材料和试剂

注射器，50毫升，鲁尔（Thermo Fisher Scientific，目录号：S7510-50，稳定性：室温）
超速离心管，14 x 89毫米，敞开式多透明膜（Seton Scientific，目录号：7030，稳定性：室温）
管，锥形螺帽，50毫升（美国科学公司，产品目录号：1500-1811，稳定性：室温）
1.5毫升微量离心管（美国科学公司，目录号1615-5599，稳定性：室温）
一次性无菌瓶顶过滤器0.22 µm（Corning，目录号：431118）
秀丽隐杆线虫
cOmplete Mini，不含EDTA，蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：11836170001，在2-8°C下稳定性：> 1年）
环己酰亚胺（国际研究产品，目录号：9880，稳定性：在-20°C下> 2年）
EGTA（国际研究产品，目录号：E57060-25.0，稳定性：室温）
六水合氯化镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：M35-500，稳定性：室温）
七水合硫酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：M1880-500G，稳定性：室温）
1.5毫升微量离心管的杵（美国科学公司，目录号：1615-5599，稳定性：室温）
移液器吸头，TipOne 超低保留过滤器吸头，无菌，200 µl（美国科学公司，目录号：1180-8810，稳定性：室温）
磷酸二氢钾（国际研究产品，目录号：P41200-500.0，稳定性：室温）
RNA酶抑制剂，SUPERase·在2 ，500 U / 20微升（赛默飞世尔科技，产品目录号：AM2696，稳定性：未知）
RNaseZap （Thermo Fisher Scientific（Invitrogen / Ambion ），目录号：9780，稳定性：未知）
氯化钠（国际研究产品，目录号：S23020-5000.0，稳定性：室温）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：30970-25G，稳定性：在-20°C下> 2年）
磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3264-500G，稳定性：室温）
蔗糖（国际研究产品，目录号：S24060-1000.0，稳定性：室温）
Tris-HCl（国际研究产品，目录号：T60050-500.0，稳定性：室温）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-6878，稳定性：室温）
0.5 M EGTA储备溶液（请参阅配方）
1 M MgSO 4 储备溶液（请参阅配方）
M9缓冲区（请参阅配方）
蠕虫溶解缓冲液（请参阅食谱）
10 x 高盐分离缓冲液（请参阅食谱）
高盐分离缓冲液中的蔗糖溶液（请参见配方）

设备

天平数字化TS-T系列高级实验室（Thomas Scientific，目录号：1160T82）
离心机，台式，冷藏，Eppendorf，5430R（Thomas Scientific，目录号：1227T47）
无绳均质机单元（Thomas Scientific，目录号：1191H98）
滤光片，一套LED激发滤光片和2个用于EGFP荧光的发射滤光片（BioComp 仪器，目录号：FC-2-EGFP）
Triax流通池，带有用于双UV和荧光扫描的FC-1监视器（BioComp Instruments，目录号：FC-2-UV / VIS -260）
精馏塔，活塞梯度/梯度站（BioComp 仪器，型号153分之152），或者样品的分馏使用密度梯度分级分离系统（Teledyne公司ISCO，来实现Ç atalog号码：68-1610-010，60-3877-060，60 -0084-054，68-1140-006，68-0940-016）
移液器，每套4个，ErgoOne ，单通道（美国科学公司，目录号：7104-2521）
14号套管，4英寸（Thomas Scientific，目录号：8957G54）
Platform Rocker，Vari -Mix（Thermo Fisher Scientific，目录号：M79735Q）
转子，TH-641（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC1235764）
超速离心机，Sorvall ，WX 80 Plus（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC1235763）
Vortexer V-32（Thomas Scientific，目录号：1154J82）
-80 °C冰箱（Thermo Scientific Revco Elite Plus，目录号：ULT2586-6-D）

软件

R版本3.6.1，用于统计计算的R项目，https：//www.r-project.org/
提供的R脚本' PolysomeProfileAUC.R '
FlowCell 1.56版，BioComp仪器，http： //biocompinstruments.com

程序

蔗糖渐变装配（图3）
为了最大程度地提高重现性，我们建议准备大批用于形成梯度的蔗糖溶液。我们通常在高盐分离缓冲液中配制500 ml 50％和5％的蔗糖溶液（方案4）。通过使用真空将溶液分别通过0.22 µm 无菌瓶顶过滤器来对溶液进行无菌过滤。将无菌溶液的等分试样在4°C的50 ml锥形管中储存。蔗糖溶液可以在4°C下保存3个月而不会影响性能。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902828--1508 Jarod Rollins 810785 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

