材料和试剂

1. 35mm玻璃底细胞培养皿（Ibidi GmbH，产品编号：81158）
2. 微量离心管：1.5 ml（Axygen Corning®，产品目录号：MCT-150-C）
3. 6孔板（Nunc®，目录号：140675）
4. 100 mm碟形（VWR®，目录号：172931）
5. SKBr3乳腺癌细胞（ATCC®HTB-30）
6. 肝细胞生长因子
7. DMEM Dulbecco改良的Eagle介质（Gibco®，目录号：11966025）
8. 鼠尾胶原蛋白I（Roche®，目录号：11179179001）
9. 胎牛血清（FBS）（Gibco®，目录号：26140079）
10. 绿色荧光蛋白（GFP）-Rab4质粒【由Robert Lodge提供，克隆如Zaoui等人所述。（2019a年a）]
11. 细胞系核受体试剂盒V（Lonza®，目录号：VCA-1003）
12. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Wisent公司，目录号：311-012-LL）
13. 胰蛋白酶EDTA（Gibco®，目录号：25200056）

设备

1. 细胞培养箱Steri循环二氧化碳（Thermo Fisher Scientific®，目录号：51030303）
2. 离心机（Eppendorf®，目录号：5424/5424R）
3. 核受体2b装置（Lonza®，目录号：AAB-1001）
4. 蔡司200电动显微镜公司
5. 在37°C温度下，在空气中含有5%（v/v）二氧化碳的舞台顶室（Climabox，Carl Zeiss，Inc.）。
6. 目标100x计划无染色质Na1.4物镜
7. 血细胞仪（Sigma-Aldrich®，目录号：Z359629-1EA）

软件

1AxioVision软件（卡尔蔡司公司）1AxioVision软件（卡尔蔡司公司）
2. Imaris软件（Bitplane公司）
三。Microsoft Excel®三。Microsoft Excel®

程序

A、 I型胶原涂层
1. 在35 mm玻璃底细胞培养皿上涂上1 ml在PBS（25µg/ml）中稀释的鼠尾胶原I。
2. 将涂有1ml I型胶原的35 mm玻璃底细胞培养皿在37℃下孵育1h。
3. 用1ml预热PBS冲洗35 mm玻璃底细胞培养皿两次，并从PBS缓冲液中吸取。
注意：胶原蛋白I必须保存在冰上以避免聚合，PBS必须保持在37 °C。

B、细胞转染与接种
1. 从培养箱中取出培养板，吸出培养基，用1ml预热PBS冲洗两次细胞。
2. 加入1ml胰蛋白酶EDTA分离SKBr3细胞（80-90%融合），37℃孵育5min。
三。当大多数细胞（>90%）分离时，用补充培养基（10%FBS）中和胰蛋白酶反应。三。当大多数细胞（>90%）分离时，用补充培养基（10%FBS）中和胰蛋白酶反应。
4. 用血细胞仪测定细胞密度。
5. 将（每个样品1 x 106个细胞）转移到微型离心管中。
6. 在室温下以200 x g离心10分钟。
7. 在室温下，在100μl核受体溶液V中轻轻地再悬浮细胞颗粒。溶液V配有核子受体试剂盒V。
8. 将100μl细胞悬液与3μg GFP-Rab4的DNA结合。
9. 将细胞/DNA悬浮液转移到配备有核子受精试剂盒V的认证试管中（样品必须覆盖试管底部，不得有气泡）。盖上反应杯盖。
10. 在nucleafector®2b设备上选择适当的nucleafector®程序X-005。
11. 将带有细胞/DNA悬浮液的比色杯插入Nucleofector®试管架，按X按钮应用所选程序。
12. 程序完成后，将反应杯从支架中取出。
13. 立即将500μl培养基（10%FBS）加入反应杯中。
14. 使用提供的移液管将样品（600µl最终体积）转移到程序A中制备的胶原I预涂35 mm玻璃底细胞培养皿中。
15. 每35 mm玻璃底细胞培养皿中加入2ml含10%FBS的补充培养基，并在37°C下培养24小时。
注意：避免在步骤中重复抽取样品B14。

