材料和试剂

A. 微流体装置的准备

1. 微流体装置

注意：微流体装置可从Xona Microfluidics商购获得，或者可以按照Taylor等人在2005年和Holloway等人在2019年所述的方法制造。对于单向增长，我们建议使用Holloway 等人所述的“箭头”设备。，2019 。

2. 22 x 50毫米矩形盖玻片（厚度为0.16-0.19毫米，Smith Scientific，目录号：NPS16 / 2250）

3. 94/16毫米P etri盘，无通气（Greiner Bio-one，目录号：632180）

4. 3 M透明胶带

5. 聚-D- 赖氨酸氢溴酸盐（PDL，西格玛，目录号：P7886）

6. 无菌ddH 2 O

7. 70％乙醇（EtOH）

8. 神经基础培养基（Gibco，目录号：21103-049）

B. 原代神经元培养和转染

15 ml猎鹰锥形管17 / 120MM （Cellstar，目录号188271）
50毫升猎鹰锥形管115分之30（蜂星，目录号：227261）
40 sterm无菌细胞过滤器（Fisher Scientific，目录号：15360801）
定时怀孕雌性小鼠E15-E18
注：w ^ ê经常使用C57BL / 6小鼠。

Glutamax 补充剂（Gibco，目录号：35050-038）
神经基底介质（NBM）（Gibco，目录号：21103-049）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10270-106）
Dulbecco的改良版Eagle Medium（DMEM）（Gibco，目录号：41965-039）
的Opti-MEM还原血清培养基glutamax的补充物（Gibco公司，目录号：51985-026）
DNase（Sigma，目录号：DN25;可选）
B27 Media Supplement，50x（Gibco，货号：17504-044）
Lipofectamine2000（Gibco，目录号：1168027）
0.5％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：15400-054）
磷酸盐缓冲盐溶液（DPBS），无钙（Ca 2+ ）和镁（Mg 2 + ）（Gibco，目录号：14190-094）
PDL 解决方案（请参阅食谱）
培养基（完全NBM）（请参阅食谱）
DNase 解决方案（请参阅食谱）

C. 固定和成像

多聚甲醛（PFA）（西格玛，目录号：158127）
蔗糖（Sigma，目录号：S8501）
PBS（Fisher Bioreagents，目录号：10649743）
PFA（请参阅食谱）

软件

FIJI（https://fiji.sc）或ImageJ（使用NIH，https: //imagej.nih.gov/ij/ ，版本1.51 ）
Matlab（使用MathWorks 版本R2017a ）
SoftWoRks 软件v6（或要使用的显微镜的合适图像采集软件）
Excel（或任何电子表格）在分析之前收集数据。

设备

1. Dumont镊子＃5，11厘米，直的（Fine Science Tools，目录号：11254-20）

2. Dumont＃5/45镊子，11厘米，45度角（精细科学工具，目录号：11251-35）

3. 剪刀

4. 孵化器

5. 层流罩

6. 解剖显微镜

7. 血细胞计数器（Fisher，目录号：11704939）

8. 高压釜

9. 组织培养罩

10. 4°C冰箱

11.- 20°C冰柜

12. 37°C水浴

13. 细胞培养箱设置为37°C，5％CO 2

14. 轨道振动筛（Fisher，目录号：10759145）

15. DeltaVision Elite显微镜

注意：或者，可以使用任何倒置的高分辨率荧光显微镜。

程序

注意：在无菌环境中执行所有组织培养步骤。在解剖显微镜的层流罩中进行解剖。在垂直流罩中进行微流控设备准备，组织解离和细胞培养。

A. 盖玻片和微流体装置的制备

1. 玻璃盖玻片

将盖玻片放入装有1 N NaOH的塑料容器中，并在定轨摇床上以大约120 rpm的速度洗涤1小时，注意避免溢出。
从容器中取出NaOH，并用ddH 2 O 清洗盖玻片数次，直到pH恢复到中性。
将盖玻片储存在70％的乙醇中。
2. 微流体装置

用3M胶带覆盖设备的结构化表面，以除去任何微粒和纤维。
剥下胶带，将设备存储在包含70％乙醇的容器中。
注：d evices可以存储干覆盖有3M胶带或在70％乙醇中的时间过长（数月至数年）。

