材料和试剂
微量的提示（0.5-20微升，100-200微升，1 ，000微升）（格雷纳生物Ò ne）为
60毫米细胞培养皿中（Corning，隼® ，目录号：353004）
100毫米细胞培养皿中（Corning，隼® ，目录号：353003）
注射器过滤器0.2 微米（VWR，目录号：28145-501）
一次性解剖刀刀片第10号（PFM 医疗AG，羽毛® ，目录号：201000010）
血清移液管（5 ml，10 ml）（Corning，Stripette TM ）
15ml锥形管（格雷纳生物ø NE，目录号：188271）
T75烧瓶（Corning，目录号：CLS430641 ）
可逆细胞过滤器（Stem Cell Technologies，目录号：27215）
20 µm细胞过滤器（Sysmex Partec GmbH ，德国格尔利茨）
胶原酶A（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10103578001）
的Dulbecco ' 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（泛Biotech公司，目录号：P04-361000）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：25200056）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：25300054）
的Dulbecco ' 改良Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（赛默飞世尔科技，Gibco公司TM ，目录号：11960044）
胎牛血清（FBS）（Thermo Scientific，Gibco TM ，目录号：10082147）
青霉素-链霉素/两性霉素B混合物（Pan Biotech，目录号：P06-07300）
角质形成细胞无血清培养基（KSFM）（生命技术，目录号：10724-011）
角质形成细胞补充剂，包含牛垂体提取物，人重组EGF（生命技术，目录号：37000-015）
iMatrix 511（Nippi ，目录号：892012）
70％乙醇
细胞角蛋白（CK）15（Invitrogen，目录号：MA5-11344）
p63α（Abcam，货号：ab32353）
CCAAT /增强子结合蛋白δ（Abcam，目录号：ab139730）
CK19（Abcam，货号：ab52625）
CK3（Invitrogen，货号：MA1-5763）
CK12（Abcam，货号：ab185627）
连接蛋白43（Abcam，目录号：ab235282）
胶原酶溶液（请参阅食谱）
KSFM完全培养基（请参见食谱）
层粘连蛋白涂层板（请参见食谱）

设备
移液器辅助
微量移液器（P20，P200，P1000）
显微解剖剪刀
钳子
剪刀
血细胞计数器
生物安全柜
CO 2 培养箱
离心机
具有相机时代的相衬倒置显微镜（物镜4x，10x，20x）
冰柜-20 摄氏
冰箱2-8 °C

软件
CapturePro 2. 10.0.1（JENOPTIC Optical systems GmbH）

程序
角膜缘剥离
器官培养与适当的研究同意和伦理批准角巩膜组织可以通过角膜银行由于低角膜内皮细胞DENSIT被提供，如果角膜不适合移植的Y（< 2 ，200 细胞/毫米2 ），或存在的供体的神经系统疾病或恶性肿瘤。如果获得了适当的研究同意和批准，则角膜内皮移植准备后的供体角膜移植物也是有价值的来源。
将角巩膜组织放入60 mm培养皿中，并用DPBS 两次洗涤。用手术刀和镊子将组织切成12个三钟小时的扇区。
在1形成切口之前及以后的解剖角膜缘毫米拿到缘段（小号EE视频1 ）。

视频1.角膜上皮祖细胞分离
角膜缘上皮祖细胞的分离
将角膜缘部分放入60 mm的培养皿中，其中含有4 ml胶原酶A（2 mg / ml），并用手术刀刀片将角膜缘部分切成小块。在5％CO 2的37°C下孵育过夜，以消化基质胶原（获取角膜缘上皮细胞簇）。
过夜孵育后，用1 ml移液器研磨几次，并在显微镜下观察细胞簇和单细胞的存在（图2）。细胞簇都应该包括角膜缘上皮干细胞，间质的，和黑素细胞小生境的细胞。
注意：在过夜温育和研磨，再孵育2个后缘段的不完全消化的情况下ħ OU RS 在相同溶液中在37℃，5％CO 2 为完全消化。另一方面，组织的过度消化可能会对细胞活力和细胞质量产生不利影响。

图2. 角膜缘上皮祖细胞的分离。A.将角膜巩膜边缘（左）切成扇形，在角膜缘区域（右）前后将每个扇形修剪1mm。乙。在胶原酶溶液中过夜孵育角膜段后，形成了不同大小的角膜簇和单细胞（左）（放大40倍）。在KSFM培养基中以50％汇合度（右，上）和100％汇合度（右，下）（x40放大倍数）培养的源自肢体簇的角膜缘上皮细胞。

