材料和试剂

15 ml锥形管（Falcon TM ）（Fisher Scientific，目录号：14-959-53A）
无菌独立包装的5 ml移液器（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
BD Vacutainer喷涂K 2 EDTA管（BD，目录号：366643）
来自健康捐献者的新鲜人类全血
ç ollected以下标准的临床程序。通过直接穿刺将血液抽到位于手臂肘前区域的人体静脉，并收集在K 2 EDTA管中。在DPBS中洗涤后，将血液保持在室温下，直接进行停止流光散射测量。

HTS13286 [AQP9抑制剂（Jelen et al。，2011; Sonntag et al 。，2019）]，2-[（4-甲基-5-吡啶-4-基-1,2,4-三唑-3-基）硫烷基] -N-（5-噻吩-2-基） -1,3,4-噻二唑-2-基）乙酰胺，MolPort ，MolPort-002-839-693，稳定，存储的2.5mM储备溶液溶于DMSO在-20℃下冷冻后，在使用前充分加热（在37°C和涡旋下15分钟）
DFP00173 [（AQP3抑制剂（桑塔格等人，2019））]，1-（2,6-二氯苯基）-3-（5-硝基噻吩-3-基）脲，MolPort ，MolPort-002-897-426，稳定，储存在-20°C的DMSO中溶解的2.5 mM储备溶液。冷冻后，在使用前充分温热（在37°C并涡旋15分钟）
Z433927330 [（AQP7抑制剂（Sonntag et al。，2019））]，4-（3-（4-（4-（1H-吡唑-1-基）苄基）脲基）脲基）乙基苯甲酸乙酯，ENAMINE，MolPort-002-897-426，稳定，在-20°C下储存2.5 mM溶于DMSO的储备溶液。冷冻后，在使用前充分温热（在37°C和涡旋下15分钟）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液（DPBS）（EuroClone SpA ，目录号：ECB4004L），在4°C下储存；保质期：自生产之日起24个月
甘油（西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich），目录号：G7757），非常稳定，可在室温下保存，保质期：自生产之日起3-5年
二甲基亚砜（DMSO）（西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich），目录号：D8418），非常稳定，可在室温下干燥的地方储存，因为已知DMSO具有吸湿性，保质期：自生产之日起3-5年
高渗溶液，由添加了甘油的DPBS组成（最终渗透压：500 mOsM ；最终体积：50 ml）（请参见食谱）

设备

冷藏台式离心机（热Fisher Scientific公司，贺利氏，米Odel等：Multifuga 1L-R，目录号：75004330）
渗压计（ELITECH ，米Odel等：蒸气压渗透压VAPRO，目录号：5600）
停流模块（的BioLogic 科学仪器，米穿上：SFM20）
分光光度计（Jasco EUROPE Srl ，米通：FP 6200）
P20 移液器（Gilson，费舍尔科学公司，目录号：F123600）
P200 移液器（Gilson，Fisher Scientific，目录号：F123601）
P1000 移液器（Gilson，Fisher Scientific，目录号：F1236012）
Bibbyjet 移液器控制器（Bibby Sterilin Ltd ，目录号：PC1002）
块状加热器（Stuart Scientific，目录号：SBH130D）
Maxi Mixer Vortex 714（Hosmo tic Srl ，目录号：29970003）
10毫升用于SFM-20的Gastight Hamilton注射器（Jasco EUROPE Srl ，目录号：950-12 / 3）

软件

生物中国32软件（的BioLogic 科学仪器，可在这里）
GraphPad Prism 5.0软件（GraphPad Software，Inc.，www.graphpad.com）

程序

人类红细胞的分离
用抗凝剂（BD Vacutainer喷涂K 2 EDTA管）在试管中收集人静脉血样品。
用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）稀释人类静脉血样品1:10。
在DPBS中洗涤人体静脉血样3次（在4°C下800 x g 持续10分钟），以去除血清和细胞血沉棕黄层。
将所得的RBC沉淀重悬于DPBS中，以达到1％的血细胞比容。