3. 组装器械（解剖前1天）

从含70％乙醇的容器中取出两个玻璃盖玻片，并用镊子将其置于无菌培养皿中。
让玻璃干燥（在通风橱中约5分钟），然后将1 ml的0.1 mg / ml PDL涂在每个玻璃上至少1 h至过夜（图1）。

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图1.玻璃盖玻片的涂层

除去PDL溶液，并用高压灭菌的ddH 2 O 次洗涤玻璃。
在添加微流控设备之前，让涂有PDL的玻璃在无菌组织培养罩内风干〜1 h。
注：g ^ 已PDL涂覆，洗涤和干燥小姑娘盖玻片可以在-20存储在培养皿℃下进行长达两周。

从70％的乙醇中取出设备，将设备倾斜放置在无菌培养皿的边缘，通道朝上（即，倒置，见图2A）。

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图2. 微流控设备的组装。（A，B）设置示意图。答：将设备在无菌环境中的10厘米培养皿中槽侧朝上干燥。B.然后将其组装，使结构化的一面朝向玻璃盖玻片，将设备轻轻向下推入非结构化区域，以实现良好的接触，从而实现PDMS与玻璃基板之间的无泄漏密封。（C，D）两个组装好的设备的照片。C.在添加介质之前干燥设备。D.两个填充的设备，其中一个密封良好（顶部），一个泄漏（底部）设备。设备中填充了食用染料，以实现更好的对比度。

让设备完全干燥（〜1小时）。
使用无菌镊子，将干燥装置（通道朝下）放在PDL涂层的玻璃盖玻片的中央。用镊子的钝端轻轻将设备向下按到盖玻片上，以确保PDMS-玻璃均匀接触，并去除任何气穴（请参见图2B）。
观察设备是否粘附在玻璃表面上，确保紧密密封。
将10分之70％的乙醇添加到设备一侧的入口，观察通道从一个端口到另一个端口的填充情况。
将盖子放在培养皿上，并在光学显微镜上检查组装的设备，确保通道和/ 或微槽内没有泄漏或气泡。
接下来，通过向每个通道中添加50ul补充的Neurobasal培养基冲洗出乙醇，以填充设备。从出口除去乙醇，并用补充的Neurobasal培养基补足进口。放在培养箱中过夜。
注：P erform临门这些步骤，以确保设备不会蒸发的液体。

