材料和试剂
1. 小号terile的枪头
2. 1.5毫升Eppendorf微量离心管（Eppendorf，目录号：0030121694）
3. 隼，Ç onical Ç entrifuge 吨ubes50毫升（康宁，目录号：14-432-22）
4. 0.45 微米过滤器（VWR ，目录号：28145-479）
5. 14 ml开顶薄壁超透明离心管（Beckman Coulter ，目录号：344060）
6. D型可分配的塑料旋转柱（Thermo Fisher Scientific，目录号：10220544）
7. 小号nakeSkin 透析袋10 kDa的截止（赛默飞世尔科技，产品目录号：68100）
8. 酿酒酵母L40cc ua 菌株
9. pDR296-His-BCM1 质粒
10. 鲑鱼精子（Thermo Fisher Scientific，目录号：15632011）
11. 软化水
12. Bacto y east 提取物（Cal Roth，目录号：2904）
13. Bacto 蛋白ept（Cal Roth，目录号：8952 ）
14. ģ lucose一水合物（卡尔罗斯，目录号：6780 ）
15. 甲丹尼恩硫酸盐（Sigma-Aldrich公司，目录号：A3159）
16. Agar-Y（MP Biomedicals，目录号：4019012）
17. Y 东氮碱（YNB）和硫酸铵（MP Biomedicals，目录号：4027412）
18. 合成漏失/ -色氨酸（SD / - 色氨酸）（MP Biomedicals公司，目录号：4511012）
19. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516 ）
20. 正十二烷基-β-D- 麦芽糖苷（β-DM）（Sigma-Aldrich，目录号：D4641）
21. 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA · Na 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：ED 2SS）
22. 三（羟甲基）氨基甲烷（T ris）（Cal Roth，目录号：A411）
23. 盐酸（VWR），目录号：BDH7204
24. 氢氧化钠（Fisher Scientific，目录号：BP359-212）
25. 醋酸锂（LiAc ）（Cal Roth，目录号：5447）
26. 聚乙二醇4000（P EG4000）（Sigma-Aldrich，目录号：8.07490）
27. 大号iquid氮
28. 不含E DTA的cOmplete 微型蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
29. ģ 小姑娘珠（425-600 微米）（Sigma-Aldrich公司，目录号：G8772）
30. 氯化钠（Ñ ACL）（卡尔罗斯，目录号：9265）
31. 钾氯化物（ķ 氯）（卡尔罗斯，目录号：6781）
32. 一水磷酸二氢钠（Na H 2 PO 4 · 2H 2 O）（Cal Roth，目录号：T879）
33. 磷酸二氢钾（K H 2 PO 4 ）（Cal Roth，目录号：3904 ）
34. Ni-NTA琼脂糖树脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：88223 ）
35. 咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I 2399）
36. YP D培养基（930毫升）（请参阅食谱）
37. 40％（w / v）葡萄糖（100 ml）（请参阅食谱）
38. 0.2％（w / v）硫酸腺嘌呤（请参阅食谱）
39. YP D A 培养基（1升）（请参阅食谱）
40. SD / -Trp 培养基（1升）（请参阅食谱）
41. 80％（v / v）甘油（100毫升）（请参阅食谱）
42. 10 x Tris-EDTA （TE）缓冲液（200毫升）（参见食谱）
43. 1 M LiAc （200毫升）（请参阅食谱）
44.50 ％（w / v）PEG4000（100毫升）（请参阅食谱）
45. 10 x 磷酸盐缓冲盐水（PBS ）缓冲液（1 L）（请参阅食谱）
46. 10％（w / v）β-DM（请参阅食谱）
47. 1 x TE 缓冲区（请参阅食谱）
48. TE / LiAc 缓冲液（请参阅配方）
49. 聚乙二醇（PEG）/ LiAc 缓冲液（请参阅食谱）
50. 含有1％（w / v）β-DM的增溶缓冲液（10毫升）（请参阅食谱）
51. 洗涤缓冲液，其中含有0.02 56％（w / v）β-DM和20 mM咪唑（20 ml）（请参阅食谱）
52. Ë 琵琶缓冲含0.0256％（W / V）β-DM（见配方）

53. d ialysis缓冲器含有0.0256％（1 L）（W / V）β-DM（见配方）

设备
玻璃器皿
250 ml锥形瓶
2 0 0 ml锥形瓶
2 L 锥形瓶
1 L 锥形瓶
100 ml锥形瓶
1 L透明玻璃瓶
25 0 ml透明玻璃瓶
100 ml透明玻璃瓶
转子JA-25.50
转子FA-48-45-11
Milli-Q参考净水系统（EMD Millipore，目录号：Z00QSV0WW）
无尘工作台（Labconco ，型号：3440009）
水浴
温控振荡器培养箱
涡旋混合器（科学工业公司，型号：Vortex-Genie 2）
C 老房
Dee p冷冻机（-20°C）
超低温冰箱（-80°C）
离心机（Eppe ndorf，型号：5430 R）
高速离心机（Beckman Coulter公司，型号：阿凡提J-26XP）
Ul 微量离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima L-80 XP ）

