（Q-BIOgene）纯化PCR产物。
注意：当PCR扩增产生非特异性条带时，电泳后通过加载PCR的总体积从琼脂糖凝胶上切下目标产物，并通过Gene-Clean Turbo试剂盒进行凝胶纯化。

消化质粒pFENIX和的PCR产物GOI 用限制酶的Nhe I和BSR GI，然后纯化使用两个DNA片段基因清洁试剂盒涡轮。
克隆GOI 在由所述pFENIX骨干T4 DNA连接酶（New England Biolabs公司），加入GOI 浓度比在20的最终体积质粒pFENIX高5-10倍μ 升。

用pFENIX- goi 质粒进行细胞转化
将感受态大肠杆菌DH10B 细胞放在冰上。该协议已经进行了用菌株DH10B考虑到其高的能力的技术，但任何大肠杆菌菌株常规地用于克隆（例如，DH5同样可以使用α）。
取20- μ 升从之前的步骤连接混合物，并将其添加到0.1毫升主管的细胞悬浮液的大肠杆菌DH10B（见配方）中，然后在冰上孵育混合物30分钟。
将细胞在42°C加热震荡45 s，然后立即向混合物中加入0.9 ml LB肉汤。
在37°C下孵育1 ml 大肠杆菌DH10B转化子悬浮液60分钟。
将E.coli DH10B转化子的0.1 ml和/或其余悬浮液铺在含30μg/ ml氯霉素的LB琼脂平板上，然后在37°C下孵育过夜。
隔离的转化大肠杆菌DH10B窝藏在LB琼脂克隆候补与30 微克/毫升氯霉素。
将单个菌落接种到50 ml锥形管中的10 ml含30μg/ ml氯霉素的LB肉汤中，并在37°C的振荡器中摇动（180 rpm）孵育过夜。
通过High-Pure质粒分离试剂盒（Roche）从10ml过夜培养的转化细胞中分离质粒。
检查标记的DNA序列GOI 克隆d入pFENIX质粒用ABI PRISM 377 DNA自动测序仪（Applied Biosystems公司），使用通用引物R24（5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ' ）和F24（5 ' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG -3 ' ）。
将克隆序列与参考序列进行比较，以确保不存在突变。可以使用比对软件，例如Bioedit或ApE-A。
按照公认的程序，用这些质粒转化的细菌菌株的长期保存通常以15％的甘油储备进行（Sambrook 和Russell ，2001）。

用编码NIa蛋白酶的质粒对pFENIX重组子进行电穿孔
在LB培养基中于37°C 在定轨摇床上摇动（180 rpm），将20 ml培养的带有质粒pFENIX· goi的大肠杆菌DH10B 培养物过夜。
将整个培养物分配到50 ml无菌锥形管中，并在2300 xg 和4°C下离心10分钟。
除去上清液，将沉淀轻轻重悬于10 ml冷无菌水（4°C）中，并以2,300 xg 和4°C 离心10分钟。
弃去上清液，加入1 ml无菌冷水，重悬沉淀并将悬浮液转移至2 ml微量离心管中。
在3,800 xg 和4°C下离心5分钟。重复此步骤2次。
注意：细胞在用冷水离心后形成非常柔软且疏松的沉淀时，就可以进行电穿孔了。

的处置吨他上清液，加入300μl的冷的无菌水，重悬并分发100 微升所得悬浮液成2毫米的间隙宽度电试管。
将200 ng质粒pS238·NIa添加到电穿孔试管中，该试管中装有100μl 带有质粒pFENIX· goi的大肠杆菌DH10B细胞悬液，轻轻混合，然后在电穿孔器（Gene Pulser，Bio-Rad）中进行电穿孔。
注意：电穿孔的参数是电阻，200Ω；电容为25 µF；和电压，2.5 kV。

向细胞悬液中加入0.9 ml LB培养基，并在定轨振荡器中于37°C 振荡（180 rpm）孵育1 h 。
板中的整个培养到具有30μg/ ml的氯霉素和加入LB培养基平板50 微克/ ml卡那霉素。
划线几个菌落，并通过质粒提取（High-Pure质粒分离试剂盒，Roche）检查转化体细菌中是否存在质粒pFENIX· goi 和pS238·NIa 。
消化用Spe I（5'-ACTAGT-3'）提取的两种质粒的混合物，并进行琼脂糖凝胶电泳以检查相关大小。预计大约会有3.6 kb的条带加上带有pFENIX· goi 的相应goi 的大小，以及空的pS238·NIa载体的大约5.8 kb的条带。