图3 。蔗糖梯度形成。答：使用套管将重质蔗糖溶液置于轻质溶液下。B.分配重溶液后，以一定角度插入盖子，以使空气逸出并防止形成气泡。

使用前，用RNaseZa p 处理离心管和插管。喷涂管子内部以确保表面被涂层。可能需要旋转或涡旋以均匀地覆盖表面。用不含RNase的水冲洗试管3次，并在使用前使其干燥。
在形成梯度之前，让5％和50％的蔗糖溶液达到室温。
将每个试管放在Biocomp提供的标记块中，并在试管侧面标记填充线。
使用带有干净插管的5 0 ml注射器，将5％的“蔗糖”填充到填充线的正上方。转移时，请注意不要将气泡引入溶液中。
使用第二注射器和套管的5％的溶液（图下沉积该“重” 50％蔗糖URE 3A）。
从套管底部的套管末端开始，然后逐渐升高套管尖端，使其浓度上升50％。
当重层和轻层之间的界面位于填充线时，停止分配。
快速小心地拔出套管，以免引起气泡或干扰两层。
使用Biocomp提供的塞子盖住离心管。首先将带孔的盖子末端放入管中，然后如图3B所示插入其余的盖子。
任何多余的溶液将被推入瓶盖的孔中。
如果“轻”溶液的液位低于瓶盖，请取下瓶盖，然后在试管顶部添加更多溶液。管中不应有气泡，否则会导致混合不均匀。
如果气泡留在盖的边缘，则将其取下，擦干，然后再次尝试插入。
将所有加盖的试管放入磁架中，然后将其放在板的中心。
打开Biocomp Gradient Station并选择GMST进入Gradient Master Station模式。
确保使用气泡水准仪将旋转平台调平。
按GRAD，然后按LIST以查看预编程的梯度。
选择“ Short Sucr 5-50％vw ”（渐变）（短帽和蔗糖），然后按USE。
该平台将倾斜，旋转和混合这两个部分，以形成一个完美的线性梯度。
在过程中检查试管，以查看试管中是否有气泡运动，如果看不到，则放弃梯度并重新开始。
完成后，电台将发出哔声。离心之前，将梯度置于4°C冷却。虽然这些梯度通常都很坚固，但请注意将其因碰撞或倾斜管而受到的干扰降到最低。

蠕虫溶解
1. 按照食谱4中所述准备新鲜的蠕虫溶解缓冲液。对于六种曲线，我们通常准备10毫升。

2. 对于每种配置文件，将350 µl增溶缓冲液等分到1.5 ml微量离心管中。

3. 在每个等分试样中加入5 µl SUPERase·In 。将试管放在冰上以备裂解。

4. 该方案需要每个梯度150 µl密集包装的成年成虫线虫，每个梯度以获得良好的效果。每个执行的梯度大约有15,000个蠕虫。可以通过在4-6 100 mm NMG平板上培养蠕虫来获得此数量的蠕虫。蠕虫不应饿死/挖洞进行剖析。请参阅生物协议“蠕虫同步”（He）以获取与年龄同步的成虫。

5. 对于每种条件/菌株，在50 ml锥形管中使用总共15 ml M9缓冲液将板子上的蠕虫洗净。

使蠕虫在50 ml锥形瓶中重力沉降2-5分钟。
当大多数蠕虫已经沉降到底部时，从圆锥形的底部吸取1 ml蠕虫浆液并放入1.5 ml微量离心管中。
重力再次沉降并尽可能多地除去M9，然后用1 ml新鲜的M9洗涤。
重复清洗两次以上，直到没有细菌为止，通常总共清洗3次。
最后一次洗涤后，尽可能多地除去M9，然后使用台式离心机以不超过2,000 xg的速度短暂旋转离心管。
离心后，蠕虫将直接装在试管底部。快速吸取剩余的M9（约20 µl）以进一步浓缩蠕虫。
使用末端截留3 mm的低保留过滤器尖端，除去150 µl浓缩的蠕虫浆液，并将其转移到350 µl蠕虫溶解缓冲液的等分试样中。
缓慢上下移液以确保没有蠕虫粘附在移液器吸头上。
6. 立即用一次性塑料杵将蠕虫在冰上匀浆1分钟。注意不要产生太多泡沫，因为匀浆会从管中溢出。在匀浆过程中，我们通常在试管中使用60冲程的杵。船尾呃均质化，增加一个附加的200微升蠕虫溶解缓冲液到管上。让匀浆使用管式旋转器在4°C下溶解30分钟以混合样品。或者，将试管放在冰上并用手倒置以每10分钟混合一次。