C、细胞洗涤和刺激
1. 从培养箱中取出35 mm玻璃底细胞培养皿，吸出培养基，用1 ml预热PBS冲洗两次细胞。
2. 加入2ml预温培养基（10%血清）
3. 在0.5nm处加入HGF（或任何其他生长因子）20分钟以刺激细胞。为了评估HGF激活Met受体酪氨酸激酶的效果，需要一个非刺激条件作为阴性对照。
注：HGF必须保存在冰和PBS上，并在37 °C。

D、用于三维延时成像的显微镜装置（图1和视频1）
1. 显微镜设置
a、打开电动倒置显微镜Axiovert 200 M和连接的计算机。
b、选择合适的载物台和100x平面无染色质NA 1.4物镜。
c、打开温度单元和二氧化碳控制模块，将温度设置为37℃，湿度>80%，二氧化碳设置为5%。预热约2小时。
2. 三维活体细胞成像
a、打开AxioVision软件，选择多维采集模块。
b、将35毫米玻璃底细胞培养皿放在平板支架上。聚焦于选定的单元格。
c、设置采集单元持续时间为2min，捕获间隔为4s，Z段为10个，间距为0.5μm。
d、获取三维（X，Y，Z）单细胞图像并进行实时分析。
注：暴露时间参数在实验之间略有不同，取决于转染效率。根据电池的尺寸，可能需要额外的Z形截面。

图1。活细胞成像显微镜配置。使用配备有有机玻璃环境室、CO2富集模块和加热控制器的Axiovert 200 M电动倒置显微镜进行细胞追踪的完整设置示例。更多详情请参考麦吉尔大学高级生物成像设备。

视频1。用延时视频显微镜观察GFP-Rab4蛋白。0.5nm HGF刺激表达GFP-Rab4的SKBr3细胞电影。

数据分析

在下一节中，我们将演示如何使用Imaris®软件的斑点跟踪算法分析三维Rab4阳性囊泡的迁移率。

A、可视化和分割（图2）
1. 将测量数据传输到Imaris®软件，并使用“超越模式”创建数据集选择的体积重建。
2. 点击“编辑”，打开“显示调整”窗口，选择通道1作为源通道（绿色代表GFP），并调整最小值和最大值。
3. 点击左边的标签“Spot Object”按钮，一个新的对象Spot现在被添加到Object列表中。

图2。活体细胞成像对Rab4-GFP运动的三维分析。 A、使用Imaris®软件的斑点跟踪算法对Rab4-GFP囊泡进行定点分配的代表性图像。转染GFP-Rab4的SKBr3细胞并用0.5nm的HGF处理或不处理（CTL）20分钟的堆叠图像。插图显示从细胞皮质扩大。B-E.用hgf0.5nm刺激20min后，随时间（2min）追踪单个Rab4阳性小泡。分析了Rab4阳性小泡向前缘（B）、向中心（C）的定向运动百分率和Rab4阳性小泡的速度（D）。E）每5分钟追踪细胞420分钟，追踪90个细胞，观察CTL和HGF处理的细胞。比例尺=10μm。图表数据代表至少三个独立实验的平均值±SEM。统计显著性采用双尾学生测验进行评估。***P<0.001。表达GFP-Rab4的SKBr3细胞用0.5nm的HGF刺激20分钟的代表性影片（视频1）。t

B、跟踪算法
1. 在“创建属性”中选择“跟踪点（随时间）”。单击“下一步”。
2. 选择通道1作为震源通道（绿色代表GFP）；将“估计直径”设置为0.5µm。添加“背景减法”选项。单击“下一步”。
注意：Imaris®软件会自动检测斑点—您可以接受自动值，也可以选择手动选项来更改它们。