使用孔径为37 µm的可逆细胞滤网，从单个细胞中分离出细胞簇。的单个细胞通过细胞过滤器和所述簇保留。用PBS清洗滤网两次，以去除单个细胞。颠倒滤网，并将其放在15 ml F alcon管或60 mm皿中。加入0.25％胰蛋白酶-EDTA（5 ml）将簇冲洗至培养皿或试管中，并在37°C下孵育10-15分钟，以将簇解离成单个细胞。
注意：可以使用20 µm细胞过滤器代替可逆细胞过滤器。在视频中，我们使用了20 µm过滤器。
孵育后，用1ml移液器研磨细胞悬液。使用5ml含10％FBS的DMEM抑制胰蛋白酶消化。将细胞悬浮液转移到15 ml F alcon管中，并以200 xg离心5分钟。
离心后，将细胞沉淀重悬于1 ml KSFM完全培养基中以进行无饲养层培养。这些细胞也可以用于饲养层上的克隆测定。

角膜缘上皮祖细胞的扩增
将角膜簇衍生的单细胞（1 x 10 3 细胞/ cm 2 ）播种到LN511E8包被的平板（烧瓶或平板，具体取决于获得的细胞数量）中制备层粘连蛋白的平板，见食谱3。
注意：请勿让层粘连蛋白涂层的烧瓶干燥。
在KSFM完全培养基中与5％CO 2 在37°C下培养7至10天，以扩展角膜缘上皮细胞。Chan ge媒体每2天发布一次。
注意：如果在培养7天后发生任何基质成纤维细胞污染，请使用0.05％胰蛋白酶-EDTA去除基质成纤维细胞，该基质成纤维细胞倾向于不牢固地粘附在LN基质上。取出介质并用DPBS 洗涤。与4 ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA孵育2分钟。用KSFM洗涤，用含10％FBS的DMEM洗涤烧瓶。加入12 ml KSFM完全培养基，继续培养
为了验证扩增后的群体中是否存在干/祖细胞群，使用了各种干/祖细胞标记（细胞角蛋白（CK）15，p63α，CCAAT /增强子结合蛋白δ，CK19）和分化标记（CK3，CK12，Connexin-43）可以通过逆转录聚合酶链反应和免疫细胞化学法使用。

角膜缘上皮祖细胞的继代培养
在70％至80％汇合时，除去培养基并用DPBS洗涤一次。
加入4 ml的胰蛋白酶-EDTA（0.05％），在37 °C和5％CO 2中孵育5分钟。
孵育后，添加4 ml含10％FBS的DMEM以抑制胰蛋白酶作用并充分混合。
将细胞悬浮液转移到15 ml管中，并以200 xg离心5分钟。将沉淀细胞溶解在KSFM完全培养基中，并将细胞用于选择应用或传代培养。
注意：过度融合（超过80％）和长时间的胰蛋白酶消化（超过5分钟）会对继代培养过程中的细胞活力和细胞质量产生不利影响。始终以70％至80％汇合的方式通过细胞。避免在胰蛋白酶中长时间孵育。

数据一nalysis

该协议中提供的条件已经过优化，可以隔离和扩展LEPC。角膜缘上皮祖细胞的分离和扩增的详细分析可以在Polisetti 等人找到。，2017 。

菜谱
胶原酶溶液
试剂胶原酶A
成分和制备5 mg胶原酶A
220毫升DMEM高葡萄糖
25毫升胎牛血清
5 ml青霉素-链霉素/两性霉素B混合物
倒转混匀
使用0.2 µm过滤器的无菌过滤器的灭菌方法
注意准备10毫升等分试样
储存-20°C
KSFM媒体
中等角质形成细胞无血清培养基（KSFM）已完成
成分和制备500 ml K SFM基础培养基
25毫克BPE（加全部量）
2.5 µg EGF（加总量）
5 ml的青霉素内链霉素/两性霉素B混合物
倒转混匀
灭菌方法无
注释如果需要，准备等分试样
避光
在2-8°C下储存1个月
层粘连蛋白涂层板
在8 ml的1x DPBS中稀释75 µl iMatrix-511
将T75烧瓶用8 ml稀释的iMatrix-511（0.5 µg / cm 2 ）溶液在37°C，5％的CO 2 培养箱中或在4°C 过夜涂覆1 h。
孵育后，取出i Mat rix-511溶液，并加入10 ml KSFM完全培养基

致谢
这项工作得到了DFG Grant INST 410 / 45-1 FUGG的支持。该协议改编自先前的工作（Polisetti 等，2017）。

利益争夺
作者宣称他们没有竞争利益。

参考文献
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