B. 海马解剖和原代细胞的制备

1. 用CO 2 牺牲孕妇，然后进行颈脱位。取出子宫，放入装有PBS的无菌培养皿中，移至水平流罩进行精细解剖

2. 分离胚胎并收集到新鲜的PBS中。确保冲洗掉剩余的血液。

3. 隔离胚胎大脑。使用解剖显微镜，去除脑膜并解剖出海马。平均而言，一个胚胎产生约500,000个海马神经元，每个怀孕的雌性有4-10个胚胎。

注：一个小鼠胚胎海马解剖有用的例证，可以发现Seibenhener和伍滕，2012 。

4. 将分离的海马以1 ml PBS收集到15 ml锥形管中，并移至垂直流罩。

5. 加入100胰胰蛋白酶-EDTA，并在37的水浴中孵育 ℃ 8分钟以破坏细胞间的接触。

6. 加入1 ml血清使胰蛋白酶失活，并以300 xg的转速旋转细胞3分钟。除去上清液并将细胞重悬于1 ml培养基中。

7. 用1 ml移液器研磨细胞约6-8次。这会将组织分解成单个细胞悬液。

注意：如果细胞悬液开始结块（通常在年长的胚胎中观察到），请添加50 µl DNAse 溶液进行研磨。

8. 过滤器的解离的细胞通过40μm细胞过滤器以除去未离解的更大的块，并使用计数细胞血细胞计数器。

C. 细胞培养

1. 将300,000个细胞转移到Eppendorf管中。

注意：如果您为每个设备延迟两个以上的频道，请相应地调整单元号和媒体音量。每个通道使用60,000-70,000个单元。

2. 以300 xg 旋转试管3分钟。

3. 轻轻地将细胞沉淀重悬在Eppendorf管中的50个完整NBM中。

4. 从培养箱中取出准备好的设备，并转移到无菌培养罩中。

5. 从设备的所有入口中取出所有介质。

6. 从左侧端口（A l ）开始，添加10µl细胞悬液，并从相邻的右侧连接端口（A r ）中移除1个，以促进细胞流动（请参见图3A）。

7. 关闭培养皿，并使用光学显微镜检查细胞是否已进入主要培养通道。将培养皿倒入无菌罩中。

8. 继续上以填充其它信道（例如，B 升）如上述。

9. 通过以一定角度支撑装有该设备的培养皿，使细胞靠近微槽沉降（请参见图3B）。5-10分钟后，将培养皿再移至培养箱中45分钟，以使细胞粘附在玻璃板上。

10. 通过向所有端口中添加50份完整的NBM来补充培养基。

11. 在盖上培养皿之前，在培养皿侧面上加入1 ml无菌ddH 2 O，以保持湿润的气氛，然后盖上盖子并将细胞放在培养箱中。这算作体外天数（DIV）0。

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图3.将神经元电镀到设备中。A.将神经元悬液添加到端口中，并尽可能靠近通道，并通过从另一侧移走少量体积来鼓励流入通道。B.接种后，将设备平缓放置，以使重力引导细胞沉降到微通道附近。为此，培养通道应水平放置，通道A在顶部，以便培养通道A中的细胞沉降在连接至通道B的微槽附近，而通道B中的细胞沉降在连接至通道C的微槽附近。

D. 转染

在第二天（DIV1），用相关构建体转染装置中的培养物。为了测定tau的繁殖，我们转染了Hoover 等人所述的人tau 0N4R构建体。，2010年如下：通道A中的GFP-tau E14 ，通道B中的RFP- tau WT （图4A）。

1. 在两个分别标记为1和2的Eppendorf管中分别加入25的OptiMEM 。

2. 在试管1中加入0.5 µg质粒，在试管2中加入0.5 Lil Lipofectamine2000。

3. 轻轻鼓泡，将混合管1和2制成转染试剂。不要涡旋。允许在无菌通风橱中放置20分钟。

4. 将设备从培养箱中带入无菌TC罩中，并除去通道A（要转染的通道）两个端口中的所有培养基（工作流程请参见图4B）。

5. 用完整的NBM加满连接到培养通道B的端口。通道B的端口内的大量介质将使该通道流体隔离，并阻止转染试剂从通道A到通道B的流动。

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图4.设备内的转染。A.转染设备的示意图。通道A中的单个突触前神经元表达突变体tau（绿色），而大多数细胞仍未转染（蓝色）。转染的投射神经元与表达荧光野生型tau的突触后神经元接触。B.转染程序的工作流程。C.设备中两个转染的连接神经元的部分重建。比例尺= 10 µm。

6. 在通道A 的左进料口中添加50 transl转染试剂。

7. 关闭培养皿盖，并在37°C的培养箱中孵育40分钟。

8. 从端口A取出所有培养基，并在所有左侧端口中加入50 毫升新鲜的完整NBM以冲洗除去剩余的转染试剂。

9. 放置2分钟，然后再从右侧端口中取出多余的介质。

10. 现在，将50个完整的NBM添加到所有端口。

11. 重复以转染通道B。

12. 在培养皿侧面上加入1 ml无菌ddH 2 O，以防止变干，然后再放回培养箱中过夜。

13. 补满一个端口，每2-3天喂一次培养物。如有必要，请从对面的端口中取出多余的介质。

注意：每2-3天在P etri皿中补充1 ml无菌ddH 2 O，以防止培养物变干。

E. 固定

注意：设备可以在不含酚红的介质中实时成像，也可以固定以备后用。我们通常会修复设备，除非观察动态过程。

1. 在体外所需的一天，通过固定细胞停止实验。

2. 从所有端口中取出介质。

3. 用50 Pl PFA 填充端口A r 。允许流入主通道并通过微槽。

4. 充值端口一个[R 及填充口B [R 。

5. 静置15分钟。

6. 取出PFA溶液，并用PBS或TBS填充设备。

7. 固定设备可以在冰箱中短期存放（最多2周），但请通过用PBS或TBS填充端口，以确保它们不会变干。

F. 显微镜

注意：虽然我们在DeltaVision 显微镜上进行成像，但任何高分辨率倒置荧光显微镜都是适用的。我们通常使用60倍油镜，而1个像素= 0.1075 µm。

1. 用70％的乙醇清洁玻璃盖玻片的底部。

2. 在倒置荧光显微镜上使用60倍油镜和适当的GFP和RFP通道滤镜设置的成像单元。

3. 对于每个连接对，请确保对相应的细胞体和远端轴突节段成像。理想情况下，捕获相应的差分干扰对比度（DIC）或相位图像以进行质量控制。

笔记：

为了进行分析，您需要轴突伸展的长度≥75 µm。
距细胞体≥300 µm的任何轴突伸展都可以用作“远端轴突”。确保每个神经元仅使用一个轴突伸展进行分析。
确保您不对气泡细胞成像，因为这会干扰分析（请参见图5）。不确定地检查透射光通道上的轴突完整性，以确保轴突结构光滑。