程序
变换的S. CE revisiae 与pDR296-HIS-BCM1 质粒
Ť 他的核苷酸序列编码的成熟BCM1 （具有耗尽氨基酸55-382）ñ 末端叶绿体转运肽从拟南芥我š 克隆到酵母表达载体pDR29 6 。该构建体包含N端组氨酸（His）标签，以利于通过固定的镍亲和色谱法纯化BCM1（图1）。

图1 。pDR296-BCM1的质粒图谱。指出了质粒中独特的限制性位点和重要特征。PMA1启动子，转录促销之三为酿酒酵母质膜ATP酶1（PMA1）基因。ADH1终止子，酿酒酵母酒精脱氢酶1（ADH1）基因的转录终止子。2 μ ORI ，复制的酵母2μ质粒起点。TRP1，色氨酸生物合成蛋白。AmpR ，编码β-内酰胺酶的基因，赋予对氨苄青霉素的抗性。

条纹出甘油STOC 的k个S. 酵母L40cc UA 上一个YPDA琼脂平板并孵育在30℃下将板两天。
接种5ml YPDA介质与1个菌落的酿酒酵母L40cc UA 在一个14毫升˚F 爱尔康管并生长在30℃和250rpm下过夜。
将过夜培养物转移到250 ml锥形瓶中的100 ml YPDA培养基中，并继续在30°C和250 rpm下生长2-4 h，直到培养物在600 nm（OD 600 ）处的光密度达到0.4-0.6 。
使用转子JA-25.50在室温下以1,000 xg离心5分钟以收获细胞。
ř esuspend细胞在软化水中由v ø rtexing 5-10 s，在1000，通过离心收获细胞，然后XG 使用转子JA-25.50在室温下5分钟。
在1.5 ml TE / LiAc 缓冲液中重悬细胞（细胞滴度为〜3 x 10 9 细胞/ ml ）。这些都是现在的酵母感受态细胞。
添加0.1-0.2 μ 克pDR296-HIS-BCM1 质粒，10 微升变性的鲑精DNA中，100 微升酵母感受态细胞到1.5ml Eppendorf管中，并通过将它们充分混合移液2-3次。
向试管中加入600μl 新鲜制备的PEG / LiAc 缓冲液，并通过涡旋充分混合5秒钟。
我ncubate 的在30℃下混合物30分钟以200rpm振荡。
向培养物中添加70μlDMSO ，并轻轻颠倒混合均匀。
H 将试管在42°C水浴中吃15分钟，不要摇晃。
将试管放在冰上1-2分钟。
通过使用转子FA-48-45-11 在室温下以12,000 xg离心 5 s 来沉淀细胞。
ř esuspend细胞在软化水中，并在12000通过离心收获细胞，然后XG 在室温下5秒使用转子FA-48-45-11。
ř esuspend细胞200 微升1的X TE 缓冲液和扩散100 微升上的SD /转化混合物的- 色氨酸琼脂平板上。
将琼脂平板在30°C下孵育2-4天，直到出现菌落。
挑单个栏从变换板使用无菌移液管尖端和接种5ml YPDA介质的ONY 在一个14毫升˚F 在30爱尔康管℃下和250rpm下过夜。
甲DD 250 微升的80％（V / V）甘油，以750 微升在1.5ml Eppendorf管中过夜培养，并通过搅拌均匀涡旋荷兰国际集团为5秒。
闪光冻结管在液氮中，小号撕的甘油原液在-80℃下以供将来使用。
酿酒酵母中His-BCM1的大规模表达
条纹化转化S 的甘油储备。酵母L40cc UA上的SD / - 色氨酸琼脂板上并在30℃下孵育板两天。
接种5 0 ml的SD的/ - 色氨酸与2-介质3 结肠IES ö ˚F 小号。在2 0 0 ml锥形瓶中，从步骤B1 中提取啤酒L40cc ua，并在30°C和250 rpm下生长过夜。
Ť 转让（BOT）的过夜培养至1L的SD / - 色氨酸介质在2 大号Erlenmeyer烧瓶中并在30℃下生长，并以250rpm 3- 4 小时，直到OD 600 0.4-0.6之间的培养物达到的。
通过使用转子FA-48-45-11 在4°C下以1,000 xg离心5分钟收获细胞。
闪光冷冻在液氮中并储存沉淀在-80℃下以供将来使用。
通过免疫印迹分析His -BCM1在酿酒酵母细胞中的表达（图2 ）。

