材料和试剂

1. 培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5606-400EA ）

2. 牙签

3. 5毫升移液器（Gilson，目录号：F123607）

4. 25mm直径的的Whatman ® 玻璃微纤维过滤器，GF级/ F（GE Healthcare公司，目录号：1825-025）

5. 待分析的酿酒酵母菌株（此处在BY4741或BY4742 酿酒酵母菌株上进行）

6. 酵母提取物KAT（Ohly，目录号：OHLY ® KAT）

7. 葡萄糖（Merck，目录号：1083469029 ）

8. EGTA（Acros Organic，目录号：409910250）

9. HCl 37％（VWR，目录号：20255.29）

10. Suprapur ® 硝酸65％（Merck公司，目录号：100441）

11. Certipur ® 为感应耦合等离子光谱单元素标准（Merck公司，目录号：取决于离子待分析）

12. Milli Q水

13. NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）

14. YD板（请参阅食谱）

15. YD介质（请参阅食谱）

16. 1 mM EGTA（1 L）（请参阅食谱）

设备

500 ml锥形瓶（VWR，货号：734-1833）
250毫升GL SS烧杯（VW R，目录号：213-1124P）
100毫升量筒（VW R，目录号：612-3836）
Haldenwanger TM 瓷坩埚（Thermo Fisher Scientific，目录号：12306507）
分析天平（梅特勒-托利多，目录号：AB104-S）
过滤器固定歧管（Hoefer，目录号：FH225V ）
实验室烤箱（Utest，目录号：UTD）
干燥器（VWR，目录号：467-0071P）
的Carbolite ® 马弗炉（Sigma-Aldrich公司，目录号：Z654973）
iCAP 6500 ICP-OES CID光谱仪（Thermo Fisher Scientific，已停产）

程序

样品制备
条纹的酿酒酵母株上YD板待分析S（- [R ecipe 1）。在28°C下孵育两天。
使用无菌牙签选择单个菌落。
将细胞重悬于100 ml YD培养基（500 ml Erlenmeyer）中（R ecipe 2），并在28°C搅拌（120 rpm）下生长至OD 600 为3 （OD 600 = 1对应于密度1.25） x 10 7 细胞/ ml）。
注意：在酵母生长之前，用10％HCl洗涤500 ml锥形瓶，以避免洗涤玻璃器皿所用的清洁剂对离子含量的影响。用M illi Q水冲洗并晾干。

使用玻璃微纤维过滤器在4°C的过滤器固定歧管上过滤100 ml培养物。
在4°C下用2 ml EGTA 1 mM（R ecipe 3）在滤膜上洗涤细胞两次。
在4°C下用2 ml Milli Q水洗涤细胞两次。
将每个过滤器浸入盛有10 ml M illi Q水的耐热瓷坩埚中10分钟。从坩埚中取出过滤器。
注意：在将任何样品引入瓷坩埚之前，请先将其称空，再称重，以进一步确定干物质的质量。

将瓷坩埚放在95°C的烤箱中过夜以干燥样品。图1总结了协议S teps A 4至A 8。
将瓷坩埚放在干燥器中8小时以进一步干燥。
称量瓷坩埚，以进一步确定干物质的质量。
注意：可以使用100 ml YD培养基（无细胞）进行步骤A 4至A 8。该样品将用作进一步测量的空白。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902865--1503 Louise Thines 636937 \ Figs jpg \ Fig 1--word.JPG

图1. 实验小号TEP 小号甲4至甲8. 这100 ml酵母培养物首先被过滤。然后，将滤膜上的细胞用EGTA 1 mM（两次）和M illi Q水（两次）洗涤。随后将带有洗净细胞的过滤器浸入装有10 ml M illi Q水的瓷制坩埚中。最后，移去过滤器，并将瓷坩埚放入烤箱中进一步干燥。

离子含量的测量
将样品放在马弗炉中在500°C下放置4 h。
重悬6.5％硝酸的灰烬（0.5毫升硝酸的65％+ 9.5 ml的中号ILLI QH 2 O）。
稀释默克公司的ICP标准溶液的浓度范围应覆盖待分析样品中的预期离子浓度。将标准溶液酸化为0.5％的硝酸（从65％的硝酸开始）。表1列出了我们研究中用于测量酵母离子含量的标准浓度。
测量每种标准品和样品的发射光。表2中给出了典型的仪器参数。表3收集了用于测量每种阳离子的波长和观察模式。
推断使用从标准建立校准曲线样品中的离子含量（见d ATA分析）。

