材料和试剂

iPSC细胞培养也如D'Antonio-Chronowska 等人所述。（2019）
6孔板（Corning，目录号：3506）
注射器过滤0. 2μ 米（VWR ，目录号：28145-501）
软JECT ® 3 -部分一次性注射器，空气TITE-3毫升（VWR，目录号：89215-234）
5 ml硼硅酸盐血清移液管（Fisher Scientific，目录号：1367827E）
5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01）
10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
P20 带有过滤器的无菌吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-00）或其他等效的带有与吸管兼容的过滤器的无菌吸头
P1000 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-02）或其他等效的P1000无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
iPSC细胞
UltraPure TM 不含DNase / RNase的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977023）
康宁® 基质胶® 低生长因子（GFR）基底膜基质（康宁公司，目录号：354230）
mTeSR TM 1（干细胞技术，目录号：85850）
DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330057）
Dispase II，粉末（Thermo Fisher Scientific，目录号：17105041）
变性200标准乙醇（即，VWR，目录号：71002-398）–制备70％乙醇
70％乙醇（请参阅食谱：表20）
基质胶溶液（Matrigel）（请参阅配方：表1）
10 mM ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐溶液（ROCK抑制剂）（请参阅配方：表3）
10倍分配（请参阅食谱：表4）
mTeSR TM 1完全培养基（mTeSR）（请参阅配方：表5）

B. 使用Versene进行PSC传递 – Versene我通过
6孔板（Corning，目录号：3506）
自动细胞计数片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450019）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品
5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01）
P20移液管尖端ST erile带过滤器（Fisher Scientific公司，目录号：21-403-00），或与过滤器与移液管相容的其它等效P200无菌针头
P1000 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-02）或其他等效的P1000无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
iPSC细胞
UltraPure TM 不含DNase / RNase的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977023）
康宁® 基质胶® 低生长因子（GFR）基底膜基质（康宁公司，目录号：354230）
mTeSR TM 1（干细胞技术，目录号：85850）
DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330057）
的Versene ® （EDTA）0.02％（龙沙，目录号：17-711E）
变性200标准乙醇（即，VWR，目录号：71002-398）–制备70％乙醇
70％乙醇（请参阅食谱：表20）
基质胶溶液（Matrigel）（请参阅配方：表1）
10 mM ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐溶液（ROCK抑制剂）（请参阅配方：表3）
mTeSR TM 1完全培养基（mTeSR）（请参阅配方：表5）

C. 使用Versene进行iPSC传递-Versene II传递
100 mm组织培养皿（Corning，目录号：430167）
自动化细胞计数载玻片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450019）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或相当的产品
5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01）
P20 带有过滤器的无菌吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-00）或其他等效的带有与吸管兼容的过滤器的无菌吸头
P1000 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-02）或其他等效的P1000无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
iPSC细胞
UltraPure TM 不含DNase / RNase的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977023）
康宁® 基质胶® 低生长因子（GFR）基底膜基质（康宁公司，目录号：354230）
mTeSR TM 1（干细胞技术，目录号：85850）
DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330057）
的Versene ® （EDTA）0.02％（龙沙，目录号：17-711E）
变性200标准乙醇（即，VWR，目录号：71002-398）–制备70％乙醇
70％乙醇（请参阅食谱：表20）
基质胶溶液（Matrigel）（请参阅配方：表1）
10 mM ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐溶液（ROCK抑制剂）（请参阅配方：表3）
mTeSR TM 1完全培养基（mTeSR）（请参阅配方：表5）

D. Monolay ER电镀时也详细描述于D'安东尼奥Chronowska 等。（2019年a）
100 mm组织培养皿（Corning，目录号：430167）
自动细胞计数片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450019）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品
5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01）
10 ml血清学吸管（生物先锋，目录号：GEX0100-S01）
P20 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-00）或其他等效的P20无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
P200 带有过滤器的无菌吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-01）或其他与过滤器兼容的带过滤器的P200无菌吸头
P1000 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-02）或其他等效的P1000无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
50 ml锥形管（Bio Pioneer目录号：CNT-50R）
康宁® 基质胶® 低生长因子（GFR）基底膜基质（基质胶）（康宁公司，目录号：354230）
mTeSR TM 1（干细胞技术，目录号：85850）
DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330-057）
Accutase （Innovative Cell Technologies，Inc.，目录号：AT 104）
台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐（塞勒克下摆，目录号：S1049）
iPSC细胞培养
变性200标准乙醇（即，VWR，目录号：71002-398）–制备70％乙醇
70％乙醇（请参阅食谱：表20）
基质胶溶液（请参见配方：表1）
10 mM ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐溶液（请参阅配方：表3）
mTeSR TM 1完全培养基（请参见配方：表5）

E. 使用ccEstimate 估计iPSC-CVPCs分化起始的最佳时间
iPSC 单层
记号笔耐70％乙醇

F. iPSC的CVPCs分化
T150组织培养瓶，通风的（Sigma，目录号：Z707929）
注意：在编写此手稿时，Z707929已不再可用。相同的烧瓶在目录号Z707511-36EA（Sigma，目录号：Z707511-36EA）下可用。
自动化细胞计数载玻片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450019）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或相当的产品
10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
25 ml血清移液管（Bio Pioneer目录号：GEX250-S01）
50 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX500-S01）
带过滤器的无菌P20移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-00）或其他等效的带过滤器且与移液器兼容的P20无菌吸头
P200 带有过滤器的无菌吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-01）或其他与过滤器兼容的带过滤器的P200无菌吸头
P1000 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-02）或其他等效的P1000无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
细胞刮板机（VWR International，目录号：179707）
15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
50 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-50R）
125毫升的Nalgene ® PET无菌瓶中（Fisher Scientific公司，目录号：342040-0125）
纳津® 冻存管（赛默飞世尔科技，产品目录编号：5000-1020）
iPSC单层
康宁® 基质胶® 低生长因子（GFR）基底膜基质（基质胶）（康宁® ，目录号：354230）
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875119）
RPMI 1640培养基，无葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：11879020）
1个不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS; PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
B-27 TM 补充剂，不含胰岛素（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1895601）
B-27 TM 补充剂（50 x ），无血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）
FBS（欧米茄科学，目录号：FB-02）或等价物，邻- [R 淘汰赛TM 血清替代品（KOSR）（赛默飞世尔科技，产品目录号：10828028）
MEM非必需氨基酸溶液100x （Thermo Fisher Scientific，目录号：11140050）
青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
CHIR-99021（CT99021）（CHIR99021）HCl （Selleckchem ，目录号：S2924）
IWP-2（Tocris ，货号：3533）
L-乳酸钠（西格玛，目录号：71718-10G）
HEPES钠盐溶液1M，BioReagent ，适用于细胞培养（Sigma，目录号：H3662-100ML）
Accutase （Innovative Cell Technologies，Inc.，目录号：AT 104）
台盼蓝溶液0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D2650-100ML ）
液氮
变性200标准乙醇（即，VWR，目录号：71002-398）–制备70％乙醇
70％乙醇（请参阅食谱：表20）
RPMI减号（-）介质（请参见配方：表6）
RPMI Plus（+）介质（请参见配方：表7）
RPMI乳酸培养基（请参见配方：表8）
iPSC-CVPCs收获培养基（请参阅配方：表9）
iPSC-CVPCs 2 x 冷冻培养基（请参阅配方：表10）
10 mM CHIR-992021 溶液（请参见配方：表11）
5 mM IWP-2 解决方案（请参阅配方：表12）
1M L-乳酸钠溶液（请参阅配方：表13）

