材料和试剂
14毫升无菌Borosilicatetubes （派勒斯® ，目录号码：SLW 1622 / 09M））
1.5 ml无菌Eppendorf离心管（Eppendorf，目录号：022364111）
无菌的枪头1-200，100-1 ，000（康宁® ，目录号：S4860，S9032）
无菌皮氏培养皿玻璃板（直径40 毫米和80 毫米）（品牌® ，目录号s ：BR455701 ，BR455732）
无菌棉塞（Nunn Finer，目录号：562）
玻璃优惠券（约15毫米x 15毫米x 1毫米）
从用金刚砂切割的玻片上获得。为了制备试样，用金刚砂石的连续通过轻轻地将载玻片切成薄片。您可以润湿该区域以利于切割。最后，将玻璃载玻片用毛巾包裹，并通过用力按压标记的区域进行最终切割。
玻璃载片（YEGREN ® ，目录号：7101）
金刚砂石（Value-Tec，目录号52-003094）
小号容器（20厘米x 30厘米x 6厘米）
耙形玻璃吊具（Chemglass Life Science，目录号：CLS-1350-01）
铝箔（雷诺包装重型铝箔，目录号：625）
擦手纸（WypAll * X 60 Jumbo Roll，KCWW，Kimberly-Clark，货号：30218593）
接种环（Decon TM ，目录号：MP 19025）
铜绿假单胞菌PAO1菌株（BH Holloway）
铜绿假单胞菌PAO1保持在液氮中的甘油储备中。通过倒置130 µl无菌甘油和770 µl在LB培养基中生长的过夜细菌培养物进行混合来制备原种。将细菌用无菌接种环从甘油储备液中划线到固体LB平板上，并在37°C的培养炉中生长过夜。单个菌落用作接种物。
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-500ML）
蒸馏水（G-BIOSCIENCES，目录号：786-1713）
Etanol 96％（EMSURE ® REAG ，目录号：159010 ）
Inmersion 油机（Leica，STANDAR 和“F”型）
胰蛋白（（OXOID，目录号：LP0042）
酵母提取物（默克，目录号：103753）
造粒琼脂（Difco公司，目录号：214530）
氯化钠（NaCl）的（Biopack ，目录号：1646.08）
SYTO TM 9绿色荧光核酸染色剂（Invitrogen，目录号：S34854）
碘化丙啶（英杰公司，Ç atalog号：P1304MP）
LB培养基（请参阅食谱）
LB琼脂固体培养基（请参阅食谱）
4 M NaCl溶液（请参阅配方）
盐溶液（请参见食谱）
3.5 μM SYTO 9 和20 μM PI溶液（见配方）

设备
125毫升无菌Erlenmeyers 烧瓶（杜兰® ，目录号：2121628）
2-20微升，20-100 微升，100-1,000微升卡特尔pluripet微量（卡特尔实验室器皿，产品目录号：13000，13210，13220）和1-10毫升讴歌® 手册微量（SOCOREX瑞士，目录号：835分之825）
无菌50、100和1,000 ml b 硅酸盐量筒（VILABO ，目录号：3501114，3501115，3501118）
100 ml无菌玻璃烧杯（品牌® ，目录号：BR91224）
抹刀（Arnaldochapini ® ，目录号：1929）
不锈钢解剖镊子（Fisherbrand ，目录号：12-000-132）
常规培养箱振荡器（New Brunswick Scientific Co.，INC，型号：G25）
紫外可见分光光度计（Biotraza ，型号：752）
高压灭菌器（平山HICLAVE TM ，型号：HVE-50）
热风烤箱消毒器（DalvoIntrumentos ，型号：OHR / T）
涡流（Velp，型号：ZV3，201251076）
落射荧光显微镜（奥林巴斯，型号：BX51）
孵化炉（Precision，Scientific Group，型号4，目录号：31483）
本生灯（Eisco TM ，目录号：CH0091B）