在带有GFP * 的FENIX天然系统中激活NIa蛋白酶的方案（图2）
选择包含以下质粒的大肠杆菌转化子的单个菌落（表1）：
pS238·NIa（阴性对照）

pS341T· gfp （正控制）

pSEVA238和pFENIX· gfp * （不含蛋白酶NIa的对照菌株）

pS238·NIa和pFENIX· gfp *

在10 ml含30μg/ ml氯霉素（用于阳性对照），50μg/ ml卡那霉素（用于阴性对照）或两种抗生素（用于菌株）的LB培养基中，分别在50 ml锥形管中接种这四个重组菌株包含两个质粒）。
将预培养物在摇动（180 rpm）下于37°C孵育过夜。
在96孔微量滴定板中每孔接种4μl过夜预培养物，每孔含200μl新鲜LB培养基，包括30μg/ ml氯霉素和/或50μg/ ml卡那霉素，在存在或不存在1 mM的条件下3 -苯甲酸甲酯作为nia 表达的诱导剂（在带有pFENIX· gfp * 质粒的菌株中）。每个实验都应在三个独立的孔中进行，作为技术重复。
将96孔微量滴定板在37°C下在读板器中摇动孵育24小时，直至达到固定相。
测量OD 600 ，并在生长曲线（的端点在板阅读器中的GFP荧光图URE 2 ）。GF P在488 nm处激发，荧光信号在511 nm处恢复，并用于底部读取模式。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1903046--1448贡萨洛·杜兰特714707 \图jpg \图3.jpg

图2 。以GFP荧光为读数的FENIX系统的性能。A.使用FENIX系统对GFP进行NIa和SsrA依赖性翻译后控制的方案。将编码绿色荧光蛋白（GFP）的基因添加到合成的nia / ssrA 杂合标签中，产生带标签的GFP变体，其中的C端显示GESNVVVHQADER·AANDENYALAA氨基酸序列。SsrA标签在体内被细菌蛋白酶体的ClpXP和ClpAP蛋白酶直接识别，从而降解了该蛋白。在特定的杯状病毒NIa蛋白酶作用下（合成的nia / ssrA 标签中的识别位点在图中用红色的倒三角形表示），SsrA标签被释放并且GFP可以积累，从而导致GFP + 细胞的出现。B. FENIX系统和重组E.的评估。大肠杆菌使用GFP蛋白。质粒pFENIX· gfp *包含带有nia / ssrA 标签的GFP版本（在表的第一行中用蓝色和橙色带表示），被转化到带有质粒pS238·NIa或空pSEVA238的大肠杆菌DH10B中向量（在表的第二行中分别表示为+和-）。前两列表示阴性和阳性对照，分别与进行大肠杆菌DH10B用空pFENIX矢量（无论是转化即，没有GFP蛋白）或用质粒组成型表达编码基因GFP * （pS341T· GFP * ，表格1）。在接下来的四列中指示的菌株包含nia / ssrA 标签的GFP。这些实验是在装有LB培养基的96孔微型旋转盘上进行的，LB培养基带有必要的抗生素和添加剂（如表第三行所示，用1 mM 3-甲基苯甲酸酯作为nia 表达的诱导剂），并接种了之前在含有必要抗生素的LB培养基中生长的相应菌株的培养过夜。将细胞在37°C旋转搅拌下孵育，并在24 h后记录荧光和细菌生长（表示为在600 nm处测得的光密度，OD 600 ）。将所研究的荧光蛋白的比活性（Sp）活性计算为归一化为OD 600 的任意荧光单位（afu 。）。每个条形表示从至少三个独立实验计算出的Sp活性的平均值±标准偏差。下图显示了在蓝光下观察到的微量滴定板培养的相同生长条件下孵育24小时后，从摇瓶培养物中收获的细菌沉淀。

数据分析

提取OD 600 值的原始数值数据和在不存在或存在诱导剂的情况下的GFP荧光测量结果作为文本文件。
在数据管理软件（例如Microsoft Excel，R或Sigma Plot）中打开一个包含原始数字数据的文本文件。
归一化OD 600 的值和GFP荧光的净强度。
通过以下公式计算相对于OD 600 的荧光比作为每种培养物启动子的比活：

Sp = IF / OD 600

Sp 是特定的活动

IF 是任意单位的荧光强度

OD 600 是细胞浓度，以光密度为单位

将三个独立实验与技术重复的比率取平均值，用于计算平均比活以及典型的相对偏差。
为了确认显着差异，统计分析的学生t 检验（单尾和未配对）的计算P 值应评估为小于0.01（Durante-Rodríguez 等人，2018）。