G. 流式细胞仪
96 孔圆底测定板（Genesee Scientific，目录号：25-224）
带有细胞过滤器卡扣帽的康宁TM Falcon TM 试管（Fisher Scientific，目录号：352235）
康宁TM Costar TM 无菌一次性试剂储罐（Fisher Scientific，目录号：4870）
5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01）
10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
带过滤器的无菌P20移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-00）或其他等效的带过滤器且与移液器兼容的P20无菌吸头
P200 带有过滤器的无菌吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-01）或其他与过滤器兼容的带过滤器的P200无菌吸头
P1000 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-02）或其他等效的P1000无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
不带过滤器的P20无菌吸头（VWR，目录号：83009-694）或不带过滤器的其他等效P20无菌吸头
（可选）不带过滤器的P200无菌移液器吸头（VWR，目录号：89495-378）或不带过滤器的其他等效的P20 无菌吸头与移液器兼容
1个不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
甲醇，ACS试剂，≥99.8％（Sigma，目录号：179337-4L-PB）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A2153-100G）
（可选）NaN 3 （Sigma，目录号：S2002-5G）
37％甲醛（Sigma，目录号：F-1635-500ML）
Triton TM X-100（Sigma，目录号：X-100-500ML）
源自新西兰的山羊血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：16210064）
小鼠单克隆抗肌钙蛋白T，心脏同种型（cTNT ; TNNT2）Ab-1抗体，克隆13-11（Thermo Fisher Scientific，目录号：MS-295-P0）
小鼠IgG1抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：MG100）
山羊抗小鼠Alexa Fluor TM 488共轭抗体（Thermo Scientific ，目录号：A-11001）
FACS缓冲液（请参阅配方：表14）
FACS-FIX缓冲区（请参阅配方：表16）
注意：有关抗体的工作浓度，请参见配方：表21）。
H. 免疫荧光
Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片（Millipore，目录号：PEZGS0816 ）
共verslip载玻片（FISHERBRAND ，目录号：12-545-F [ 盖玻片厚度＃1 ] ）。如果需要，可以使用不同的盖玻片厚度
5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01）
10 ml血清移液管（Bio Pio neer，目录号：GEX0100-S01）
P20 无菌吸头，带过滤器（Fisher Scientific，目录号：21-403-00）或其他等效的P20无菌吸头，带过滤器与吸管兼容
P200 带有过滤器的无菌吸头（Fisher Scientific，目录号：21-403-01）或其他与过滤器兼容的带过滤器的P200无菌吸头
1 x 不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A2153-100G）
多聚甲醛（PFA）（Sigma，目录号：158127-100G）
吐温® 20 （Sigma，目录号：P9416-100ML）
Triton TM X-100（Sigma，目录号：X100-500ML）
来自猪皮肤的明胶（Sigma，目录号：G1890-100G）
小鼠单克隆抗α-Actinin（Sarcomeric）抗体，克隆EA-53（Sigma，目录号：A7811 ）
兔多抗抗Connexin 43（CX43 / GJA1）抗体（Invitrogen，目录号：71-0700 ）
兔多克隆抗肌球蛋白轻链2（MYL2; MLC2v）抗体（Proteintech ，目录号：10906-1-AP ）
小鼠单克隆抗肌球蛋白心房轻链2（MYL7; MLC2a）抗体克隆56F5（Synaptic Systems，目录号：311011 ）
驴抗兔Alexa 氟TM 488缀合抗体（Invitrogen，目录号：A21206）
山羊抗-小鼠Alexa 氟TM 568缀合的抗体（Invitrogen，目录号：A-11004）
的ProLong ® Gold抗淬灭试剂用DAPI （细胞信号传导技术，目录号：8961）
0.1％明胶溶液（请参见配方：表2）
PBS中的4％PFA溶液
IF Perm Buffer II （请参阅配方：表17）
IF Blocking Buffer II （请参见配方：表18）
中频染色缓冲液（见配方：表19）
注意：有关抗体的工作浓度，请参见配方：表21

设备

iPSC细胞培养
生物安全柜（Labconco ，型号：Logic + ）
带有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中保持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA ）
水浴箱（Thermo Scientific，型号：Precision ）
带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT + ）
相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Olympus，型号：CKX41SF ）
（可选）带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core ）
显微镜物标（尼康，型号：MBW10020）
移液器辅助工具（Labnet ，目录号：FastPette TM V2 P2000）或其他等效的可用移液器辅助工具
P20微量移液器（Rainin ，目录号：17014392）或其他可用的P20微量移液器
无霜冷冻柜-20°C
冰箱2-8°C

使用Versene进行iPSC传递（Versene I和Versene II传递）
生物安全柜（Labconco ，型号：Logic + ）
带有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中保持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA ）
带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT + ）
相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Olympus，型号：CKX41SF ）
（可选）带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core ）
移液器辅助工具（Labnet ，目录号：FastPette TM V2 P2000）或其他等效的可用移液器辅助工具
P20微量移液器（Rainin ，目录号：17014392）或其他可用的P20微量移液器
P200 微量移液器（Rainin ，目录号：17014391）或其他可用的P200微量移液器
P1000 微量移液器（Rainin ，目录号：17014382）或其他可用的P1000微量移液器
自动细胞计数器（Bio-Rad，型号：TC20 ）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品
无霜冷冻柜-20°C
冰箱2-8°C

单层电镀
生物安全柜（Labconco ，型号：Logic + ）
带有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中保持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA ）
带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT + ）
相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Olympus，型号：CKX41SF ）
（可选）带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core ）
移液器辅助工具（Labnet ，目录号：FastPette TM V2 P2000或其他等效的可用移液器辅助工具
P20微量移液器（Rainin ，目录号：17014392）或其他可用的P20微量移液器
P200 微量移液器（Rainin ，目录号：17014391）或其他可用的P200微量移液器
P1000 微量移液器（Rainin ，目录号：17014382）或其他可用的P1000微量移液器
自动细胞计数器（Bio-Rad，型号：TC20 ）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品
无霜冷冻柜-20°C
冰箱2-8°C

iPSC-CVPCs的分化和冷冻保存
生物安全柜（Labconco ，型号：Logic + ）
带有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中保持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA ）
带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT + ）
相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Olympus，型号：CKX41SF ）
（可选）带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core ）
移液器辅助工具（Labnet ，目录号：FastPette TM V2 P2000）或其他等效的可用移液器辅助工具
P20微量移液器（Rainin ，目录号：17014392）或其他可用的P20微量移液器
P200微量移液器（Rainin ，目录号：17014391）或其他可用的P200微量移液器
P1000微量移液器（Rainin ，目录号：17014382）或其他可用的P1000微量移液器
自动细胞计数器（Bio-Rad，型号：TC20 ）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品。
雾先生冷冻集装箱（康宁，型号：CoolCell ® FTS30）
冰箱2-8°C
无霜冷冻柜-20°C
冷冻室-80°C
液氮蒸气罐

使用ccEstimate 估计启动iPSC-CVPCs分化的最佳时间
1. 带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core ）或等效或自动成像系统
2. 任何装有R 3.5.1和R软件包EBImage （Pau 等，2010）并具有4GB RAM的计算机

流式细胞仪
P ipette 助剂（Labnet公司，目录号：FastPette TM V2 P2000）或其它等效可用移液管辅助
P20微量移液器（Rainin ，目录号：17014392）或其他可用的P20移液器
P200微量移液器（Rainin ，目录号：17014391）或其他可用的P200微量移液器
P1000微量移液器（Rainin ，目录号：17014382）或其他可用的P1000微量移液器
P200多通道微量移液器（Rainin ，目录号：17013805）或其他可用的多通道P200移液器
带有适合离心96孔板的转子的组织培养离心机（Thermo Scientific，型号：Legend RT + ）
冰箱2-8°C
无霜冷冻柜-20°C
流式细胞仪（BD Biosciences，型号：FACSCanto II）或相当的产品。