通过SFLS评估红细胞的甘油渗透性
准备两种溶液：A）1 × DPBS（300 mOsM ）的等渗溶液，以及B）由1 × DPBS和甘油组成的高渗溶液（最终渗透压：500 mOsM ）。
使用渗透压计验证上述报告的溶液的渗透压。溶液A和B的混合将产生100 mM的甘油向内直接梯度。
如下设置停止流动的光散射装置（图1）：

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902858--1457朱塞佩·卡拉米塔781994 \图jpg \图1.jpg

图1.停止流动的光散射设备。与分光光度计耦合的SFM-20注射系统是90°光散射测定的理想系统。在该协议中，SFLS设备用于评估红细胞甘油的渗透性。SFM-20注射驱动马达触发注射器活塞，使溶液同时进入直接与氙气源灯照射的观察室相连的混合室。利用SFM-20的总流量驱动控制，剪切力得以最小化。同步电动阀可停止样品流动并防止超压伪影的发生。然后通过Bio- China 32 软件分析检测器收集的所有数据。

小号等人20的低温恒温器温度℃;
我分别通过MPS-20和BioKine 32 软件彻底消除了进样系统和分光光度计。
小号等使用以下MPS-20参数（图2）的装置SFLS：
死区时间（溶液从混合室流到观察池所需的时间）：1.6 ms ；
<1 毫秒内达到99％的混合效率;
混合时间：20 毫秒；
注射器注射量1：100μl ；
注射器2注入的体积：100μl ；
将分光光度计上的激发和发射波长设置为530 nm。激发和发射的带宽必须设置为20 nm。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902858--1457朱塞佩·卡拉米塔781994 \图jpg \图2.jpg

图2.用于单一混合应用的SFM-20软件。SFM-20的设置是为了快速，轻松地进行SFLS实验设计。用户设置混合比例，注射器和比色皿的尺寸以及样品体积。颜色编码的窗口显示计算出的值并警告用户超出实验条件的范围。估计的停滞时间将自动显示，并且还可以使用预触发来确保准确到达静止状态。

平衡15 微升的RBC悬浮液在2.5ml 5分钟等渗DPBS中，然后填充该两个注射器与细胞悬浮液中的一个。
用高渗溶液（添加了DPBS的甘油，最终渗透压：500 mOsM ）填充另一个注射器。
将红细胞悬液与高渗溶液（渗透梯度，100 mOsM ）一起注入混合室。作为甘油梯度的结果，首先，由于甘油的进入，首先会出现快速的水流出，导致细胞收缩，并导致散射光强度（I）随时间的推移而增加（图3）（图3）。，水流入细胞引起细胞肿胀，其动力学表现为散射光强度（I）随时间（s）的降低（图3）。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902858--1457朱塞佩·卡拉米塔781994 \图jpg \图3.jpg

图3.红细胞甘油渗透率的停止流光散射测量。加入的胞外甘油Ç auses 迅速增加的强度由于散射光的水通过渗透梯度流出诱导（收缩），随后是较慢的散射光降低（肿胀通过水的渗透潮诱导的）的accompan IES 的的条目甘油到细胞中。甘油的渗透性是通过测量与甘油和水的流入有关的90°光散射时间过程的细胞溶胀阶段的指数时间常数（ ，s）来计算的。

通过使用Bio- Kine 32软件，将数据拟合为一个指数函数，并测量甘油和水进入红细胞阶段的细胞溶胀阶段的时间速率常数（ ，s）（图4）。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902858--1457朱塞佩·卡拉米塔781994 \无花果jpg \图4.jpg

图4. Bio-China 32用于数据采集和分析。SFLS设备产生的信号的采集和分析使用Bio-China 32软件进行。Bio-China 32设计用于补充SFM-20软件，并将光谱仪连接到混合设备。