软件

ImageJ软件（Rasband ，1997 ）

程序
生物膜形成和生物膜评估的步骤总结在图1中。

图1. 实验过程示意图

生物膜形成
吸取10 ml LB培养基到125 ml无菌锥形瓶中。然后，使用接种环从LB培养基板中挑选PAO1菌落，并摇动环，直到片段明显悬浮在液体LB培养基中。在培养箱摇床上摇动（200 rpm），在37°C下生长过夜。在整个过程中，请保持本生灯的电源打开。在本生灯头产生的无菌区域内，始终缓慢，谨慎地工作。
在新的125毫升无菌锥形瓶中，在12毫升新鲜的LB培养基中稀释此过夜培养物（所需的OD 650 2.5-3）（达到OD 650 2.5-3），以使最终OD 650 约为0.01。在整个过程中，请保持本生灯的电源打开。在本生灯头产生的无菌区域内，始终缓慢，谨慎地工作。
吸取10毫升这些悬浮液于100毫升无菌玻璃烧杯中。通过使用无菌不锈钢解剖镊子，将无菌玻璃试样水平放置在每个烧杯底部，以允许在其上形成生物膜。用棉塞盖住烧杯（图2 ）。

Figu 重2 。生物膜形成装置

将玻璃烧杯放在盛有1厘米高自来水的百乐桶中，并用铝箔覆盖它们，以创建一个潮湿的房间。
在孵育箱中于37°C孵育24 h，不要摇晃。
注意：在将样片放入烧杯中之前，必须将其浸入装有96％乙醇的烧瓶中并在火上燃烧，以对其进行灭菌。在优惠券之间重复此过程。
生物膜评估
菌落形成单位（cfu ）的计数
将25毫升固体LB培养基置于80毫米培养皿中，准备新鲜的LB琼脂平板。固化后，让它们在55 °C 的烤箱中干燥干燥，然后倒置至少30分钟。
用无菌不锈钢解剖镊子从烧杯中取出试样。
让无菌蒸馏水（约10毫升）轻轻滴在优惠券上，小心地清洗优惠券以去除未附着的细胞。
用镊子垂直握住试样，并用无菌刮刀在装有1 ml 盐溶液的40 mm培养皿中将细菌块从其中分离1分钟（图3 ）。

FIGUR ê 3 。有限公司在刮

通过在小吹打盐水溶液洗券P ETRI碟以除去所有附着的细菌。
将细菌悬液置于1.5 ml无菌Eppendorf管中。
通过1分钟剧烈涡旋（2,400 rpm）进行均质化。
连续稀释悬浮液。为此，将0.5 ml的初始样品添加到装有4.5 ml盐溶液的无菌硼硅酸盐玻璃管中，并涡旋混合（10 -1 稀释）。然后，取0.5 ml的10 -1 稀释液，并将其传递到装有4.5 ml盐溶液的新试管中，进行下一个稀释（10 -2 稀释液），依此类推直至10 -5 稀释液。
使用无菌耙形摊铺机将50 µl每种稀释液分散在无菌的干燥LB板上。
在孵育炉中于37 °C 孵育平板24 小时。
计数在培养皿中LB琼脂上形成的菌落。仅需考虑含有约20-200个菌落的培养皿。
确定cfu cm -2 中的活细胞数。首先，根据以下公式计算优惠券中的总cfu ：平板中的菌落数×稀释因子×生物膜生物质的总体积（1ml）/平板体积（0.05ml）。该值必须除以试样的总表面，以获得每平方厘米2 的cfu 数。至少需要三个优惠券才能进行统计分析。
注：小号tainless钢解剖镊和耙状的玻璃吊具必须通过浸渍来灭菌进用96％乙醇的烧瓶和燃烧在每次使用之间火。将刮刀浸入96％乙醇中，然后在烤箱中干燥。