7. 在4°C下以14,000 xg 旋转裂解物5分钟以沉淀碎片，并将上清液转移到预冷的试管中。

8. 拆下100 μ 升裂解上清液，并将其放置到一个第二预冷管并保持在冰上，直至级分已被收集。这将用作裂解液的匹配对照“总RNA”样品。该等分试样将用于定量存在于裂解物中的RNA。如果要通过qPCR或mRNA测序比较总级分和多体级分中的转录本，也可用于RNA分离。

将裂解液加载到梯度上
1. 将梯度加载到尽可能靠近超速离心机的位置，以最大程度减少运输过程中的混合。

梯度必须彼此平衡在0.001 g之内。
称重前，请小心清除管子和水桶中的冰，水和冷凝物。
即使转子空了，也必须在转子中使用所有转子叶片。
将离心机预冷至4°C，并确保将其抽至适当的真空度。
2. 用移液管从梯度的顶部除去300 µl，以准备加载的梯度。这是为了确保有足够的空间添加样品。

将支架，管子，铲斗和盖子的重量一起去皮。
接下来，取将要与第一个样品相反离心的梯度，并使用移液器从顶部除去梯度，直至其重量与第一个试管相同。最佳值为300 µl，但铲斗和试管的重量可以变化。
对要运行的每对渐变重复此过程。
建议不要加载超过300 µl的样品（例如，不超过2.5毫米厚的层），以保持轮廓的分辨率尽可能高。但是，在某些情况下，需要更多负载才能获得足够的信号。加载了多达500 µl的样品，而轮廓图中的分辨率没有明显损失。
根据步骤B 6中制备的裂解物估算，我们总能获得200-300 µg RNA的总质量，从而始终获得良好的结果。
将梯度放入由多用途试管架固定的转子铲斗中，然后放在秤上。
3. 将第一个梯度返回到天平，并加载300 µl裂解液。

这是通过使用200 µl吸头并用移液器吸取150 µl两次来实现的。
为了获得最佳效果，将移液器保持在约45°的位置，并将吸头置于弯液面下方，并以表面张力将其提起，如图4所示。
缓慢分配裂解物。您应该看到它在顶部形成一个离散层（类似于浮油）。装入300 µl后，将天平上的重量去皮。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902828--1508 Jarod Rollins 810785 \ Figs jpg \ Fig4.jpg

图4 。将裂解物加载到蔗糖梯度上。随着摆动桶中的梯度缓慢地以45°角移取裂解液。

4. 像以前一样，将相反的梯度放在天平上并加载样品，直到去皮重回到0.000。

同样，在理想情况下，该浓度应为300 µl，与第一个试管中的体积相同。
对所有相对的管重复上述步骤。
一旦所有梯度均加载完毕，将帽拧到转子桶上，将桶挂在转子上，然后将转子放入超速离心机中。
确保遵循所有制造商的超速离心机使用指南。
5. 离心247 ，103.6 XG （使用TH-641转子38000转）。

将每个组的加速度和减速度设置为9（最大值）。
在两个小时的总的1.14E11ω 2 Ť力将被施加到所述梯度。

准备渐变站
1. 在等待离心机运行完成之前，开始准备分馏器上的梯度静态分析（耗时> 30分钟）。

2. Ť 从菜单站并选择扫描上瓮。

打开笔记本电脑并打开Triax 软件。
选择用户个人资料，然后填写实验详细信息。
使用单荧光扫描选择UV OD。
将过滤水注满注射器储液器，并将烧杯置于泵管出口下方。
3. 确保馏分收集器臂（如果使用）在废料盘上方，并且有一个烧杯供流过的物料收集。