免疫荧光
P ipette 助剂（Labnet公司，目录号：FastPette TM V2 P2000）或其它等效可用移液管辅助
P20微量移液器（Rainin ，目录号：17014392）或其他可用的P20移液器
P200微量移液器（Rainin ，目录号：17014391）或其他可用的P200微量移液器
P1000微量移液器（Rainin ，目录号：17014382）或其他可用的P1000微量移液器
冰箱2-8°C
无霜冷冻柜-20°C
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Olympus，FluoView1000 ）

软件

FlowJo （版本10）（FlowJo ，LLC，https : //www.flowjo.com/ ）
FlowView ASW V03.01.03.03或V4.2a（Olympus Life Science，https: //www.olympus-lifescience.com/en/support/downloads/ ）
ccEstimate 可根据要求提供
R 3.5.1
R包EBImage （Pau et al。，2010）

程序

的iPSC细胞立方米lture 也ð 在旁切详细D'安东尼奥Chronowska 等。（2019a）
解冻iPSC细胞
一个。准备含有10μMROCK抑制剂的12 ml mTeSR。
b。将9 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR转移到标有管线名称的无菌锥形管中。
C。从液氮罐中取出冷冻保存的小瓶。将小瓶放在干冰上。
d。将其放在37°C水浴中轻轻摇动，直到剩下豌豆大小的冰晶（约2分钟）。
e。从小瓶中擦去多余的水，然后再将70％的乙醇喷入引擎盖中。
F。从小瓶中取出融化的细胞，并在锥形管中轻轻加入9 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR中。用1-2 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR洗涤小瓶。将所有细胞收集在同一锥形管中。
G。在室温下以53 xg （在具有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以500 RPM）离心细胞5分钟。
H。吸出上清液，然后将细胞沉淀轻轻重悬于2 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR中（将1个冷冻小管融化到6孔板的1个孔中）。
注意：iPSC细胞在块中冷冻保存，无法计数。因此，我们建议将6孔板的1个孔中的细胞冷冻保存到1个冷冻小管中，然后将1个冷冻管中的细胞解冻到6孔板的1个孔中。
一世。用行名称，克隆名称和通过编号标记Matrigel板。从Matrigel涂层板上吸出DMEM / F-12。解冻后，将段落编号加+1。
注意：如果在iPSC的低温保存过程中增加了传代次数，则不要在传代次数上加上+1。
j。将平板细胞重悬于2 ml溶液中，涂在Matrigel包被的6孔板的一个孔中（最终体积2 ml /孔）。
k。接种后24小时，观察细胞。用DMEM / F-12（2 ml /孔）轻轻洗涤细胞以除去细胞碎片，并使用不含ROCK抑制剂（2 ml /孔）的新鲜mTeSR培养基进料。
l。每天，观察iPSC，去除分化的细胞，并用新鲜的mTeSR （2 ml /孔）对培养基进行填充。
注意：保持iPSC文化的自由分化是批评人士的。有关如何标记和去除分化的iPSC细胞的详细信息，请参考以下步骤：2.使用Dispase进行iPSC传代（步骤A2 c- A2 d）和图1 。
米细胞应达到融合度的80-90％，并准备在约5天内传代。

根据需要，可以使用多种方法来传递iPSC。对于常规iPSC培养和扩增，应使用Dispase 传递细胞，该酶可裂解用于iPSC培养（Matrigel）的细胞外基质蛋白。Dispase 会将iPSC分解成细胞团，这是iPSC扩展和维护的一种温和方法。我们建议将Dispase与iPSC进行传代，比例为1：2（将一个孔分成2个孔）或1：3（将一个孔分成3个孔），这样可以轻松安排iPSC细胞的维护。用Dispase 传代的细胞应在约4-5天内达到约80％的融合度。其它比例也可使用（即，1：1或1：4），但我们建议测试它为各条线。
当必须以更高的比例或使用定义的细胞数扩增iPSC细胞时，应使用Versene或Accutase将iPSC分解为单个细胞。请注意，单细胞传代对iPSC压力很大，并导致细胞凋亡。为了防止解离诱导的iPSC凋亡，必须使用诸如ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐（或其他）之类的试剂。我们不建议将iPSC分解成单个细胞进行常规扩增或冷冻保存。
Versene 是单细胞解离的一种非酶促，温和的方法，它通过螯合整联蛋白所需的金属离子（主要是镁和钙）来维持细胞-细胞和细胞-细胞外基质的接触。在电镀大规模单层膜之前，我们通常使用Versene扩展了150多种不同的iPSC品系，但是我们不建议使用Versene在两个以上的连续传代中解离细胞。Accutase是一种酶试剂，可实现非常有效的单细胞解离。尽管Accutase是一种温和的试剂，通常用于iPSC，但我们建议仅将Accutase用于单层电镀。

笔记：
对于成功的iPSC-CVPCs分化至关重要的是，使用健康多能的iPSC细胞并使用培养不受分化的iPSC。
最佳细胞数将根据分化程度而变化。在该协议中描述的规模分化要求通过执行两次Versene传代（通道：Versene I和Versene II）使细胞逐渐扩增。

使用Dispase进行iPSC传递
通过将9 ml DMEM / F-12添加到1 ml的10 x Dispase （20 mg / ml）中来制备1x（2 mg / ml）Dispase溶液。
让1x Dispase溶液恢复到室温。
注意：1x Dispase溶液可在4°C下最多保存2周。
标记任何区域分化在井（一个或多个）被分割，使用显微镜对象标记ř EFER图1 为多能性健康菌落（A）和分化的集落需要被移除（B）的代表性图像。
吸出用过的媒体。通过在标记的圆圈内轻轻敲打巴斯德吸管，吸出标记的分化区域（如果有）（图1 C）。娲SH用2ml的DMEM / F-12，每孔。

图1.多能和分化的iPSC集落。A. 健康多能的iPSC菌落融合成较大的菌落：融合前（左和中）和融合后（右）。健康多能的iPSC菌落具有光滑，平坦的菌落表面，非常紧密，细胞紧密生长，具有几乎不可见的细胞膜（细胞之间的边界）以及均匀，轮廓分明的菌落边缘。细胞的细胞核与细胞质比例高，核仁清晰可见。几乎所有的偏差，从日是形态可能会建议多能性的损失和可能表明不必要的分化。B.需要从培养物中除去的分化的iPSC细胞的例子。黑色箭头表示分化的细胞。各种iPSC品系的细胞在分化后可能会具有多种形态，这些只是几个代表性的例子。C.用显微镜对象标记（左）将分化的菌落标记为紫色，并用巴斯德吸管吸出（右）。

在每个孔中加入1 ml 1 x Dispase进行分割。在37°C下孵育5分钟。
5分钟后检查菌落的形态。
当菌落的边缘稍微卷曲时，细胞就可以传代了。如果菌落边缘是没有吨蜷缩，孵化细胞在37℃下再1-2分钟。请勿与Dispase一起温育超过8分钟。请参阅图2 ，一种用于菌落代表图像与卷起的边缘。
从所有孔中吸出Dispase。
注意：通过Dispase传代的iPSC菌落将保持与孔完全连接。只有菌落的边缘会稍微卷曲，表明细胞已准备好进行下一步。
用DMEM / F12 （2 ml /孔）轻轻冲洗3次。
向每个孔中加入1 ml mTeSR培养基进行传代。
使用玻璃血清移液管分离菌落。将移液器与平板表面成90°角。按照图2 B中概述的动作在6孔板的表面上刮擦（从孔的左上侧s 起，然后曲折紧紧地向下到右下角，然后顺时针或逆时针旋转板并再次刮擦）。刮擦，直到至少90％的菌落从孔中脱离。
用使细胞升至播种新的Matrigel涂层容器所需的最终体积的mTeSR体积洗涤板。考虑到每个孔中要接种传代细胞的每个孔2 ml，计算最终体积。例如，如果要将细胞传代1-3次，则最终体积将为6 ml，因此用于洗涤板的mTeSR体积为5 ml。
在新的Matrigel板上接种种子细胞，每孔接种1 ml细胞悬浮液，然后再向每孔添加1 ml细胞悬浮液（图2 C）。平板细胞在孔的整个表面上滴落，以确保均匀铺板。
在显微镜下观察接种的细胞，以确保接种均匀。
放入37°C的培养箱中。将平板摇成T形，以将菌落块均匀分布在孔中。
轻轻铺板后二十四小时，在添加新鲜的mTeSR培养基之前，先用DMEM / F-12洗涤细胞。
注意：对于健康有效的iPSC培养，至关重要的是均匀铺板细胞。平板细胞均匀地分布在孔的整个表面上，当镀多个孔时，平板细胞均匀地分布在所有孔中。