膜完整性评估
按照用于cfu 计数程序的方法，用一对不锈钢解剖镊子取出优惠券。
让无菌蒸馏水（约10毫升）轻轻滴在优惠券上，小心地清洗优惠券以去除未附着的细胞。
沉浸每个试样在1毫升溶液含3.5 μM SYTO 9和20 μM PI在放置在蒸馏水小P ETRI板。必须在黑暗条件下执行此过程。
在黑暗中于室温下孵育15分钟。
用无菌蒸馏水洗涤试样，以去除染色溶液。为此，将试样浸入装有20毫升蒸馏水的100毫升玻璃烧杯中几秒钟，然后在室温下用纸巾晾干。必须在黑暗条件下执行此过程。
在装有100 x 物镜和浸没油的荧光显微镜下观察试样。
每张幻灯片至少拍摄6张代表性照片。
使用ImageJ程序（ImageJ软件[ Rasband ，1997 ]）计算图像中红色区域的百分比：
使用ImageJ程序打开图像。
选择使用任何绘图/选择工具（红色区域，即，矩形，圆形，多边形或自由）。
然后，从“分析”菜单中选择“设置测量”并查看面积值。
对所有红色区域重复该过程。
根据图像的总面积计算红色区域的百分比。

笔记：
清洗载玻片后，可将染色的生物膜在黑暗条件下于室温下保存至少24 h，以通过落射荧光显微镜对其进行观察。
避免与SYTO9和PI接触；他们需要戴着手套小心处理。应尽可能避免或减少废物的产生。根据危险废物的安全标准，所有废物必须作为“特殊废物”丢弃。
染色和显微镜操作不需要保持无菌。

数据分析
作为所描述方法的实例，示出了不同光催化二氧化钛表面对铜绿假单胞菌生物膜的影响的结果（Pezzoni 等人，2020）。通过在受控条件下结合二氧化钛和表面活性剂，通过溶胶-凝胶和蒸发诱导的自组装获得表面。它们是：具有不同孔径的非中孔（NM）和中孔二氧化钛表面，这是通过使用表面活性剂Brij-58（MB）和Pluronics-F127（MF）实现的。另外，测定了二氧化钛的两种结构形式：无定形和锐钛矿。生物膜在这些表面上生长，并经受紫外线-A（UVA）辐射以促进光催化杀灭。生物膜以20 W m -2 的通量率（总剂量216 Kj m -2 ）暴露180分钟。
注意：图4和5 中显示的数据报告于：Pezzoni ，M.，Catalano PN，Delgado，DC，Pizarro，RA，Bellino ，MG和Costa，CS（2020）。介孔二氧化钛涂层对铜绿假单胞菌生物膜的抗生物膜作用。J Photochem Photobiol B 203：111762 。

图4 。cfu的计数显示：i ）不同的二氧化钛表面对生物膜形成（预形成的生物膜）的影响，以及ii）对这些生物膜进行光催化处理（经UVA处理的生物膜）的影响。在对照（非TiO 2 ）或二氧化钛涂覆的表面（非晶态NM，MB或MF和锐钛矿型NM，MB或MF）上获得24 h生物膜（预制的生物膜），并以20 W m -2 的通量率暴露于UVA中。（经UVA处理的生物膜）。在暴露于UVA之前和之后，将适当稀释的细菌生物量进行cfu 计数，以确定生物膜形成的效率和细胞存活率。误差棒代表至少三个独立实验的标准偏差。一个（P < 0 。05）和b（P < 0 0.005）表示生长在预先形成的生物膜之间显著差异二氧化钛和UVA曝光前的控制表面。C（P < 0 0.0005）表示显著差异生长在每个生物膜之间的二氧化钛表面和UVA曝光后的控制表面。

图5 。评价膜的完整性作为指标的光催化处理对生物膜在不同表面的影响。将在对照（无TiO 2 ）或二氧化钛涂层的表面（无定形NM，MB或MF和锐钛矿型NM，MB或MF）上生长的生物膜保持在黑暗中或以20 W m -2的注量速率暴露于UVA中180分钟。显示了用SYTO 9和PI染色剂染色的生物膜的代表性落射荧光图像。重复实验至少3次。每个值是三个独立测试的平均值。的刻度条小号表示150纳米。