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图5. 表达GFP-Tau E14 的两个起泡的轴突拉伸的例子，应从分析中排除。比例尺= 10 µm。

4. 以尽可能高的像素深度捕获图像（我们使用了16位）。

数据分析

在ImageJ / FIJI中读取沿轴突的荧光强度
注意：数据分析是基于以下观察结果：荧光tau的聚集会导致细胞内的荧光重新分布，出现亮点和拉伸段代表积累（图5和9）。

打开FIJI或ImageJ中远端轴突节段的原始显微镜文件。
要在打开的图像上创建绘图轮廓，请右键单击线条工具（图6），然后在下拉菜单中选择“分段线”（图6A）。
沿着轴突的长度创建分段线图（图6B）。双击以停止创建分段线。

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图6.使用分段线工具跟踪轴突

要量化已绘制的轴突周围的荧光值，请转到AnalyzePlot Profile（图7）。这将生成与绘制的轴突长度相对应的像素强度值列表（图8）。

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图7.生成图谱以读取沿轴突长度的荧光强度值

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图8.要保存值以进行进一步分析，请单击List并选择All values以进行复制。在电子表格中收集为列，以确保您跟踪哪个数据列属于哪个原始轴突图像。

单击“列表”（如图8中的蓝色箭头所示）以查看各个值。保存数据：全选 复制。
粘贴到Excel电子表格的列中。
图9显示了其图轮廓旁边的分析拉伸示例。

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图9.轴突成像示例及其相应的绘图轮廓

笔记：

将来自一个实验的所有测得的拉伸值粘贴到一个文件中。每个条件使用一个电子表格。
您最初还需要一个电子表格，其中包含来自不同时间点的一系列控制值。

荧光分布分析
注意：首先，你需要一系列的来自全国各地点的时间不同实验组“控制”轴突的这部分分析分析。我们建议至少30个成像的轴突拉伸。这将确定实验数据中允许的基线变异性。它还允许单个控制轴突在以后的分析中得分为阳性。

在整个实验中建立允许的基线变化
将跨不同实验的控制轴突中随机选择的值复制到电子表格中。
打开https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/74503-baseline-analysis上的MATLAB脚本“基准” 。
将数据导入MATLAB脚本并运行该脚本。
该脚本将首先通过从每个系列中减去第10 个百分位数来确保单个细胞中不同的表达水平不会使分析产生偏差（图10）。
注意：脚本“基准”的说明（https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/74503-baseline-analysis）。该脚本旨在确定跨生物学重复和时间点的控件内信号的可变性。为此，您需要从不同实验中随机选择的示例控制轴突，然后将其粘贴到excel电子表格的各个列中。运行脚本时，它会将列导入为“数据”。首先，确定并扣除每列的第10 个百分位数，以消除由于不同表达水平而引起的变异性。结果指定为“零”。然后将这些值列在单个列中，并确定平均值和标准偏差。选择平均值加5个标准差作为脚本“ axon_analysis ”的允许基线变化。

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图10.数据分析第一部分的可视化表示，确定允许的基线变异性。在所有分析中，通过减去每条迹线中所有值的第10 个百分位数，来考虑到不同的表达水平（如在A中显示的原始图配置文件中所示）（结果显示在B中）。图10中确定的截止值导致B中的灰色阴影框，并允许控制轴突（例如黑色迹线）在以后的分析中得分为阳性。