图2. 用Dispase暂停iPSC。A. 与Dispase孵育5分钟后，iPSCORE_2_1 iPSC 菌落的边缘卷曲。B. 在iPSC传递Dispase期间玻璃血清移液器的移动模式。沿一个方向刮擦孔后，将板顺时针或逆时针旋转90 °，然后再次刮擦剩余的iPSC菌落。应从孔中分离出约90％的细胞。Ç 。将iPSC细胞从2孔传到6孔时铺板细胞的示例。按照以下方式在每个孔中添加1 ml细胞悬液：将细胞铺板到三个孔中：1-2-3-3-2-1或将细胞铺到六个孔中时：1-2-3-4-5-6 -6-5-4-3-2-1。有关详细信息，请参阅有关使用Dispase进行iPSC 传递的部分。（在D'Antonio-Chronowska 等人，2019a中也有详细描述）

使用Versene传递iPSC（Versene I）
笔记：
解冻iPSC系后，用Dispase传代细胞至少一次，然后用Versene传代细胞。
最佳细胞数将取决于iPSC-CVPC分化的程度。在此方案中描述的规模分化需要Versene I传代的1-2孔细胞。

从培养箱中取出6孔板。当iPSC细胞达到约80％汇合度（细胞已准备好传代）时，iPSC细胞已准备好进行Versene I传代。标记所有分化的细胞，其需要是祛瘀ED（图URE 1 ）。
吸出用过的培养基。除去所有标记的分化细胞，并用DMEM / F-12（2 ml /孔）洗涤细胞。
吸DMEM / F-12和加入1ml室温的Versene ®（EDTA）0.02％至井的6孔板的。在37°C下孵育细胞5分钟。
孵育5分钟后，在显微镜下检查细胞以确保细胞已准备就绪– 应看到单个细胞边界。（如果细胞尚未准备好，则将细胞放回培养箱中，并让其再作用30 s - 1分钟。不要使Versene的培养时间总计超过8分钟。
从每个孔中轻轻抽吸Versene。不要用DMEM / F12清洗细胞。
注意：与Versene一起孵育的单个细胞将清晰可见。细胞将保持附着在孔的表面，但是应轻柔地处理板。
每孔加入1 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR，并通过使用P1000移液管上下移液，将细胞重悬为单细胞而不刮板表面。用移液器吸移10-12次，将培养皿旋转180°（上下颠倒），再用移液器吸5次。从15毫升锥形管中的所有孔中收集细胞。您应该看不到任何细胞团块。
用3 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR洗涤孔（孔）两次。将所有细胞收集在同一锥形管中。
在室温下以53 xg （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以500 RPM）离心细胞5分钟。吸出上清液并将细胞重悬于3-5 ml含ROCK抑制剂的mTeSR中。
如有必要，通过颠倒20次或更多次来混合合并的细胞悬液。使用0.4％台盼蓝溶液进行活细胞计数。
注意：iPSC细胞存活率不应低于80％。
准备所需数量的单元格。对于在6孔板的三个孔中进行Versene I传代，请在15 ml锥形管中准备7 ml含有1.05 x 10 6个细胞的细胞悬液。通过颠倒试管20次，将细胞悬液充分混合。
注意：最佳细胞数将根据分化程度而变化。以该协议中所述的规模分化的iPSC-CVPC需要在Versene I传代过程中将9.0 x 10 5个活细胞接种到6孔板的三个孔中（每6孔板的每个孔3.0 x 10 5个活细胞）。
每块6孔板的三个孔中分别添加2 ml细胞悬液。使用5或10 ml 移液器滴加细胞。
注意：在板的整个表面上均匀铺板细胞至关重要。为了帮助将细胞均匀分布在一个盘子上，并以十字形（T形）摇晃新镀的盘子。
将板放在培养箱中，不要堆叠板。将细胞孵育到第二天早上，在37 °C ，5％CO 2下。
第二天，更换不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR培养基（2 ml /孔）。Versene I传代后的iPSC需要培养约3-4天，直到培养物达到80％融合为止。每天更换新鲜的mTeSR培养基。保持无差异的iPSC文化。

使用Versene（Versene II）传递iPSC
注意：最佳细胞数将根据分化程度而变化。iPSC-CVPCs在此协议中描述的规模分化需要Versene II传代的3孔细胞。
从培养箱中取出6孔板。当iPSC细胞达到约80％汇合度（细胞已准备好传代）时，iPSC细胞已准备好进行Versene II传代。标记所有需要去除的分化细胞（图1 ）。
吸出用过的培养基。除去所有标记的分化细胞，并用DMEM / F-12（2 ml /孔）洗涤细胞。
吸DMEM / F-12和加入1ml室温的Versene ®（EDTA）0.02％至井的6孔板的。在37°C下孵育细胞5分钟。
孵育5分钟后，在显微镜下检查细胞以确保细胞已准备就绪– 应看到单个细胞边界。（如果细胞尚未准备好，则将细胞放回培养箱中，并让其再作用30 s - 1分钟。不要使Versene的培养时间总计超过8分钟。
从我们每个人身上轻轻抽出Versene 。不要用DMEM / F12清洗细胞
每孔加入1 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR，通过使用P1000移液器上下吸移，将细胞重悬为单细胞而不刮板表面。用移液器吸移10-12次，将培养皿旋转180°（上下颠倒），再用移液器吸5次。从15毫升锥形管中的所有孔中收集细胞。您应该看不到任何细胞团块。
用5 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR将所有孔洗涤两次。将所有细胞收集在同一锥形管中。
在室温下以53 xg （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以500 RPM）离心细胞5分钟。吸出上清液并将细胞重悬于5-7 ml含ROCK抑制剂的mTeSR中。
如有必要，通过颠倒20次或更多次来混合合并的细胞悬液。使用0.4％台盼蓝溶液进行活细胞计数。
注意：iPSC细胞存活率不应低于80％。
准备所需数量的单元格。对于在三个100 mm皿上的Versene II传代，在50 ml锥形管中准备33 ml含有6.6 x 10 6个细胞的细胞悬液。轻轻颠倒离心管20次，将细胞悬液充分混合。
注意：最佳细胞数将根据分化程度而变化。按照本协议中所述的规模分化的iPSC-CVPC需要在Versene II传代过程中将6.0 x 10 6个活细胞接种到三个100 mm的培养皿上（每100 mm皿6.0 x 10 6个活细胞）。
在三个100毫米培养皿中的每一个中分别添加10毫升细胞悬液。使用10毫升移液器滴加细胞。在对每个100 mm的培养皿进行电镀之前，通过颠倒试管5-10次来混合细胞。
注意：在板的整个表面上均匀铺板细胞至关重要。为了帮助将细胞均匀分布在一个盘子上，并以十字形（T形）摇晃新镀的盘子。
将培养皿放在培养箱中，不要堆叠培养皿。将细胞孵育到第二天早上，在37 °C ，5％CO 2下。
第二天更换不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR培养基（10 ml / 100 mm培养皿）。Versene II传代后的iPSC需要培养约3-4天，直到培养物达到80％融合为止。每天更换新鲜的mTeSR培养基。保持无差异的iPSC文化。