图2 。免疫印迹婷分析的His-B的在CM1表达小号。酿酒酵母。泳道1：吨otal 裂解物未转化的小号。啤酒酵母细胞。泳道2：吨转化的裂解物otal 小号。啤酒酵母细胞。将总酵母蛋白用考马斯亮蓝（CBB，上图）染色，并用BCM 1抗体（下图）进行探测。如先前所述进行免疫印迹分析（Wang 等，2020）。

从总酵母膜提取物中纯化His-BCM1
在冰上解冻在步骤B5中获得的酿酒酵母细胞沉淀。
将细胞重悬于冰冷的20 ml 1 x 磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中，并补充2片蛋白酶抑制剂。
加入3 g 冷冻玻璃珠，并以最大速度涡旋5-7次，每次1分钟，每次涡旋之间将细胞在冰上保持1分钟。
使用转子JA-25.50在4°C下以1,000 xg离心5分钟，以除去未破碎的酵母细胞和玻璃珠。
Ť 转让（BOT）的上清液，使用塑料吸管和一个干净的14毫升的超速离心管沉淀通过超速离心总酵母膜以40,000 ×g下在4℃下30分钟℃下使用转子SW 40的Ti。
通过轻轻吸打5-10次，将酵母膜沉淀物重悬于10 ml冷冻增溶缓冲液中。
我将悬浮液在冰上以100 rpm的速度孵育30分钟。
P 以40,000 ellet不溶性碎片通过离心XG 为30分钟，在4℃下使用转子SW 40-Ti和上清液转移到一个干净的50ml管中。
在上清液中加入dd 1 ml的Ni-NTA琼脂糖树脂（用增溶缓冲液预先平衡），并在4°C的辊式混合器上混合1 h。
将悬浮液转移至10 ml一次性塑料旋转柱中，并使悬浮液在重力作用下通过。
W¯¯ 灰的Ni-NTA琼脂糖以10ml洗涤缓冲液的树脂和让洗涤缓冲运行通过重力。
我ncubate Ni-NTA琼脂糖树脂与在冰上2毫升洗脱缓冲液的1-2分钟和收集然后流过。
使用转子FA-48-45-11 在4°C下以20,000 xg离心10分钟，以除去洗脱液中的聚集体。
d ialyse 的洗脱对1升透析缓冲液在4℃下1个小时。改变透析缓冲液和透析过夜，在4℃ 。
将洗脱液转移至干净的1.5 ml Eppendorf管中。
加入50 微升的甘油至1ml的洗脱液，并将它们混合瓦特ELL通过温和移液3-5次。
在冰上将蛋白质溶液分成100μl 等分试样。
闪冻在液氮中，存储中的等分试样在-80℃下以供将来使用。
使用12％SDS-PAGE 分析纯化的His -BCM1蛋白（图3 ）。

图3 。纯化的His-BCM1的SDS-PAGE分析。泳道中号：蛋白质标记; 泳道1：纯化的His-BCM1 （约36.5 kDa的）指示由所述箭头; 泳道2-4：0.5、1和2μg 牛血清白蛋白标准品。

笔记
有必要煮沸的鲑鱼精子DNA，在100℃ 进行5分钟，并在使用前立即冰上冷却。
Ť Ó诱导的表达在pDR296-HIS-BCM1 小号。酿酒厂，我们使用SD / -Trp 培养基代替YPDA培养基。