然后将确定平均荧光强度和标准偏差。选择平均值加5个标准差作为允许的基线变化。这样可以确保您的分析在轴突伸展时对焦点的微小变化方面都具有强大的抵抗力。

一项实验中的评分汇总
使用此处提供的 MATLAB脚本“ axon_analysis ” 。
注意：脚本“ axon_analysis ”的说明（在此处可用）。此脚本旨在检测荧光分布中增加的变异性，这在形成荧光累积物/聚集体时可以观察到。您需要一次重复地将对照轴突和实验轴突配对，将值作为列粘贴到两个单独的电子表格中。重要提示：将第25行中的数字调整为根据脚本“ baseline_analysis ” 确定的数字。该脚本将您的对照（例如野生型tau）值导入为``对照''，并将您的实验（例如突变型tau）值导入为``实验性''。如上所述，所有值都被清零到第10个百分位数，以消除由于不同的表达水平而引起的可变性（第29、32和64、67行）。脚本的第一部分确定了此控件数据集中的可变性。为了使控制轴突得分为正，仅包括那些在脚本“ baseline_analysis ”中确定的允许基线变异范围内的轴突（第25行）。然后，逻辑阵列（第51行）会针对每个单独的荧光值测试其是否大于第41行的对照组中包含的轴突的平均值加5个标准差。在每列中得分为正的那些轴突均被指定为“ 1”，然后相加并除以每列中各个值的总数。这使轴突值的分数为正。如果该分数> 0.1（值的10％），则将轴突计为阳性。第60行确定满足此标准的控制轴突的百分比。

脚本的第二部分测试实验数据集。减去第10个百分位（第64、67行）后，脚本将对照控件确定的最大允许基线值测试所有单个值（第71行），将每个轴突的正值加起来（第74行），将其标准化为数据集的大小（第77、78 行），以确定该实验中得分为阳性的轴突的百分比（第80行）。

在第25行中将其调整为确定为上述允许的基线变化的值。
从一个实验中导入对照和实验数据集作为“对照”和“实验性”。
该脚本将首先确定在此特定实验中跨实验在所有允许的变异范围内观察到的所有轴突的变化（图10B，灰色阴影区域），然后使用该值确定具有超过10％的对照轴突的百分比它们的值超出允许的变异性，因此得分为正（例如图10B中的黑色轨迹）。
然后它将确定在允许的变异范围之外具有超过其值10％的实验轴突的百分比，从而获得阳性结果（见图11）。

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图11.聚集分析的可视化表示。首先，确定允许的变异性之外的强度值（A，灰色框之外的值）。然后，脚本计算出该类别中轴突伸展的百分比。单个轴突的结果绘制在B中。如果超过10％的轴突属于此类别，则将其评为阳性。这样可以排除假阳性，例如由于未转染的轴突交叉。最后，计算在一个实验中得分为阳性的轴突的百分比。

现在，您可以得到重复一次的结果。

笔记

转染效率通常较低，预计〜2-3个转染的神经元也会通过微槽投射到每个设备的相邻通道。
投射到下一个通道的每个轴突通常会广泛分支，因此几乎每个投射的神经元都会与下一个通道中的转染神经元接触。
低的转染效率导致两个连接神经元的完全重建。可以使用病毒转导，但是其通常的高效率阻碍了识别单独连接的神经元的能力，因此对于生化方法更有用。
在我们手中，聚集分析在不同制剂之间以及进行实验的个体之间是高度可重复的。
我们通常观察到从DIV8开始的聚集，以密集的荧光点形成。
含有荧光聚集体的神经元对tau折叠错误（MC1染色）呈阳性，但由于转染效率低，我们尚未进行生化分析以更好地定义这些聚集体的性质。

菜谱

PDL 解决方案
无菌H 2 O中的0.1 mg / ml聚D-赖氨酸

可以以10 mg / ml的储备液或0.1 mg / ml的工作等分试样冷冻保存

培养基（完全NBM）
完全补充的神经基础培养基

向49 ml神经基础培养基中，加入1 ml B27 和125 gll 谷氨酰胺或谷氨酰胺

DNase 溶液
将冻干粉重悬于神经基础介质中至1 mg / ml，并冷冻保存

PFA
PBS中含4％多聚甲醛/ 20％蔗糖

致谢

这项工作得到了英国阿尔茨海默氏症研究中心（格兰茨ARUK-PhD2014-10和ARUK-PPG2017B-001），杰拉尔德· 柯尔库特慈善基金会和生物技术与生物科学研究委员会的支持（BB / L007576 / 1）。这是Hallinan 等人发表的有关传播工作的详细协议。，2019b 。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

伦理

所有实验均根据英国内政部制定的1986年动物（科学程序）法进行。

参考文献

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