菜谱
LB培养基
Dissol 已经10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5克氯化钠
用蒸馏水将体积增加至1,000 ml
在1atm高压灭菌20分钟
LB固体培养基
Dissolv Ë 10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5克的NaCl ，15g琼脂
用蒸馏水将体积增加至1,000 ml
在1atm高压灭菌20分钟
4 M氯化钠
将46.7 g NaCl溶于200 ml蒸馏水
在1atm高压灭菌20分钟
生理盐水
将7.5 ml无菌4 M NaCl与300 ml无菌蒸馏水混合
3.5 μM SYTO 9 和20μMPI溶液
0.7 μ 升的5mM的SYTO 9（原液;储存在-20 ℃下从光保护）
26 μ 升0.77 毫PI（原液;储存在4 ℃下从光保护）
1000 μ 蒸馏水升
为每个实验准备新鲜
实验过程中，溶液可以在室温下避光保存

致谢
衷心感谢P. Pereyra Schuth 女士的出色技术协助。阿根廷国家能源委员会（ComisiónNacional deEnergíaAtómica ）获得了这项研究的资金支持。国会议员是国立中央调查公司（Conicet，阿根廷）的调查员。
菌落形成单位的计数过程是基于先前的Merritt，Kadouri 和O'Toole（2005）的协议。用于膜完整性评估的活/死染色方法是Smith和Hunter（2008）发表的方案的修改。

