材料和试剂

未处理的48孔板（CytoOne ，STARLAB GmbH，目录号：CC7672-7548）
48孔板，经组织培养（tc ）处理（greiner cellstar 板，Sigma-Aldrich，目录号：M8937-100EA）
96孔板（U型，LIFE Technologies ，目录号：N8010560）
Jurkat E6.1 T细胞（Schneider 等，1977，CVCL_0367）; 在RPMI / 10 ％FCS 中培养[v / v]
Mono Mac 6，MM6（Ziegler- Heitbrock et al。，1988，CVCL_1426）; 先前产生了Dectin-1过表达的MM6细胞（Bode 等，2019）; 以RPMI1640 / 10 ％FCS / 1％OPI 培养[v / v]
骨髓来源的树突状细胞（BMDC）；参见Bode 等。（2019）获取更多信息BMDC生成
牛提取的过氧化氢酶（Carl Roth，目录号：6025.1），在-20°C下储存，粉末保质期≥6个月，仅在溶液中1天
Trolox（Th。Geyer，目录号：CAY10011659-250），在4°C下储存，粉末保质期≥6个月，仅在溶液中≤3周
二甲基亚砜，无菌过滤（BioPerformance 认证，Sigma-Aldrich，目录号：D2438）
sgp91 d- tat ，加扰（Anaspc ，目录号：AS-63821），在-20°C下储存，保质期≥24个月，避免反复冷冻和解冻
gp91 ds- tat （Anaspc ，目录号：AS-63818），在-20°C下储存，保质期≥24个月，避免重复冷冻和解冻
GSK2795039（MedChem Express，目录号：HY-18950），在-20°C下储存，保质期≥3个月，避免重复冷冻和解冻
RPMI 1640（Sigma-Aldrich ，目录号：R8758-500ML）
胎牛血清，FCS（Sigma-Aldrich，目录号：12133C-500ML），在-20°C下储存，保质期≥12个月
OPI补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：O5003），在-20°C下储存，保质期≥12个月
多粘菌素B硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P4932），在4°C下储存，粉末保质期≥12个月，仅在溶液中≤2周
H 2 DCFDA （Sigma-Aldrich，目录号：D6883），在-20°C下储存，保质期≥24个月，避免重复冷冻和解冻循环
N-乙酰半胱氨酸，NAC（Sigma-Aldrich，目录号：A7250），在4°C下储存，保质期≥6个月，但在溶液中仅需1天
Phorbol-12-myristat-13-acetate（PMA； Sigma-Aldrich，目录号：P8139-1MG），在-20°C下储存，保质期≥6个月，但在溶液中仅1天，避免重复冷冻和解冻循环
耗尽的酵母聚糖（DZ; Invivogen ，目录号：tlrl-zyd ），在-20°C的溶液中储存，保质期≥12个月，避免反复冷冻和解冻循环Gibco TM PBS，pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，目录号： 11503387）
500 mM H 2 DCFDA解决方案（请参阅食谱）
100 mM Trolox解决方案（请参阅食谱）
100 mM NAC解决方案（请参阅食谱）
1 mM Trolox停止溶液（请参阅食谱）
1 mM NAC停止溶液（请参阅食谱）
过氧化氢酶混合物（约10,000 U / ml）（请参阅食谱）
gp91 ds- tat ，加扰的解决方案（请参见食谱）
gp91 ds- tat 解决方案（请参阅食谱）
GSK2795039解决方案（请参阅食谱）

设备

保温箱（Heracell VIOS 160i，Thermo Fisher Scientific或类似产品，调节温度为37°C和5％CO 2 ）
离心机（Thermo Scientific Multifuge X1R Multi-Application，Thermo Fisher Scientific或具有96孔嵌体的类似产品）
单道移液器，2-20微升（G 威尔逊，目录号：F144056M;或类似的产品），使用适当的标准移液管尖端（灭菌）
单道移液器，20-200微升（G 威尔逊，目录号：F144058M;或类似的产品），使用适当的标准移液管尖端（灭菌）
8通道移液器，30-300 µl（Eppendorf Research，目录号：3125000052；或类似产品），使用适当的标准移液器吸头（已灭菌）
流式细胞仪（FACSCanto II，BD Biosciences）

软件

1。 Graph Pad Prism版本6（PrismGraphPad Software Inc.，SCR_002798）

2. FlowJo ，版本7.6.5（BD Biosciences，SCR_008520）

程序

准备储备溶液和反应混合物（无菌条件）

平板细胞（无菌条件）（另请参见图1中的代表性移液方案）
对于MM6和Jurkat T细胞，请使用未经处理的48 孔板，对于粘附细胞（如BMDC和原代单核细胞），请使用经tc 处理的板。
用200 µl单道移液器将100,000个细胞/孔（内部24个孔）置于140 µl RPMI1640 / 10％FCS中。
在37°C下孵育30分钟。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003115--1469 Heiko Weyd 856884 \ Figs jpg \图1.jpg