菜谱
媒体和库存解决方案
YP D培养基（930毫升）
溶解1种0克细菌用酵母提取物和20g 细菌用蛋白胨在93 0米升的软化水在1L透明玻璃介质瓶
甲DD20克琼脂-Y仅用于制造固体GAR 板
甲在121℃utoclave 20分钟上的液体循环
商店的长达6个月，在室温下
40％（w / v）葡萄糖（100毫升）
溶解4 0克克lycerol在40毫升的软化水中50℃的水浴中的100ml的Erlenmeyer 烧瓶
用去离子水最多填充100毫升
通过经由0.45过滤消毒微米过滤器
商店为长达1个月，在4℃
0.2％（w / v）硫酸腺嘌呤
解散0 。1 克腺嘌呤苏升命运5 0毫升软化水的ë ralized水在100毫升的锥形烧瓶
通过经由0.45过滤消毒微米过滤器
这是新鲜配制的溶液
YP D A 培养基（1升）
在1 L 无菌锥形瓶中，在无菌条件下，向930 ml的YPD 培养基中添加50 ml的40％葡萄糖和20 ml的0.2％（w / v）硫酸腺嘌呤。
该培养基是新鲜制备的
SD / -Trp 培养基（1升）
d issolve 20毫克SD / - 色氨酸和6.7克YNB在9 5 0 ml的软化水在1L透明玻璃介质瓶
用NaOH调节至pH 5.8
甲DD20克琼脂-Y仅用于制造固体GAR 板
甲在121℃utoclave 20分钟上的液体循环
在无菌条件下添加50 ml 40％（w / v）葡萄糖9 5 0 ml 培养基
商店的长达6个月，在室温下
80％（v / v）甘油（100毫升）
80米添加升甘油到20ml的软化水中的100毫升的透明玻璃介质瓶
甲在121℃utoclave 20分钟上的液体循环
商店的长达6个月，在室温下
10 x TE 缓冲液（200毫升）
将2402毫升Tris和0.744克EDTA · Na 2 溶解在25 毫升0ml透明玻璃瓶中的160毫升去离子水中
用盐酸调节至pH 8.0
用去离子水加满200毫升
通过经由0.45过滤消毒微米过滤器
商店的长达6个月，在室温下
1 M LiAc （200毫升）
在25 0 ml透明玻璃瓶中将13.2 g LiAc 溶于160 ml去离子水中
调节至pH 7.5与ACET 我Ç 酸
用去离子水加满200毫升
通过经由0.45过滤消毒微米过滤器
商店的长达6个月，在室温下
50％（w / v）PEG4000（100毫升）
在100 ml透明玻璃介质瓶中的50°C水浴中，将50 g PEG4000溶解在50 ml的去离子水中
用去离子水最多填充100毫升
通过经由0.45过滤消毒微米过滤器
商店的长达3个月，在室温下
10x PBS 缓冲液（1 L）
溶解80克的NaCl，2g的氯化钾，15.6克的NaH 2 PO 4 · 2 ħ 2 O和2 4克ķ ħ 2 PO 4 在800 毫升软化水中在1升的透明玻璃介质瓶
调整至pH 7.4
填补了1 大号用软化水
甲在121℃utoclave 20分钟上的液体循环
商店的长达6个月，在室温下
10％（w / v）β-DM
d issolve 0.1 Gβ-DM 1 ml的去离子水中在1.5米升微量离心管
商店的长达6个月- 20 ℃，

缓冲
1 x TE 缓冲液（100毫升）
在无菌条件下，在100 ml透明玻璃培养基瓶中，将10 ml的10 x TE 缓冲液添加到90 ml的去离子水中
该缓冲区是新准备的
TE / LiAc 缓冲液（100毫升）
在天冬氨酸条件下，在100 ml透明玻璃介质瓶中，将10 ml的10 x TE 缓冲液和10 ml的1 M LiAc 加到90 ml的去离子水中。
该缓冲区是新准备的
PEG / LiAc 缓冲液（10毫升）
在天冬氨酸条件下在14 ml F alcon管中将1 ml 10 x TE 缓冲液和1 ml 1 M LiAc 加到8 ml 50％（w / v）PEG4000 中
该缓冲区是新准备的
含有1％（w / v）β-DM的溶解缓冲液（10 ml）
在100 ml透明玻璃培养基瓶中的45 ml 1 x PBS缓冲液中加入5 ml 10％（w / v）β-DM
该缓冲区是新准备的
含有0.0256％（w / v）β-DM和20 mM咪唑（20 ml）的洗涤缓冲液
溶解27.2毫克咪唑至20ml 1 X PBS缓冲液，补充有51.2 微升的10％（W / V）β-DM在50ml透明玻璃介质瓶
该缓冲区是新准备的
含有0.0256％（w / v）β-DM和300 mM咪唑（20 ml）的洗脱缓冲液
溶解0.408 克咪唑至20ml 1 X PBS缓冲液，补充有51.2 微升的10％（W / V）β-DM在50ml透明玻璃介质瓶
该缓冲区是新准备的
含有0.0256％（w / v）β-DM的透析缓冲液（1 L）
将0.256 gβ-DM溶解于1 L透明玻璃培养基瓶中的1 L 1 x PBS缓冲液中
该缓冲区是新准备的

致谢
这项工作是由亚历山大·冯·洪堡基金会（Alexander von Humboldt Foundation）向PW资助的，德国Deutsche Forschungsgemeinschaft 向PW（WA 4599 / 2-1）和BG（FOR2092，GR 936 / 18-1和SFB TR175，子项目C04）资助的。该协议改编自先前描述的方法（Wang 等，2020）。

利益争夺

我们声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献
Brzezowski，P.，Richter，AS和Grimm，B.（2015）。植物和藻类中四吡咯生物合成的调控和功能。Biochim Biophys Acta 1847（9）：968-985。
Wang，P.，Richter，AS，Kleeberg，JRW，Geimer，S.和Grimm，B.（2020年）。叶绿素生物合成的翻译后协调和BCM的分解在叶片发育过程中维持叶绿素稳态。Nat Commun 11（1）：1254。