利益争夺
作者宣称没有利益冲突。

参考文献
Ben Said ，M.，Khefacha ，S.，Maalej ，L.，Daly，I.和Hassen，A.（2011年）。AJMR 525：4353-4358。
Berney ，M.，Weilenmann ，HU和Egli ，T。（2006）。流式细胞术研究太阳能消毒（SODIS）中大肠杆菌的重要细胞功能。微生物学152（Pt 6）：1719-1729。
Bosshard ，F.，Bucheli ，M.，Meur ，Y.和Egli ，T.（2010）。呼吸链是大肠杆菌中UVA失活期间细胞的致命弱点。微生物学156（Pt 7）：2006-2015。
Bridier ，A.，Briandet ，R.，Thomas，V。和Dubois- Brissonnet ，F。（2011）。细菌生物膜对消毒剂的抗性：综述。生物污染27（9）：1017-1032。
Ciofu ，O.和Tolker -Nielsen，T.（2019）。宽容和铜绿假单胞菌生物膜的抵抗抗菌药物，如何铜绿假单胞菌能躲过抗生素。前沿微生物学10：913。
Costerton ，JW，Lewandowski，Z.，Caldwell，DE，Korber ，DR和Lappin-Scott，HM（1995）。微生物生物膜。Annu 启微生物学49：711-745。
Dalrymple，OK，Stefanakos ，E.，Trotz ，MA和Goswami，DY（2010）。光催化消毒的机理和模型综述。应用催化B环境98（1）：27-38。
二博纳，G.，Stepanovi Ç ，S.，Picciani ，C.，Pompilio ，A。和皮科洛米尼，R。（2007）。环境因素对临床嗜麦芽窄食单胞菌分离株生物膜形成的影响。 Folia Microbiol（Praha）52（1）：86-90。
Gamage McEvoy，J.和Zhang，Z.（2010年）。光催化消毒的应用。Int J Photoenergy 2010：764870。
Gambino，M.和Cappitelli ，F.（2016年）。小型回顾：生物膜对氧化应激的反应。生物污染32（2）：167-178。
Gibson，H.，Taylor，JH，Hall，KE和Holah ，JT（1999）。食品工业中用于清除细菌生物膜的清洁技术的有效性。Ĵ 申请微生物学87（1）：41-48。
Gnanadhas ，DP，Elango ，M.，Janardhanraj ，S.，Srinandan ，CS，Datey ，A.，Strugnell ，RA，Gopalan，J.和Chakravortty ，D.（2015）。使用冲击波结合抗生素疗法成功治疗生物膜感染。科学代表5（1）：17440。
Hall，CW和Mah ，TF（2017）。基于生物膜的抗生素耐药性和致病细菌耐受性的分子机制。FEMS 微生物修订版41（3）：276-301。
Katsikogianni ，M.和Missirlis ，YF（2004）。对细菌粘附到生物材料上的机制以及估算细菌与材料之间相互作用的技术的简要回顾。Eur Cell Mater 8：37-57。
Mah ，TF，Pitts，B.，Pellock，B.，Walker，GC，Stewart，PS和O'Toole，GA（2003）。铜绿假单胞菌生物膜抗生素抗性的遗传基础。自然426（6964）：306-310。
Mah ，TF和O'Toole，GA（2001）。生物膜对抗菌剂的抗性机制。趋势微生物9（1）：34-39。
Merritt，JH，Kadouri ，DE和O'Toole，GA（2005年）。生长和分析静态生物膜。Curr Protoc Microbiol 第1章：单元1B 1。
马尔卡希（Mulcahy），LR，伊莎贝拉（Isabella），VM和路易斯（Lewis），K。（2014）。铜绿假单胞菌生物膜在疾病中。微生物Ecol 68（1）：1-12。
镍，JC，赖特，JB，Ruseska ，I.，Marrie ，TJ，惠特菲尔德，C。和Costerton ，JW（1985）。的抗生素抗性绿脓杆菌定植导尿管体外。Eur J临床微生物学4（2）：213-218。
O'Toole，G.，Kaplan，HB和Kolter，R。（2000）。生物膜形成随着微生物的发展。Annu Rev Microbiol 54：49-79。
Pezzoni，M.，Catalano，PN，Delgado，DC，Pizarro，RA，Bellino，MG和Costa，CS（2020）。介孔二氧化钛涂层对铜绿假单胞菌生物膜的抗生物膜作用。 J Photochem Photobiol B 203：111762。
Pezzoni，M.，Catalano，PN，Pizarro，RA，Desimone，MF，Soler-Illia，G.，Bellino，MG和Costa，CS（2017）。超分子模板介孔二氧化硅涂层的抗生物膜作用。Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 77：1044-1049。
Pezzoni，M.，Pizarro，RA和Costa，CS（2014）。铜绿假单胞菌生物膜中细胞外过氧化氢酶（KatA）对UVA辐射的保护作用。 J Photochem Photobiol B 生物学131：53-64。
M.Pezzoni，RA，Pizarro和CS，Costa（2018）。暴露于低剂量的UVA会增加铜绿假单胞菌中生物膜的形成。生物污染34（6）：673-684。
Rajasekar，A.，Anandkumar ，B.，Maruthamuthu ，S.，Ting，YP和Rahman，PK（2010）。从石油产品运输管道中分离出来的腐蚀性细菌财团的特性。Appl Microbiol Biotechnol 85（4）：1175-1188。
DM Ramsey和DJ Wozniak（2005）。了解铜绿假单胞菌藻酸盐合成的控制和囊性纤维化慢性感染的管理前景。摩尔微生物学56（2）：309-322。
Rasband ，WS （1997）。ImageJ的。美国NationalInstitutesofHealth ，贝塞斯达，马里兰州，A 。
Smith，K。和Hunter，IS（2008）。普通医院杀菌剂对具有多重耐药性临床分离株生物膜的功效。微生物医学杂志57（Pt 8）：966-973。
Tsvetanova ，Z.（2020年）。在不同流速和变化的氯化状态下，饮用水相关生物膜细菌群落的定量分析。水科学10：3。
韦尔奇，K.，蔡，Y。和海峡ø MME ，M。（2012）。一种定量测定生物膜生存力的方法。J Funct Biomater 3（2）：418-431。
医学博士Willcox，北卡罗来纳州哈米斯，科威尔，T 。威廉姆斯和霍尔顿。（2001）。与隐形眼镜的细菌相互作用；镜片材料，镜片磨损和微生物生理学的影响。生物材料22（24）：3235-3247。
Wu，H.，Moser，C.，Wang，HZ，Hoiby ，N. and Song，ZJ（2015）。对抗细菌生物膜感染的策略。国际口腔科学杂志7（1）：1-7。