图1 。代表性的移液器方案。用大约200 µl培养基（灰色圆圈）填充外部孔，以防止样品孔蒸发。板在24个内孔（空心圆）中的细胞。在左侧的12孔中添加培养基或适当的对照，在右侧的12孔中添加适当的ROS抑制剂（用虚线分隔）。加入培养基或适当的参照对照（-），阳性对照（例如Phorbol-12-myristat-13-乙酸盐（PMA）或耗尽的酵母聚糖（DZ）（+））和感兴趣的ROS诱导剂（X），一式四份（或至少一式三份）。

向细胞中添加ROS抑制剂或适当的对照（无菌条件）（另请参见图1中的代表性移液方案和表1中ROS抑制剂的详细信息）

表1 。所用ROS抑制剂的规格

ROS抑制剂

特异性

可互换

过氧化氢酶

细胞不可渗透；专门催化H 2 O 2 分解为H 2 O和O 2 。

--

NAC

细胞渗透性 NAC的巯基可还原各种自由基，例如H 2 O 2，羟基和次氯酸。

Trolox

Trolox

细胞渗透性减少细胞内过氧化物的形成，淬灭超氧化物，从而增加H 2 O 2 降解。

NAC

gp91 ds-tat

细胞渗透性这种NOX-2特异性肽抑制剂由与人免疫缺陷病毒tat肽连接的gp91phox（NOX-2）序列组成。tat序列促进该肽进入所有细胞。gp91 ds-tat 抑制NOX-2组装。

GSK2795039

GSK2795039

细胞渗透性 NOX-2特异性小分子抑制剂。

gp91 ds-tat

在RPMI1640 / 10％FCS中制备ROS抑制剂稀释液
过氧化氢酶：最终浓度至少为2,000 U / ml；参考控制：RPMI1640 / 10％FCS 。
Trolox：最终浓度为5 mM；参考控制：等体积的DMSO 。
NAC：最终浓度为5 mM；参考控制：RPMI1640 / 10％FCS 。
gp91 ds-tat：最终浓度至少10 µM；参考控件：gp91 ds -tat scrambled 。
GSK2795039：最终浓度为1-4 µM；参考控制：等体积的DMSO 。
将装有种子细胞的平板放在预热的（37°C）金属衬底上。
通过使用20 µl单通道移液器添加10 µl抑制剂或对照溶液。
将板置于细胞培养箱中，在37°C下放置30分钟。

向细胞中添加ROS诱导处理或适当的对照（无菌条件）（见图1 ）
准备在RPMI / 10％FCS中的PMA [100 ng / ml]等处理溶液。
将装有种子细胞的平板放在预热的（37°C）金属衬底上。
使用200 µl单通道移液器添加50 µl处理溶液，并在37°C的细胞培养箱中孵育0.5-3小时（最佳孵育时间取决于各个处理，需要凭经验确定（例如，通过动力学方法）。

在孵育的最后30分钟，向细胞中添加H 2 DCFDA溶液（无菌条件）
在RPMI / 10％FCS中准备H 2 DCFDA 溶液。
将装有种子细胞的平板放在预热的（37°C）金属衬底上。

通过使用20 µl单道移液器添加10 µl H 2 DCFDA 溶液（终浓度5 mM），并在37°C 的细胞培养箱中精确孵育30分钟。
最后，向细胞中加入Trolox或NAC溶液以终止反应（无菌条件）
将装有种子细胞的平板放在预热的（37°C）金属衬底上。
使用200 µl单通道移液器添加50 µl终止液，并在37°C下孵育10分钟。

准备要分析的细胞
将装有接种细胞的培养板在4°C的黑暗环境中放置10分钟，以减慢细胞代谢（在此步骤中，可以添加针对特定细胞表面标志物的荧光标记抗体来区分亚群；请勿使用FITC-或Alexa488-标记的抗体）。
通过使用200 µl单通道移液器（3-4次）小心地重悬细胞，并将细胞转移到96孔板（U形）中。
在4°C 下以300 xg 旋转细胞5分钟。
快速去除上清液。
使用300 µl 8通道移液器将细胞重悬于300 µl冰冷的Trolox或NAC终止溶液中。