单层电镀
铺单层的前一天，使用抗70％乙醇的标记在三个T150烧瓶的每个烧瓶的底部标记10个斑点（视图）（图3A）。涂三个T150烧瓶š 有基质胶（20毫升每烧瓶）。将烧瓶放在培养箱中。
制备140 - 150毫升含有5介质的mTeSR的μM ROCK 抑制剂。
将25 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR培养基加到三个用Matrigel包被过夜的T150烧瓶中。将烧瓶放在培养箱中。
从培养箱中取出6孔板。当iPSC细胞达到约80％汇合度（细胞已准备好通过年龄）时，iPSC细胞已准备好用于单层。标记所有需要去除的分化细胞（图1 ）。
吸出用过的培养基。除去所有标记的分化细胞，并用DMEM / F-12（2 ml /孔）洗涤细胞。
吸出DMEM / F-12，并向每个100 mm皿中加入5 ml室温Accutase。在37°C下孵育细胞8分钟。
孵育8分钟后，每孔含5μMROCK抑制剂的mTeSR加入5 ml，并通过使用P1000移液器上下吸移，将细胞重悬为单细胞而不刮板表面。用移液器吸移10-12次，将培养皿旋转180°（上下颠倒），再用移液器吸5次。在50 ml锥形管中收集所有孔中的细胞。您应该看不到任何细胞团块。
注意：与Accutase孵育后，请勿抽吸iPSC细胞。iPSC细胞将从孔表面分离。
用5 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR将所有孔洗涤两次。将所有细胞收集在同一锥形管中。
在室温下以53 xg （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以500 RPM）离心细胞7分钟。吸出上清液，将细胞重悬于10 ml含ROCK抑制剂的mTeSR中。
如有必要，通过颠倒20次或更多次来混合合并的细胞悬液。使用0.4％台盼蓝溶液进行活细胞计数。
注意：iPSC细胞活力应不低于80％。
准备所需数量的单元格。最佳细胞数将根据分化程度而变化。iPSC-CVPC的分化方案每cm 2 需要3.66 x 10 4个活细胞（每一个150 cm 2 烧瓶需要5.5 x 10 6 个）。对于三个T150烧瓶，在50 ml锥形管中制备33 ml含有1.815 x 10 7个细胞的细胞悬液。通过颠倒试管20次，将细胞悬液充分混合。
使用10 ml移液器向每个T150烧瓶中逐滴添加10 ml细胞悬液至三个装有ROCK I 抑制剂的25 ml mTeSR的烧瓶中。
注意：将细胞均匀地铺在烧瓶的整个表面上至关重要。为了帮助一次将细胞均匀分布在一个烧瓶中，将细胞滴加到烧瓶的整个表面上。此步骤可能需要练习。
一旦添加了10ml细胞，将新镀的烧瓶摇成十字形（T形）。将烧瓶放在干净，水平的表面（桌子）上，然后再次摇晃成十字形（T形）。注意：以更强的运动开始，并持续减少晃动，以非常柔和的运动结束。此步骤可能需要练习。
将烧瓶放在培养箱中，不要堆叠。将细胞孵育到第二天早上37°C，5％CO 2 。
第二天更换不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR培养基（35 ml / T150烧瓶）。用于iPSC-CVPC的单层细胞分化需要培养细胞约4-5天，直到单层达到80％融合为止。每天更换新鲜mTeSR的培养基。

使用ccEstimate 估计iPSC-CVPCs分化起始的单层融合和最佳时间
跨不同iPSC品系的可变增长率导致它们在不同时间点在单层阶段达到最佳融合（即，更快的品系将更早获得最佳融合），从而影响分化结果。为了能够大量我们开发了不同的iPSC系的分化Ç ELL Ç onfluency ë stimates（ccEstimate ），自动管道，其分析单层生长的细胞的图像，决定了它们的汇合在不同时间点和预测当细胞达到80汇合百分比。我们还使用ccEstimate 分化开始后，即，除CHIR99021后，衡量一个不带偏见，即运营商的独立，这样实际的细胞汇合。
ccEstimates 的执行方法是，首先将每个T150烧瓶分成10个部分（图3），然后将细胞铺板成单层后每24小时获取每个部分的图像。用CHIR99021处理后立即获得最终图像，这在汇合率为80％（第0天）时发生。根据每个烧瓶中每个切片的融合曲线估算细胞达到80％融合所需的时间。为了数字化测量iPSC融合度，ccEstimate 使用R中的EBImage 软件包执行图像分析（Pau 等人，2010）。使用readImage 函数读取图像。由于图像的中心和边框之间的照明可能会有所不同，因此仅保留了图像的中心部分。为了从背景中分离细胞并计算融合度（即，烧瓶所覆盖的细胞表面的分数），请执行以下操作。铺板后至少前三天以单层收集汇合度测量数据，以使用R中的glm 函数估计何时必须用CHIR99021处理细胞来训练广义线性模型（GLM）。对每个烧瓶截面分别进行估计，并且当至少75％的截面具有80％的融合度时，将CHIR添加到与给定管线关联的所有三个烧瓶中（图3）。
使用ccEstimate ，可以使每个iPSC系以相同的融合水平开始分化，从而降低或抵消不同增长率的影响。根据我们的数据，平均每条线在镀单层后需要4.23±1.12天才能达到80％汇合度。达到80％融合所需的天数与％CM群体之间的相关性为-0.05，这表明iPSC的生长速率不会影响分化结果（D'Antonio-Chronowska 等人，2019b）。

标记容器底部的斑点（视图）。如果使用T150烧瓶，请标记10个斑点，如图3A所示。
镀单层后24 小时开始拍摄细胞图像。为文件提供以下术语：
UDID_NNN_SUBJECT_CLONE_PASSAGE_MONO_DAY_FLASK_VIEW_DATE_
示例：UDID_001_iPSCORE-2-3_C5_P22_MONO_D1_FL1_VIEW1_20150723_
哪里：
UDID – 唯一区分标识符
NNN – UDID号
主题–派生iPSC的主题ID（iPSC线路名称）
CLONE – iPSC克隆编号
密码– iPSC密码
MONO –表示单层阶段
DAY –单层阶段的天数
FLASK –表示在多个烧瓶中进行区分时的烧瓶数量
查看–烧瓶中的位置（有关详细信息，请参见图3A）
DATE –成像日期，格式为YYYYMMDD
注意：确保图像上没有标记。确保文件名是唯一的，并根据上述示例。这将允许对图像进行自动分析，并预测单层达到80％汇合的时间。
每24 小时在同一地点拍摄影像
可选：使用自动成像系统拍摄图像

根据以下步骤分析图像（JPG，PNG 或TIFF格式）：
1. 通过将每个像素的强度确定为红色，绿色和蓝色通道强度的平均值，将图像转换为单色图像。
2. 使用高通滤镜对边缘进行锐化。用于此滤镜的矩阵为15 x 15，对角线的值为-1，中间为+28。
3. 通过将像素强度乘以2来增强对比度。
4. 计算像素强度的平均值和标准偏差。通过将强度大于均值两个标准差的所有像素设置为白色（强度= 1），将所有其他像素设置为黑色（强度= 0），将图像从单色转换为二进制。
5. 使用直径为5个像素的圆盘形结构元素对生成的二进制图像进行放大。
6. 随机选择1,000个50 x 50像素的ub图像。对于每个子图像，计算白色像素的数量。如果每个子图像的至少50％的像素是白色，则将其视为“单元”；如果至少50％的像素是黑色，则将其视为“背景”。汇合度计算为“细胞”子图像的数量除以1,000。
ccEstimate 在GitHub（https://github.com/s041629/ccEstimate）上可用，并且对R的了解最少。在安装软件包及其依赖项之后，用户只要运行ccEstimate （input_file.jpg）函数即可，其中input_file.jpg 是从单层iPSC文化获得的图像。此函数返回一个表示介于0和1之间的数字值，表示合流。为了预测启动分化的最佳时刻，用户将必须将与同一样本关联的所有图像保存在单个文件夹中，然后运行run_confluency_estimation （input_folder ）。所述ccEstimate 包包括示例数据集，可使用进行研究run_confluency_ 估计（文件run_example = TRUE）的功能。