4. 灌注水泵。

向下扳动右侧的拨动开关，然后按RINSE键使泵接合。
一旦水流流出，将拨动开关返回至上位置。
5. 再按一次RINSE，用至少10毫升水清洗管道。

6. 打开活塞臂上的黄铜阀，并用泵中的10 s空气干燥管道，然后关闭黄铜阀。

7. 如果要使用自动收集，请打开馏分收集器。

如果要使用馏分收集器，请选择“扫描设置”以设置所需的馏分。
否则，请在软件中选择“转到图形”。
8.系统将提示您将流动池检测器归零。

UV和Fluor可以同时被消隐。
使用带有鲁尔锁接头的50毫升注射器手动将水推过活塞和流通池。
水在流通池中时将检测器归零。
9. 消隐后，以每秒一滴的速度将水推入系统。

使用图表确保读数恒定且没有峰值。
理想情况下，吸光度应约为0.00012任意单位（AU）。
如果吸光度有较大的通量，请再用10毫升水冲洗以除去碎屑并再次遮盖。
10. 从活塞上拆下适配器，并用活塞尖更换，注意不要拧得太紧。

11. 按站上的AIR键清除流通池。吸光度应升至约0.5 AU。

扫描和分数梯度
1. 将梯度管的顶部插入管架盖。

然后将带有盖的试管放入支架。
注意将盖子的凹槽与固定器中的螺钉对齐，然后旋转盖子以将其锁定到位。
将支架滑过卡口（在活塞下方），然后将其旋转90°以将其锁定到位，从而将其锁定在工作站上。
有关这些步骤的更多详细信息，请读者阅读Biocomp 分馏器手册。
2. 单击开始运行。

扫描参数将显示为提醒。
单击确定。
3. 将提醒您从系统中冲洗掉剩余的先前样品，并风干通向流通池的管线。

如果这是运行的第一个试管，则已经完成。
单击确定，活塞将开始下降。
4. 到达梯度起点时，系统将检测到弯液面并自动开始记录。

该图将重置，并在样品通过流通池时实时绘制吸光度。
要查看荧光读数，请在软件中单击相应的框。
5. 该图将显示一条绿线，滞后于UV信号（黑线），该绿线表示样品何时从管中出来（基于在“扫描设置”中输入的管长）。使用它进行手动馏分收集。

6. 第一个峰将是游离核糖核蛋白，然后是40S亚基，60S亚基，然后是单核糖体（见图1）。随着单体峰的下降，准备开始收集多核糖体组分。

7. 将多核糖体级分收集在冰上的15ml锥形杯中。

开始时，绿线接近第一峰收集disomes 。
该多核糖体峰开始于梯度的约26.5 mm。
继续收集直到渐变结束。
总体积约为5毫升。
8. 一旦活塞到达管的底部，它将自动上升到起始位置。

9.系统将提示您按下AIR按钮吹干流通池中的剩余样品。清除所有液体中的管线后，单击“确定”。

10.系统将要求您保存运行。

单击“是”，您可以根据需要更改文件名和位置。
如果单击“否”或发生错误，通常可以通过选择“文件”>“救援丢失的数据”来恢复文件。
可以通过单击“新运行”以相同的设置运行下一个试管。在软件中。
您可以选择将检测器重新调零，但这通常仅在运行过程中引入碎屑的情况下才需要。
碎片可能显示为吸光度的峰值。
如果引入了碎屑，请用10毫升水冲洗系统，然后重复准备梯度站的步骤D 6 - D 1 1 。

样品储存
收集馏分后，将其放在冰上进行进一步处理。
对于长期存储，将分数保持在-80 ℃。

数据分析

吸光度和荧光数据保存为每个配置文件的逗号分隔文件（.csv）。该数据可用于绘制谱图并量化主动翻译核糖体的比例。使用提供的R函数polyproA UC （）（补充文件1）来确定与40S，60S，80S单核糖体和多核糖体峰相对应的峰的曲线面积。在下面的例子中，我们进行了多核糖体仿形使用C. 线虫菌株CZ18550 （野间等人，2017），其中大核糖体蛋白RPL-29已被GFP标记。提供了两个示例文件“ rpl-29_20C.csv”（补充文件2）和“ rpl-29_35C.csv”（补充文件3）。这些示例将用于检查热冲击对多核糖体和单核糖体级分的曲线下面积（AUC）的影响。此外，该实验证明RPL-29与60S大核糖体亚基和多核糖体相关，但与40S亚基不相关（图5）。以下说明假定csv文件位于您的工作目录中。如果不是，请确保在以下命令中包括其路径。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902828--1508 Jarod Rollins 810785 \ Figs jpg \ Fig5.jpg