菜谱

感受态大肠杆菌DH10B细胞
在50 ml锥形瓶中的10 ml LB肉汤中接种大肠杆菌DH10B 的单个菌落
将预培养物在摇动（180 rpm）下于37°C孵育过夜
在1升锥形瓶中的250毫升新鲜LB肉汤中将预培养液稀释100倍
将培养物于37°C摇动（180 rpm）孵育直至达到指数中期（在600 nm下测得的光密度）〜 0.5-0.6）
将细胞悬液在冰批中放置30分钟
将250毫升培养物分配到50 毫升无菌锥形管中
通过离心（2,300 xg ，4°C，5分钟）收集细胞，并在单个管中合并沉淀
每100 ml原始细胞悬液将细胞悬于30 ml TBFI（请参阅配方2）中
在冰浴中孵育细胞2小时
离心收集细胞（2,300 xg ，4°C，5分钟）
每100 ml细胞将细胞悬浮于4 ml TBFII（请参阅配方3）中
将悬浮液转移至预冷的1.5 ml微量离心管中，并取100μl等份试样
使用重悬的等分试样（〜100微升）大肠杆菌里用于转化的DH10B
DH10B胜任TBFI细胞的解决方案
要制备250 ml最终体积的TBFI，请在蒸馏水中溶解0.74 g乙酸钾，0.37 g CaCl 2 和43.1 ml 85％（v / v）甘油
通过滴加0.2 M乙酸将pH值调节至6.0
加入2.47 g MnCl 2 和3.02 g RbCl，检查pH值是否保持在5.8（否则，通过逐滴添加0.2 M乙酸进行重新调节）
通过用0.22-μm滤膜（Merck）过滤对溶液进行灭菌
将灭菌溶液在4°C下用铝箔包裹
DH10B感受态细胞TBFII的解决方案
为了制备250毫升TBFII的最终体积的，溶解2.75克的CaCl 2 ，0.3克氯化铷的，0.52克MOPS的43.1毫升85％（V / V）glycer 醇我Ñ蒸馏水
通过滴加10 N NaOH将pH调节至6.8
通过用0.22-μm滤膜（Merck）过滤对溶液进行灭菌
将灭菌溶液在4°C下用铝箔包裹
30 mg / ml氯霉素和50 mg / ml卡那霉素
将0.3 g氯霉素（Sigma）和0.5 g卡那霉素硫酸盐（Sigma）分别溶于10 ml 70％（v / v）乙醇或蒸馏水中
通过用0.22- μm 滤膜（Merck）过滤对溶液进行灭菌
将灭菌溶液储存在-20°C
LB肉汤
在800 ml蒸馏水中溶解10 g Bacto TM 胰蛋白,、 5 g Bacto TM 酵母提取物和10 g NaCl
用10 N NaOH将pH调节至7.5
用蒸馏水将体积调节至1 L
高压灭菌溶液（在LSX-500高压灭菌器中设置为121°C和20分钟）
将无菌的LB肉汤保存在室温下
LB琼脂含30μg/ ml氯霉素和/或50μg / ml卡那霉素
将7.5 g琼脂溶于1 L LB肉汤中
高压灭菌器（在LSX-500中设置121°C和20分钟）
冷却后分别添加氯霉素和/或卡那霉素，终浓度分别为30μg/ ml 和50μg/ ml
将培养基倒入培养皿中，然后通过在室温下冷却使LB琼脂凝固
将LB琼脂板倒置保存在4°C
0.5 M 3-甲基苯甲酸酯
溶解6.75 g 3-甲基苯甲酸（Sigma）和100 ml 50％（v / v）乙醇
消毒的S olution 通过过滤与0.22- 微米的过滤器膜（Merck）上
将溶液储存在4°C
50％（v / v）和70％（v / v）乙醇
用无菌水将乙醇稀释至50％（v / v）或70％（v / v）
室温保存

致谢

根据授予协议号No. Novo Nordisk Foundation（NNF10CC1016517和NNF 18CC0033664），丹麦独立研究理事会（SWEET ，DFF研究项目8021-00039B）和欧盟的Horizon2020研究与创新计划提供的资金支持。814418（SinFonia ）识别为PIN。这项工作也由MADONNA（H2020-FET-OPEN-RIA-2017-1-766975），BioRoboost （H2020-NMBP-BIO-CSA-2018），SYNBIO4FLAV（H2020-NMBP / 0500）和MIX-UP资助H2020-格兰特870294），欧洲联盟和S2017 / BMD 3691的合同InGEMICS 顺的项目自治区马德里（欧洲结构和投资基金），以VDL 。该协议改编自Durante-Rodríguez 等人。（2018）的方法用于设计和构建翻译后代谢开关，该开关驱动将细菌生长与大肠杆菌中生物聚合物生产脱钩。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考资料