图3 。所述的示意性表示单层汇合和最佳时间的估计使用的iPSC-CVPCs分化开始ccEstimate 。A.表示在哪里放置拍摄图像标记的示意图。线条和数字表示每天将要拍摄图像的10个位置（视图）。B. 由ccEstimate 执行的图像处理的示意图。改编自D'Antonio-Chronowska 等。（2019b）。

iPSC-CVPC的分化
参阅图URE 4 的分化方案的示意性表示和图5，图6和图7和视频1 - [R 具有代表性图像的iPSC-CVPCs的。

图4. iPSC-CVPCs区分协议的示意图。CHIR99021（CHIR），Versene 1（V1），Versene 2（V2）。改编自D'Antonio-Chronowska 等。（2019b）。

笔记：
至关重要的是，要保持24小时的培养基更换时间表（应该在步骤F 1- F 26 所示的确切日期同时进行培养基更换），尤其是在分化的前10天。例如：如果D0- 起始分化（步骤F的1）在9:15进行AM，以下介质的变化应在9:15 AM，根据M的时间表进行EDIA变化步骤指示F2-26。
颠倒20-30次，将所有补品与培养基充分混合。
所有培养基更换均使用35 ml / T150烧瓶进行。

第0天（D0）：当iPSC单层达到约80％汇合度时，通过用补充有12μMCHIR99021的RPMI减号培养基（参见配方：表6）代替mTeSR培养基来启动iPSC-CVPCs分化（参见配方：表11）。
D1 ：分化开始后24小时，用新鲜的RPMI减培养基替换用过的培养基。
D2 ：Ñ Ó媒体改变。
D3 ：分化开始后72小时，通过混合18ml新鲜的RPMI Minus培养基和18ml用过的RPMI Minus培养基来制备混合的新鲜和用过的RPMI Minus培养基。颠倒轻轻混合培养基，并添加7.5μMIWP-2（请参见配方：表12）。颠倒混合均匀。用补充了7.5μMIWP-2的组合RPMI减号培养基代替用过的培养基。
注意：用用同一烧瓶中的培养基制备的混合培养基代替用过的培养基。尚未广泛测试用不同烧瓶中的培养基代替混合培养基的效果。
D4 ：Ñ Ó媒体改变。
D5 ：在添加IWP-2后48小时（分化开始后120小时）用新鲜的RPMI减培养基代替用过的培养基。
D6 ：ñ Ø媒体的变化。
D7 ：分化开始后168小时，用新鲜的RPMI Plus培养基替换用过的RPMI Minus培养基（参见配方：表7）。
D8 ：ñ Ø媒体的变化。
D9 ：分化开始后216小时，用新鲜的RPMI Plus培养基替换用过的培养基。
D10 ：ñ Ø媒体的变化。
D11 ：[R E放置用过培养基用新鲜的RPMI加培养基。
D12 ：ñ Ø媒体的变化。
D13 ：[R E放置用过培养基用新鲜的RPMI加培养基。
D14 ：ñ Ø媒体的变化。COA 吨新T150烧瓶用MATR 埃吉尔（20 毫升，每烧瓶）。
D15 ：P assage使用的Accutase的iPSC的CVPCs。
注意：在D15机械分离iPSC-CVPC对于使用乳酸有效代谢细胞的纯化至关重要。
（可选）对单元格进行图像和/ 或视频记录。有关D15处iPSC-CVPC的代表性图像，请参见图5A。
吸出用过的培养基，并用PBS（20 ml / T150烧瓶）洗涤细胞。
吸出PBS，向每个T150烧瓶中加入10毫升室温Accutase。在37°C下孵育细胞10分钟。
孵育10分钟后，每瓶CVPCs收获培养基添加10 ml （请参见配方：表9）。
使用细胞刮刀从烧瓶表面轻轻刮除细胞。
将细胞收集在125毫升无菌瓶中。
再将板洗涤3次，每次用10 ml CVPCs Harvest培养基洗涤。将所有细胞收集在同一瓶中。
注意：请勿将单元格拆分为单个单元格。如果细胞成团，每团很少，则细胞会更好地重新附着。
颠倒瓶子，混合所有细胞，然后将它们分成适当量的50ml锥形管以离心细胞。
在室温下以136 xg （800 RPE 在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中进行800 RPE）离心细胞8分钟。
离心后，吸出上清液，将细胞重悬于20 ml补充有5μMROCK抑制剂的RPMI Plus培养基中。
通过颠倒10-20次来混合细胞悬液。使用0.4％台盼蓝溶液进行活细胞计数。
注意：由于细胞以小块状（而不是单个细胞）传代，因此目标是获得估计值而不是精确的细胞计数。估计的细胞数将用于确定将重新接种细胞的新T150烧瓶的数量。
确定重新铺板细胞所需的烧瓶数量。计算1.5 - 2.0×10 8 每每个新鲜烧瓶（1-1.3×10 6细胞6 /厘米2 ）。
将细胞重悬于适当体积的RPMI Plus培养基中，该培养基中应添加5μMROCK抑制剂，以铺板新鲜烧瓶（35 ml / T150烧瓶）。颠倒混合均匀。
吸出用基质胶包被的DMEM培养基。
将细胞重新接种到新鲜的烧瓶中，该烧瓶用基质胶（35 ml / T150烧瓶）以1-1.3 x 10 6 / cm 2 的密度包被过夜（请轻松参见步骤F16 k）。将细胞均匀地分布在烧瓶的整个表面上。
注意：为帮助一次将细胞均匀分布在一个培养皿中，并以十字形（T形）摇动新培养的培养皿。
将板放在培养箱中。将细胞在37 °C ，5％CO 2 下孵育直至第二天，而无需将板堆叠。
D16 ：甲spirate用过的培养基和洗涤细胞用PBS（20毫升/ T150烧瓶）。用RPMI乳酸培养基替换RPMI Plus培养基（请参见配方：表8）。
D17 ：- [R E放置用过的培养基用新鲜的RPMI乳酸平台。
D18 ：ñ Ø媒体的变化。
D19 ：- [R E放置用过的培养基用新鲜的RPMI乳酸平台。
D20 ：ñ Ø媒体的变化。
D21 ：甲spirate用过的培养基和洗涤细胞用PBS（20毫升/ T150烧瓶）。用RPMI Plus培养基替换RPMI乳酸培养基
D22 ：ñ Ø媒体的变化。
D23 ：[R E放置用过培养基用新鲜的RPMI加培养基。
D24 ：ñ Ø媒体的变化。
D25 ：Ç ollect所有单元格。
（可选）对单元格进行图像和/或视频记录。有关D25处iPSC-CVPC的代表性图像，请参见图5B。
吸出用过的培养基，并用PBS（20 ml / T150烧瓶）洗涤细胞。
将Aspira te PBS加入每个T150烧瓶中，加入10 ml室温Accutase。在37°C下孵育细胞10分钟。
孵育10分钟后，每瓶CVPCs Harvest培养基添加10 ml。
使用细胞刮刀从烧瓶表面轻轻刮除细胞。
将细胞收集在125毫升无菌瓶中。
再将板洗涤3次，每次用10 ml CVPCs Harvest培养基洗涤。将所有细胞收集在同一瓶中。
颠倒瓶子，混合所有细胞，然后将它们分成适当量的50ml锥形管以离心细胞。
在室温下以136 xg （800 RPE 在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中进行800 RPE）离心细胞8分钟。
离心后，吸出上清液，并通过在10至20 ml的CVPCs Harvest培养基（每个收集细胞的烧瓶为5 ml）中上下吸液重悬细胞。
通过颠倒10-20次来混合细胞悬液。使用0.4％台盼蓝溶液进行活细胞计数。
估计要进行分子分析，流式细胞仪和/或免疫荧光检测的细胞要冷冻保存或处理的数量。