图5 。在控制（左）或热休克（右）条件下，秀丽隐杆线虫菌株CZ18550（juSi123 [rpl- 29 :: GFP] II。）的荧光多聚体图谱。RNA的吸光度绘制为黑色，RPL-29 :: GFP的荧光显示为红色。热休克1小时后，信号从多核糖体转移到单核糖体，表明整体翻译率降低。RPL-29 :: GFP的信号不在40S峰中，但存在于60S峰和多核糖体中。该结果证实RPL-29与大的核糖体亚基和活性核糖体相关。

加载功能
型源（“ PolysomeProfileAUC.R ”）到R控制台，然后按回车。
首次加载脚本时将安装软件包“ MESS”。

使用控制示例中的数据运行函数polyproAUC （）
键入polyproAUC （ 'RPL-29_20C.csv'）到R控制台，然后按回车。
绘制的轮廓将如图5所示，并且光标应显示为十字线。

现在，您将用鼠标光标单击该图以指示该函数每个峰的位置
首先单击40S峰的起点。
第二次点击是在基线的底部的40S和60S的峰之间。
第三次单击位于基线的底部，在60S和80S峰值之间。
第四次单击位于80S和多核糖体起点之间基线的底部。
第五次单击位于基线的底部，位于第5 个和第6 个多核糖体峰之间。
这会将峰分为具有2-6个核糖体和大于6个结合核糖体的mRNA 。
前者将被报告为输出中的“低”多核糖体级分，因为这些mRNA的翻译效率较低，因为结合的核糖体较少。
后者将被报告为输出中的“高”多核糖体组分，因为由于结合更多的核糖体，它们的翻译效率更高。
第六次也是最后一次点击是在多核糖体峰的末端。
如果单击不正确，则必须重复此过程。

最后单击鼠标后，控制台将报告结果
提供每次单击代表的渐变中的位置以供参考。
对于RNA吸收通道，以曲线下总面积的百分比形式给出40S，60S，80S，低，高和总多核糖体峰的AUC。
40S，60S，80S和多核糖体峰的荧光通道以曲线下总面积的百分比表示。
如果功能与“Excel的选项运行，例如，polyproAUC （“RPL-29_20C.csv”，“的Excel”）的结果，而不是放置在剪贴板粘贴到电子表格。
曲线下的计算百分比应与表1中计算的百分比相似。
可以使用t 检验对三个以上生物重复的条件进行比较，以比较条件之间曲线下面积百分比的差异。

表1. 对照（20°C）和热激（35°C）RPL- 29 :: GFP 秀丽隐杆线虫的不同核糖体形式的曲线下面积百分比。给出了RNA吸收通道（RNA）和GFP 荧光通道的百分比。轮廓是相同的如图1所示URE 5.多核糖体从该区域的70.2％减少的曲线下到47.1％，由于热冲击。提供了每种形式的梯度起始位置（以毫米为单位），但多聚体的末端位置除外。具有2至6个核糖体的低– mRNA 。结合了> 6个核糖体的高mRNA 。

值

40S

60S

80S

低

高

多核糖体

位置

11.0

15.1

20.0

26.3

47.0

75.3

控制

核糖核酸

5.4

6.3

18.1

32.9

37.3

70.2

荧光性

2.5

4.6

13.8

30.9

48.3

79.2

值

40S

60S

80S

低

高

多核糖体

位置

11.0

15.1

19.3

27.0

45.9

77.9

热休克

核糖核酸

5.2

6.7

41.0

17.9

29.3

47.1

荧光性

2.2

6.5

31.1

18.9

41.3

60.2

笔记

一个常见的错误是没有培养足够多的蠕虫以使每个轮廓具有150 µl的颗粒。有太多蠕虫而不是蠕虫最好。
可以使用成年后第三天以上的蠕虫进行轮廓分析，但是由于翻译速度通常会随着年龄的增长而降低，因此可能需要更多的起始材料才能在轮廓图中产生较强的信号。对于角质层较硬的老蠕虫，我们还建议将研杵的研磨时间增加10 s，将在冰上溶解的时间增加10分钟。
如果RNP信号太大，可能会与40S峰值重叠。如果在这种情况下需要定量40S峰，我们建议再离心30分钟或减少施加到梯度上的裂解物的量。
多核糖体峰的末端是信号在梯度末端附近开始趋于平坦的位置。