表1.用于校准线的标准液（St）的浓度

元件

圣0

圣1

圣2

圣三

圣四

巴

0 ppm

0.5 ppm

1 ppm

2 ppm

4 ppm

钙

0 ppm

2 ppm

4 ppm

10 ppm

20 ppm

光盘

0 ppb

5 ppb

10 ppb

20 ppb

40 ppb

有限公司

0 ppb

5 ppb

10 ppb

20 ppb

40 ppb

铜

0 ppb

5 ppb

10 ppb

20 ppb

40 ppb

铁

0 ppm

0.1 ppm

0.2 ppm

0.4 ppm

1 ppm

ķ

0 ppm

10 ppm

20 ppm

40 ppm

100 ppm

镁

0 ppm

2 ppm

4 ppm

10 ppm

20 ppm

锰

0 ppb

20 ppb

40 ppb

100 ppb

200 ppb

娜

0 ppm

10 ppm

20 ppm

40 ppm

100 ppm

你

0 ppb

5 ppb

10 ppb

20 ppb

40 ppb

锌

0 ppb

200 ppb

400 ppb

1 ，000 PPB

2 ，000 PPB

表2. Thermo Scientific ICAP 6500 ICP OES上使用的典型仪器参数。

抽速

50转

喷雾器

同心

中心管

2毫米

火炬方向

二重奏（轴向和径向视图）

射频功率

1150瓦

冷却液流量

12 升/分钟

辅助流量

0.6 升/分钟

整合时间

轴向15 s / 径向20 s

表3. 十二个元素使用的波长和观察模

元件

波长（纳米）

观看模式

巴

455.403

径向的

钙

317.933

径向的

光盘

226.502 ; 228.802

轴向的

有限公司

228.616；230.786

轴向的

铜

324.754

轴向的

铁

259.940

径向的

ķ

766.490

径向的

镁

279.553; 285.213

径向的

锰

257.610

轴向的

娜

589.592

径向的

你

216.556 ; 221.647；231.604

轴向的

锌

202 548 ; 206.20 0 ; 213.560

径向的

数据分析

首先使用线性回归对发射光作为标准浓度的函数的校准曲线进行建模。校准线的验证参数是R 2 系数，最小值为0.999。图2提供了一个校准线示例。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902865--1503 Louise Thines 636937 \ Figs jpg \ Fig 2.JPG

图2. 根据五种标准溶液中镍（ppb）的浓度，发出的光的校准线

线性回归方程确定为：

其中A为直线的斜率，B为截距。然后使用该方程式通过以下方程式得出的光强度测量结果来推论待分析样品的浓度（以ppb或ppm为单位）：

然后可以将以ppm为单位获得的离子含量转换为每克酵母干物质微摩尔离子。为此，首先通过将空的瓷坩埚的质量减去干燥后包含电池的坩埚的质量来确定干物质的质量。然后根据下式将以ppm为单位的离子浓度转换为每克干物质的µmol离子：

对于MM，离子的摩尔质量以g / mol为单位。

表4列出了每种元素的定量限。

表4. 十二种元素的定量极限

元件

定量限

巴

0.01 ppm

钙

0.01 ppm

光盘

0.6 ppb

有限公司

0.5 ppb

铜

1 ppb

铁

0.01 ppm

ķ

0.05 ppm

镁

0.01 ppm

锰

0.5 ppb

娜

0.05 ppm

你

2 ppb

锌

2 ppb

菜谱

YD板
2 g（2％w / v）酵母提取物KAT
2 g（2％w / v）葡萄糖

2克（2％w / v）琼脂
用Milli Q水调节至100毫升并高压灭菌
倒入培养皿中

YD培养基
2 g（2％w / v）酵母提取物KAT
2 g（2％w / v）葡萄糖
用Milli Q水和高压灭菌器调节至100 ml

1毫米EGTA（1升）
0.3804克EGTA

用NaOH将pH调节至8.0

致谢

这项工作得到了国家科学研究基金会的资助（FNRS，授予PDR-T.0206.16）。LT是“工业与农业合作社基金会”的研究员。我们感谢Anne-Sophie Colinet之前的协议开发。

利益争夺

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

参考文献

Thines，L.，Deschamps，A.，Sengottaiyan，P.，Savel，O.，Stribny，J.和Morsomme，P.（2018）。酵母蛋白Gdt1p转运Mn 2+ 离子，从而调节高尔基体中的锰稳态。生物化学杂志293（21）：8048-8055。
Dahlquist，R 。L.和Knoll，J 。W. （1978）。电感耦合等离子体原子发射光谱法：分析主要，痕量和超痕量元素的生物材料和土壤。应用光谱32（1）：1-30。
Eide，D.J. ，Clark，S.，Nair，T.M.，Gehl，M.，Guerinot，M.L 。，和Harper，J.F 。（2005 ）。酵母离子组的表征：酿酒酵母中营养矿物质和微量元素稳态的全基因组分析。Genome Biol 6（9）：R77。