通过FITC通道内的流式细胞仪分析细胞（另请参见图2）
将细胞放在黑暗中的冰上。
通过形态学对活细胞的门控（FITC阳性事件代表活细胞和代谢活跃的细胞）。
通过使用前向散射（FSC）-A和FSC-H排除细胞双峰。
加入终止溶液后1小时内尽快进行测量。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003115--1469 Heiko Weyd 856884 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.使用H 2 DCFDA 进行细胞内ROS检测实验的门控策略和数据分析。A.细胞中的ROS产生导致H 2 DCFDA转化为绿色荧光化合物，可以通过流式细胞术在FITC通道内检测到该化合物。门控活细胞（由形态和/或门控FITC阳性事件确定；未显示），并通过使用前向散射（FSC）-A和FSC-HB代表直方图描绘Dectin-1中的ROS诱导来排除细胞双峰在未经预处理的MM6细胞（左直方图）或过氧化氢酶预处理的MM6细胞中，重组膜联蛋白A1（蓝色）介导的过表达MM6细胞与未处理（灰色）相比（右直方图； Ziegler- Heitbrock 等，1988）。C.一式三份定量的代表性实验。平均值± SD 。描绘了FITC-平均荧光强度（MFI）的平均值。D.六个独立实验的统计分析。平均值± SD 。描绘了相对于过氧化氢酶预处理的细胞，未预处理的MM6细胞相对FITC-MFI的增加百分比（MFI处理– MFI未经处理）/ MFI未经处理* 100）。此子图来自Bode 等人。，2019. *** P <0.001（配对的两尾t 检验）。E. 使用NOX-2特异性肽抑制剂，在过量表达Dectin-1的MM6细胞中，通过100 ng / ml Phorbol-12-肉豆蔻酸13-乙酸盐（PMA）和40 µg / ml 耗尽的酵母聚糖（DZ）诱导代表性ROS gp91 ds - tat 或对照肽（Ctrl。）按D组定量。平均值± SEM 。显示了一式三份（DZ）或四份（PMA）。

数据分析

细胞内ROS诱导H 2 DCFDA转化为细胞不可渗透的绿色荧光产物，可通过流式细胞术在FITC通道（Ex：488 nm / Em ：519 nm）中将荧光定量，作为平均值/中值荧光强度（MFI）。为了确定治疗诱导的ROS信号，应将MFI标准化为未经处理（或对照）的细胞（（经MFI处理–未处理的MFI）/未经处理的MFI * 100）。对于每个独立的实验，每个条件至少要重复三次。为了进行统计分析，至少进行3个独立实验，并总结特定FITC-MFI相对于上述未处理或对照处理的细胞的百分比增加（参见图2 ），并使用配对的双尾 t 检验确定ROS产生的显着差异。

笔记

将H 2 DCFDA以与添加处理相同的顺序添加到孔中。
强烈建议使用新鲜配制的Trolox和NAC解决方案。
使用通宵氧化的RPMI1640 / 10 ％FCS 空气可以提高测量的灵敏度。
同时处理不超过48个孔/反应（2个板），以确保较短的测定时间。

菜谱

500 mM H 2 DCFDA解决方案
在DMSO中

小号在-20℃下torage; 保质期≤24个月，避免反复冷冻和解冻

100 mM Trolox解决方案
在DMSO中

小号在4℃torage; 保质期≤3个月

100 mM NAC解决方案
在PBS中

甲djust pH至7.4

小号在4℃torage; 保质期1天

1 mM Trolox停止溶液
在RPMI1640 / 10％FCS中[ v / v ]

小号在4℃torage; 保质期1天

1 mM NAC停止解决方案
在RPMI1640 / 10％FCS中[ v / v ]

小号在4℃torage; 保质期1天

过氧化氢酶混合物（约10,000 U / ml）
在RPMI1640 / 10％FCS中[ v / v ]

小号在4℃torage; 保质期1天；请勿使用金属匙转移过氧化氢酶粉末

gp91 ds- tat
按照厂家专业è [R 的指令

小号torage在-20℃下，保质期≥24个月避免反复冷冻和解冻循环

gp91 ds -tat ，加扰的解决方案
根据加扰厂家专业 ë [R ' S代码

小号torage在-20℃下，保质期≥24个月避免反复冷冻和解冻循环

GSK2795039 解决方案
根据厂家专业È ř 的在-20℃下，保质期≥3个月，避免反复冷冻和解冻循环指令时，存储

Acknowledg 发言：

我们感谢J.施泰纳R. 踯躅，T. Machauer ，M.特拉普，五纽鲍尔和T.Vornbäumen（所有的德国癌症研究中心，海德堡，德国）的技术支持。我们也感谢K.Gülow （德国雷根斯堡大学医院）进行的重要讨论。此外，我们感谢H. Sauter出色的秘书协助。我们也感谢V. Heil校对了手稿。这项工作得到了德国联邦教育和研究部VIP +验证基金的支持。该协议改编自Bode及其同事的先前工作（Bode 等人，2019）。

利益争夺

作者声明不存在经济或科学利益冲突。

伦理

BMDC的生成已获得巴登-符腾堡州（DKFZ346）的兽医当局（RegierungspräsidiumKarlsruhe ）的批准。

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