Avcilar-Kucukgoze ，I.，并且Ignatova ，Z。（2017）。重新布线用于合成电路生产的主机活动：翻译视图。生物技术快报39（1）：25 - 31。
卡列斯，B.，围棋ñ 我，莫雷诺，A和德洛伦佐，五（2019）。使用便携式ON / OFF模块数字化革兰氏阴性细菌中的异源基因表达。Mol Syst Biol 15（12）：e8777。
Doma ，MK和Parker，R.（2007年）。真核生物中的RNA质量控制。细胞131（4）：660-668。
杜兰特-罗德里格斯（G.），德洛伦佐（V.）和尼古拉（PPI）（2018）。翻译后的代谢转换功能使细菌生长与工程化大肠杆菌中的生物聚合物生产完全脱钩。 ACS Synth Biol 7（11）：2686-2697。
Durfee，T.，纳尔逊，R.，鲍德温，S.，普兰克特，G.，第三，Burland ，V.，茅，B.，彼得罗西诺，JF，秦，X.，Muzny ，DM，阿耶勒，M.，吉布斯，RA，Csörgo ̋ ，B.，Pósfai ，G.，魏因斯托克，GM和布拉特纳，FR（2008）。大肠杆菌DH10B 的完整基因组序列：对实验室主力生物学的见解。Ĵ 细菌学190（7）：2597年至2606年。
Guzmán ，LM，Belin，D.，Carson，MJ 和Beckwith，J。（1995）。含有阿拉伯糖P BAD 启动子的载体的严格调控，调节和高水平表达。Ĵ 细菌学177（14）4121 - 4130次
艾萨克斯，FJ，德怀尔，DJ，丁，C.，Pe的rvouchine ，DD，康托，CR 和Collins，JJ（2004年）。工程化的核糖调节蛋白能够对基因表达进行转录后控制。纳特生物技术22（7）841 - 第八百四十七
Lou，C.，Stant on，B.，Chen，YJ，Munsky ，B. 和Voigt，CA（2012）。基于核酶的绝缘子零件可缓冲遗传背景下的合成电路。Nat Biotechnol 30（11）1137 年- 1142年
Lutz，R。和Bujard ，H。（1997）。通过LacR / O，TetR / O和AraC / I 1 -I 2 调控元件独立和严格地调节大肠杆菌中的转录单位。核酸研究25（6）1203 - 第一千二百一
Sambrook，J。和Russell，DW（2001）。分子克隆：实验室手册。美国纽约州冷泉港冷泉港实验室。
Shoemaker，CJ，Eyler ，DE和Green，R。（2010）。Dom34：Hbs1促进亚基解离和肽基-tRNA的下降，以开始不进行衰变。科学330（6002）：369-372。
席尔瓦·罗查（Silva-Rocha），马丁内斯·加西亚（E. Martinez-Garcia），卡勒斯（Calles），B。查瓦里亚（Chavarría ），阿尔斯·罗德里格斯（Arce-Rodríguez），A 。德拉拉斯· 赫拉斯（Las Heras），佩斯·埃斯皮诺（Páez-Espino），公元杜兰特·罗德里格斯（Gur。，Kim，J.，Nickel，PI，Platero，R.和de Lorenzo，V.（2013）。核酸研究。41（数据库问题）：D666-675。
史蒂文斯，RC（2000）。设计用于结构生物学的高通量蛋白质生产方法。结构8（9）：R177-185。
Verchot ，J.，Koonin ，EV和Carrington，JC（1991）。猪痘病毒多蛋白N端的35 kDa蛋白起第三种病毒编码的蛋白酶的作用。病毒学185（2）：527-535。
Volke ，DC，Turlin ，J.，Mol，V。和Nickel，PI（2020）。XylS / Pm调节元件的物理解耦和有条件的蛋白水解可以精确控制恶臭假单胞菌的基因表达。微生物生物技术13（1）：222-232。
Wu，G.，Yan，Q.，Jones，JA，Tang，YJ，Fong，SS，and Koffas ，MAG（2016）。代谢负担：合成生物学和代谢工程应用中的基石。趋势生物技术34（8）：652 - 664。