C、（可选）选择手动选项
1. 点击“手动”选项，通过修改绿色荧光的低阈值和高阈值来选择检测点的子集。将较低的阈值设置为10，并单击播放按钮验证斑点检测。单击“下一步”。
2. 在此步骤中添加或删除斑点（如果需要）。单击“下一步”。
3. 选择“布朗运动”算法。将“最大距离”设置为10µm，将“最大间隙大小”设置为3µm。单击“下一步”。
注：该“”布朗运动该算法适用于跟踪没有可识别的模式和频繁的方向变化的随机运动。在这里，这个算法被用来跟踪Rab4-GFP小泡，因为在没有HGF的情况下，Rab4-GFP小泡以随机的方式缓慢移动，没有任何方向的持久性。然而，Imaris®软件提供了“自回归选项”，该算法在位移过程中可容忍高速率的方向变化，并可用于跟踪连续运动的物体。
4. 通过在“过滤器类型菜单”中选择“轨迹速度平均值”对结果轨迹进行排序和过滤。单击“完成”。
5. 将数据导出到Microsoft Excel®软件进行进一步分析。跟踪测量值存储在“Tab Statistics”下的“Detailed Tab”中。
6. 根据需要总结30个细胞中至少500个囊泡的囊泡速度（平均值±扫描电镜），并根据需要进行统计分析（如未配对试验）。即。， t
7. 使用首选图形（如条形图）绘制汇总信息。
注意：在“特定值选项卡”下，窗口顶部的第二个下拉列表显示可用的特定统计值。选择变量，将显示值列表。与对象（速度）相关的统计变量在每个时间点都有值。因此，对于这些变量每个时间点显示“平均值”。时间点、统计变量值和图像的变化也随之改变。

致谢

这项工作是作为Zaoui et al。（2019a），由Susan G.Komen为K.Zaoui的治愈博士后奖学金（KG111467）提供支持。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

工具书类

1. Grant，B.D.和Donaldson，J.G.（2009年）。内吞循环的途径和机制。分子细胞生物学10（9）：597-608。
2. McCaffrey，M.W.，Bielli，A.，Cantalupo，G.，Mora，S.，Roberti，V.，Santillo，M.，Drummond，F.和Bucci，C.（2001年）。Rab4同时影响回收和降解内质体的运输。FEBS Lett 495（1-2）：21-30。
3. Mellman，I.和Yarden，Y.（2013年）。内吞作用与癌症。冷泉哈勃透视生物5（12）：a016949。
4. Parachoniak，C.A.，Luo，Y.，Abella，J.V.，Keen，J.H.和Park，M.（2011年）。GGA3是促进Met受体循环的开关，是维持ERK和细胞迁移的关键。开发单元20（6）：751-763。
5. Parachoniak，C.A.和Park，M.（2012年）。致瘤性受体转运动力学。细胞生物学趋势22（5）：231-240。
6. Stenmark，H.（2009年）。Rab-GTPases作为囊泡交通的协调者。分子细胞生物学10（8）：513-525。
7. van der Sluijs，P.，Hull，M.，Webster，P.，Male，P.，Goud，B.和Mellman，I.（1992年）。小的GTP结合蛋白rab4控制着内吞途径上的早期分选事件。电话70（5）：729-740。
8. Wandinger Ness，A.和Zerial，M.（2014年）。Rab蛋白与内体系统的区域化。冷泉哈勃透视生物6（11）：a022616。
9. Zaoui，K.，Duhamel，S.，Parachoniak，C.A.和Park，M.（2019a年）。CLIP-170空间调控受体酪氨酸激酶循环以协调细胞迁移。交通20（3）：187-201。
10. Zaoui，K.，Rajadurai，C.V.，Duhamel，S.和Park，M.（2019b年）。Arf6调节RhoB亚细胞定位以控制癌细胞侵袭。细胞生物学杂志218（11）：3812-3826。