图5. iPSC-CVPC的代表性图像。一。D15 ：Ç 厄尔生长在多个层，形成一个厚的片材。乙。D25 ：中号细胞OST形成单细胞层，然而，一些细胞可以形成聚集体和簇。

视频1. iPSC-CVPC的代表视频在D15击败

iPSC-CVPC的冷冻保存
通过在FBS中制备20％DMSO溶液来制备2 x iPSC-CVPCs冷冻培养基。每个要冷冻保存的冷冻管，准备0.25 ml 2 x iPSC-RPE冷冻培养基。冷冻细胞的最终密度为1.2 x 10 7 / ml（取决于下游实验，可以修改单个冷冻管中冷冻保存的iPSC-CVPCs细胞的体积和浓度）。
可选：如果需要无血清条件，请使用KOSR代替FBS 准备2 x iPSC-CVPCs冷冻培养基。
准备并打印冷冻管标签。准备n + 2个标签数（n =要冷冻保存的冷冻管数量）。准备并粘贴所有要冷冻的冷冻管的标签，为Frosty先生使用一个标签，并为保存记录使用一个标签（即实验手册）。
将所需数量的要冷冻保存的细胞转移到新的15 ml或50 ml锥形管中。
在室温下以136 xg （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以800 RPM）离心细胞5-8分钟（根据细胞体积调整离心时间）。
离心后，吸出上清液，将细胞重悬于每个冷冻小管的0.25 ml FBS（或KOSR）中，以2.4 x 10 7 / ml 的浓度冷冻（即，对于10个冷冻小瓶，将6 x 10 7个细胞重悬于2.5毫升的FBS或KOSR）。
打开所有预先标记的冷冻管，并向每个冷冻管中添加0.25 ml细胞悬液。
将0.25 ml 2 x iPSC-CVPCs冷冻培养基添加到每个包含iPSC-CVPCs细胞悬液的冷冻管中。
关闭所有冷冻小管，轻轻颠倒5-6次，以混合细胞悬液和2x iPSC-CVPCs冷冻培养基（请参阅配方：表10）。将冷冻管转移到Frosty先生的冷冻容器中。
立即将Frosty先生转移到-80°C的冰箱中。当冷冻大量的冷冻管（即，多个Frosties先生）制备单独的批次，只包含将装配到一个雾先生冷冻管的数量每批。
24-48小时后，将细胞转移到液氮蒸气罐中。相应地更新记录（即，箱形图）。

在这里，我们提供了流式细胞术（FC）和免疫荧光（IF）的详细协议，可用于对衍生的iPSC-CVPC细胞进行定量（FC）和定性（FC和IF）质量控制。

弗洛W¯¯仪
活细胞计数后（步骤F26k ），确定应固定多少个细胞以进行流式细胞术分析，并将所需数量的细胞转移到15 ml锥形管中。至少使用2-5 x 10 6个电池。
在室温下以136 xg （800 RPM 在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中）离心细胞5分钟。
离心后，吸出上清液，将细胞重悬于10 ml PBS中。
可选：如果用于流式细胞术的细胞悬液体积小于0.5 ml，则直接向细胞中加入14 ml PBS，并将细胞和PBS的离心混合物以136 xg（在带有75 的Sorvall 75006445转子中以800 RPM离心）006441 K桶）在室温下。
使用90％冷甲醇固定细胞：
在离心过程中，准备新鲜的1％甲醛的PBS溶液。拌匀为每个样品准备1ml 1％甲醛。
离心后倾析或吸出上清液。
使用P1000移液器在1ml 1％甲醛中重悬细胞。在室温下孵育细胞20分钟。
孵育后加入5毫升的PBS，离心样品8分钟在216 ×g下（1 ，000 RPM 在SORVALL 在室温下75006445转子75006441个ķ桶）。
离心后，将含甲醛的上清液放入适当的废物容器中。
将细胞重悬于5 ml PBS中，并在室温下以216 xg 再次离心样品8分钟。
离心后，吸出上清液，并使用P1000移液管将细胞重悬于1-2 ml的90％甲醇冷溶液中
在+ 4°C下将细胞固定至少30分钟，或将其在90％甲醇中保存长达数周。
细胞固定后，进行通透和封闭
从+4°C 冰箱中取出固定的细胞，然后添加5-8 ml PBS稀释甲醇。
离心机样品在216 10-12min XG （1 ，000 RPM 在SORVALL 在室温下75006445转子75006441个ķ桶）。
离心后，将含有甲醇的上清液放入适当的废物容器中。
加入5毫升的PBS。
在室温下以216 xg （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以1,000 RPM）离心样品10分钟。
在室温下。
离心后倾析或吸出上清液。
使用P1000移液器将细胞重悬于2-3 ml的透化/封闭缓冲液中（请参见配方：表15）。
在室温下孵育细胞30分钟
孵育后，加入5 ml PBS
离心机样品在216 10分钟XG （1,000 RPM 在SORVALL 75006445转子75006441个ķ桶）一吨室温。
离心倾析或吸出上清液后，加入5 ml PBS，在室温下以216 xg 再次离心细胞10分钟。
离心后倾析或吸出上清液。
使用P1000将细胞重悬在FACS缓冲液中（请参阅配方：表14）。浓度为1 x 10 7 / ml。
细胞通透并封闭后染色细胞
按照表21 制备一抗染色混合物。染色细胞的浓度为1 x 10 7 / ml（即2.5 x 10 5个细胞应在25μl的染色混合物中染色）。
将25μl固定和透化的细胞转移到96孔圆底测定板的2孔中。为了在对多条线染色时限制抗体和细胞的使用，请从每条线中混合相等数量的细胞，然后将25μl细胞混合物转移到对照孔中（小鼠IgG1抗体）。
注意：对2.5 x 10 5个细胞的染色可实现高效的细胞和试剂使用，但是每次染色也可使用5 x 10 5 或1 x 10 6个细胞，以保持相同的抗体稀释比并扩大体积。
离心机板上在863 ×g下（2000 RPM在一个SORVALL 75006445转子75006441个ķ桶）8-10倒数了从当速度达到863 ×g离心（2,000 RPM在SORVALL 在室温下75006445转子75006441个ķ桶）。
详细地：
将离心机设置为863 xg （2,000 RPM），室温下1分钟）；启动离心机，直到速度达到863 xg （2,000 RPM）。
数到8-10秒，然后停止离心。离心后的沉淀应清晰可见，尤其是使用1 x 10 6个细胞时。
离心后，轻轻吸出上清液，非常小心不要吸出任何细胞。如果使用真空抽吸细胞，请使用不带过滤器的P20吸头（或不带过滤器的P200 + P20吸头）。在每个孔中保留约10-20μl液体，以避免抽吸细胞。
加入25微升（或适量）的染色混合物。使用用于20μl的多通道移液器，通过上下移液20次，轻轻地混合细胞和抗体。
在+4° C的冰箱中将细胞与一抗孵育45分钟。
在孵育的最后5分钟内，按照表21准备第二次染色混合物。将第二种染色混合物放在冰上，避光保存，直到使用。
45分钟后，添加150μlFACS缓冲液（请参见配方：表14 ）。
如上所述，将板以863 xg离心8-10 s（步骤H 6c）。
离心后，轻轻吸出上清液，非常小心，不要如上所述吸出任何细胞（H 6d）。
使用多通道移液器添加200μlFACS缓冲液，轻轻混合细胞5-6次。
像步骤H 6c 一样离心板。
重复步骤ħ 6j- F6 升洗涤细胞总两次洗涤的。
将细胞重悬于25μl（或适当量）的二次染色混合物中。使用用于20μl的多通道移液器，通过上下移液20次，轻轻地混合细胞和抗体。
将细胞与二抗在+4°C冰箱中避光孵育45分钟。
与第二抗体温育后跟随小号TEPS ħ 6H- F6 米吨ö洗细胞总两次洗涤的。
最后一次离心后，轻轻吸出上清液，并使用多通道移液器将细胞重悬于200μlFACS-FIX缓冲液中（请参见配方：表16 ）。轻轻吸移细胞5-6次。
使用P1000移液器一次将每个样品转移到带有Cell Strainer Snap Cap 的Corning TM Falcon TM 试管中，使细胞穿过瓶盖中的过滤器。
注意：应变细胞对于确保单细胞采集并防止流式细胞仪阻塞至关重要。
与另外的250 μ 升洗每个孔，并转移到合适的管使细胞通过过滤器中的盖。取决于用于染色的细胞数，将细胞稀释至适当的浓度，以免堵塞流式细胞仪。
将所有管子放在合适的架子上，并用铝箔纸包裹以防光照。
使用流式细胞仪FACS Canto II（或其他流式细胞仪）进行采集。
使用FlowJo 软件V 10.4 执行流式细胞仪分析。有关iPSC-CVPC流式细胞仪染色结果的示例，请参见图6 。