菜谱

0.5 M EGTA储备溶液（100毫升）
向80 ml去离子H 2 O中添加19.0 g EGTA
在搅拌的同时，监测pH值，因为缓慢添加NaOH颗粒以达到pH 8.0
加入去离子水H 2 O至100 ml最终体积。
注意：直到约pH 7.5，EGTA才进入溶液。

室温保存
1 M MgSO 4 储备溶液
称重246.48 g的硫酸镁七水合物（MgSO 4· 7H 2 O）
加入去离子水H 2 O至1.0 L
高压灭菌
室温保存
M9缓冲液
22毫米KH 2 PO 4

42毫米Na 2 HPO 4

86毫米氯化钠

1毫米MgSO 4

1升M9缓冲液

3.0克KH 2 PO 4

6.0克Na 2 HPO 4

5.0克氯化钠

将去离子H 2 O加入999毫升
高压灭菌
溶液冷却后，无菌加入1 ml 1 M MgSO 4 储备溶液
圣在室温下矿石
蠕虫溶解缓冲液
50 mM的Tris-HCl（pH 8.0）

300毫米氯化钠

10毫米MgCl 2

1毫米EGTA

0.1 mg / ml环己酰亚胺

1％Ť 瑞通X -100

0.1％脱氧胆酸钠

1x 无EDTA的全酶蛋白酶抑制剂

125 U / µl SUPERase·输入

应组装由50 mM Tris-HCl（pH 8.0），300 mM NaCl，10 mM MgCl 2 和1 mM EGTA 组成的稳定储备液，无菌过滤并在室温下保存。剩余的对温度敏感的试剂将在使用前添加。

对于250毫升的蠕虫溶解缓冲液稳定储备液

17.4毫升4 M氯化钠

12.5毫升1所述的1M Tris-HC 升（pH8.0）中

2.5毫升1 M氯化镁2

25 ml的10 mM EGTA

去离子H 2 O至250 ml

室温保存

在使用前，将下列对温度敏感的试剂添加到1 0 ml稳定液中

1毫克环己酰亚胺

100微升T riton X-100

100 µl 10％脱氧胆酸钠

一款cOmplete Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂

立即使用，请勿隔夜存放

按照协议中的指示，在每350 µl蠕虫增效剂等分试样中添加5 µl SUPERase·In RNase-Inhibitor

10 x 高盐分离缓冲液
250 mM Tris-HCl（pH 8.0）

1.4 M氯化钠

100毫米MgCl 2

对于100毫升的10倍高盐分离缓冲液

33.6毫升的4 M氯化钠

25毫升1 M Tris-HCl（pH 8.0）

10毫升1 M氯化镁2

31.4毫升去离子水2 O

高盐分离缓冲液中的蔗糖溶液
对于高盐分离缓冲液中的500 ml 50％蔗糖溶液：

将500毫升10 x 高盐溶解抛光剂添加到500毫升刻度瓶中
加入250克蔗糖
在35-40°C下添加足够的去离子H 2 O，使其总体积达到约450 ml
盖紧瓶盖，搅拌直至蔗糖完全溶解。为了确保所有蔗糖完全溶解在溶液中，可能需要在37°C下进一步加热。
用去离子H 2 O 将体积调节至500 ml
通过0.22过滤溶液 μ米瓶顶过滤器我n要的高压灭菌的一瓶500毫升
在4°C下储存50 ml等分试样

对于高盐溶液中的500 ml 5％蔗糖溶液：

将500毫升10 x 高盐溶解抛光剂添加到500毫升刻度瓶中
加入25克蔗糖
在35-40°C下添加足够的去离子H 2 O，使其总体积达到约450 ml
盖紧瓶盖并搅拌直至糖份完全溶解
用去离子H 2 O 将体积调节至500 ml
通过0.22过滤溶液μ 米瓶顶过滤器我n要的高压灭菌的一瓶500毫升
在4 °C下储存50 ml等分试样

致谢

该出版物中报道的研究得到了美国国立卫生研究院国立普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA ）的支持，批准号为P20GM103423和P20GM104318。CZ185550菌株由CGC提供，由国立卫生研究院研究基础设施计划（P40OD010440）资助。秀丽隐杆线虫的该协议基于Laberge 等人的协议。（2015）用于培养细胞。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

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