对于抑制研究（图5），按照先前报道的方法将化合物溶解在DMSO中，在红细胞悬液中添加适当体积的抑制剂溶液，并在测量光散射之前在20°C下孵育10分钟。HTS13286，DFP00173和Z433927330的最终浓度在1％DMSO中为25μM 。进行所有抑制试验，同时将DMSO的最终浓度保持恒定在1％。为了使抑制研究所需的DMSO浓度保持恒定，准备一系列不同浓度的DMSO溶液，并用缓冲液进行相同的稀释，这样就可以得到不同药物浓度的缓冲液，同时保持相同百分比的DMSO。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902858--1457朱塞佩·卡拉米塔781994 \图jpg \图5.jpg

图5.甘油跨红细胞质膜运输的抑制研究。停流光散射技术是评估水和溶质在生物膜上运动以及蛋白质通道和载体抑制剂的药代动力学特性（功效，特异性，效力）表征的有价值的工具。甘油渗透到人红细胞控制细胞（无抑制剂）或与两种不同浓度的每种抑制剂孵育10分钟的代表性示踪图，一种主要阻断甘油促进的扩散，另一种无效。阿甘油渗透性显著抑制被认为是添加25 μ所有三种抑制剂，HTS 13286的M（A），DFP00173（B）和Z433927220（C）与对照相比细胞（1％DMSO）。

用1％DMSO（所有三种抑制剂的溶剂）孵育的RBC悬浮液（在20°C以及实验条件下10分钟）代表对照条件。

甘油渗透系数的计算（P gly ，cm / s）。
甘油进入红血球后，渗透水大量涌入，因此导致的肿胀导致散射光强度随时间下降（图2）。通过测量 值（使用Bio - Kine 32软件），拟合与该曲线的细胞溶胀阶段有关的数据的指数时间常数，来计算甘油的渗透系数（P gly ，cm / s）：

P gly = 1 / [[（（S / V） ]

其中S / V是分析的RBC的表面积与体积之比。

RBC质膜的P gly 的计算的一个实际例子如下：

P gly = 1 / [[（（S / V） ]

其中，S / V为初始的表面/体积比的红细胞。假设单元格形状大致为球形，并且单元格外表面规则且完全光滑，则可以按以下方式获得S / V：

S / V =4πR 2 /（4/3）πR 3 = 3 / R

WH ERE - [R 是第Ë小区半径。

上面的P gly 方程现在也可以写成：

=

红细胞平均半径为4×10 -5 厘米和 值对应于一个时间常数，的倒数ķ 我（S -1 ），从SFLS迹线的指数拟合计算（ RBC = 1 / ķ 我（RBC）= 1 / 0.110 s -1 = 9.0 s）。然后，P gly 值计算如下：

= 1.48 × 10 -6 厘米/秒

数据分析

停止流光散射实验应至少重复三次。由三至五个不同的人类红细胞悬液得到的所有数据均表示为平均值±SEM。在GraphPad Prism 5.0中通过双向ANOVA对数据进行统计分析，当P <0.05 时，结果被认为具有统计学意义。

菜谱

高渗溶液，由加入甘油的PBS组成（最终渗透压：500 mOsM ；最终体积：50 ml）
将0.730 ml的100％甘油添加到1 × DPBS中，轻轻混合直至完全混合。

已确认发言：

非常感谢意大利为“意大利国立科学基金会计划”（2017年，PRIN2017；拨款号为2017J92TM5）向GC提供的财政支持，以及Stiftelsen Olle EngkvistByggmästare对YS的财政支持。

本文的协议对象源自我们实验室的先前研究论文（Sonntag 等，2019）。

利益争夺

在一个uthors宣称没有利益冲突。

伦理

根据ICH / GCP指南，所有人类受试者均提供了书面知情同意书以参与研究。该协议已由当地道德委员会批准（授权号为FMF01-5870-27-02-2019 ）。

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