图6. 第25天对iPSC-CVPCs（iPSCORE_28_2）的流式细胞仪分析，显示红色的心脏肌钙蛋白T（cTnT ，TNNT2）高染色，蓝色的免疫球蛋白对照IgG1。存活的单个心脏肌钙蛋白T阳性细胞（cTNT +）的百分比。

免疫荧光
外套Millicell小EZ SLIDE 8孔载玻片上用于与0.1％明胶溶液至少15分钟（见配方：表2）。
将新鲜或冷冻保存的iPSC-CVPCs细胞接种在Matrigel包被的Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片上。每条线至少以1.6-2.1 x 10 5 / cm 2 的密度铺板。
培养细胞至少3-5天，直到细胞从传代或低温保存中恢复。
吸出培养基并用PBS洗涤细胞两次。吸出PBS。
在室温下用4％PFA固定细胞20分钟。
取出PFA溶液，将其放入适当的废物容器中。
用PBS洗涤细胞两次。
使用IF Perm Buffer II透化细胞（请参见配方：表17）。在室温下孵育细胞8 分钟。
吸出IF Perm Buffer II。
在室温下，使用IF封闭缓冲液II （请参见配方：表18）封闭细胞30分钟。
在封闭的最后5分钟内，在IF染色缓冲液中准备一级抗体溶液（请参见配方：表19和表21 ），以获取适当浓度的抗体。将抗体溶液储存在冰上直至使用。
封闭所有缓冲液后，用PBS洗涤细胞两次，然后将抗体溶液加入适当的孔中。
将细胞与抗体溶液在4 °C下孵育过夜。
下一步（早上）在IF染色缓冲液中制备二抗溶液。请参阅表21 的AP 抗体的浓度propriate。将抗体溶液在冰上保存，直至使用，并避光。
吸出一级抗体溶液，并用PBS洗涤细胞3次。最后清洗后，吸出所有PBS。
立即将二抗溶液添加到适当的孔中。在黑暗中于室温下孵育细胞45-60分钟。
吸出二抗溶液并用PBS洗涤细胞三遍。最后清洗后，吸出所有PBS。
卸下Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片的壁。
添加的ProLong ® Gold抗淬灭试剂与DAPI按照制造商的建议，并轻轻地安装玻璃盖滑避免气泡。用铅笔橡皮轻轻地去除任何气泡。在黑暗中将载玻片在室温下存放几个小时（直到第二天为止最好），以便正确安装。
使用适当的免疫荧光显微镜（最好是共聚焦激光扫描荧光显微镜）获取图像。参阅图7 为iPSC的CVPCs免疫荧光染色的实例。

图7.间隙连接连接蛋白43（CX43），抗肌球蛋白轻链2（MLC2v）抗体的免疫荧光分析（小鼠单克隆抗肌球蛋白心房轻链7（MLC2a），iPSC-CVPCs的α-肌动蛋白在D30 适应。来自D'Antonio-Chronowska 等人（2019b）。

菜谱

细胞培养试剂和培养基制备
基质胶溶液（表1）

表1. 基质胶溶液的制备

明胶溶液（表2）

表2 。配制0.1％明胶溶液

1. 10 mM ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐（表3）

表3. 1. 10 mM ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐的制备

10x Dispase解决方案（表4）

表4 。制备10倍分散酶溶液

mTeSR TM 1完全培养基（表5）

表5. mTeSR TM 1完全培养基的制备

RPMI减号（-）培养基（表6）
表6 。RPMI减号（-）培养基的制备

RPMI Plus（+）培养基（表7）

表7 。RPMI Plus（+）培养基的制备

RPMI Plus（+）培养基（表8）

表8 。RPMI乳酸盐培养基（4mM L-乳酸钠）的制备

RPMI乳酸培养基（4 mM L-乳酸钠）（表9）

表9. iPSC-CVPCs收获培养基的制备

iPSC-CVPCs 2 x 冷冻培养基（表10）

表10. iPSC-CVPCs 2X冷冻培养基的制备

10 mM CHIR-992021溶液（表11）

表11 。制备10 mM CHIR-992021溶液

5 mM IWP-2解决方案（表12）

表12 制备5mM的IWP-2溶液

1M的钠大号-La ctate溶液（表13）

表13 。制备1 M L-乳酸钠溶液

缓冲液准备
FACS缓冲液（表14）

表14. FACS缓冲液的制备

透化/阻断缓冲液（表15）

表15. 渗透/阻断缓冲液的制备

FACS-FIX缓冲液（表16）

表16. FACS-FIX缓冲液的制备

中频烫发缓冲液II （表17）

表17. IF烫发缓冲液II的制备

IF封闭缓冲液II （表18）

表18. IF封闭缓冲液II的制备

中频染色缓冲液（表19）

表19 。中频染色缓冲液的制备

70％ë THANOL（表20）

表20. 70％e 醇的制备

抗体

表21. 抗体浓度

致谢

CIRM授予GC1R-06673-B，NSFCMMI部门授予1728497以及NIH授予HG008118，HL107442，DK105541和DK112155来支持这项工作。该方案改编自先前的工作（D'Antonio-Chronowska 等，2019b）。

利益争夺

作者是ATGCures，Inc.的联合创始人和股东。否则，作者声明不存在冲突或利益冲突。

伦理

iPSC系由iPSCORE 项目的一部分招募的181位个体（108位女性和73位男性）生成（Panopoulos 等，2017）。这些个体包括7对单卵（MZ）双胞胎，32个家庭的成员（2-10个成员/家庭）和71个单身人士（即，与本研究的任何其他个体无关），并且具有不同的血统：欧洲人（118），亚洲人（27），西班牙裔（12），非洲裔美国人（4），印度人（3），中东人（2）和混合种族（15）。招募对象的年龄为9至88岁。从研究中的所有受试者获得知情同意。征聘工作已获得加利福尼亚大学圣地亚哥分校的机构审查委员会和Salk研究所的批准（项目号110776ZF）。

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