材料和试剂

1. 100μl，10μl移液管头（Eppendorf，目录号：0030.073.428，0030 073.363）
2. 1.5 ml反应管（Greiner Bio One，产品编号：616201）
3. Nanosep离心装置，带欧米茄膜3K，灰色（PALL，目录号：OD003C34）
4. 聚丙烯瓶（安捷伦，目录号：5190-3155）
5. 弹簧帽（安捷伦，目录号：5042-6491）
6. 丁腈手套（顶部，目录号：15731）
7. 2ml压接/扣盖小瓶和瓶盖（安捷伦，目录号：5182-9697）
8. 熔融石英毛细管（Polymicro Technologies，目录号：TSP050375）
9. COSMO（+）毛细管（NACALAI TESQUE，目录号：07584-44）
10. L-蛋氨酸砜，99+%（赛默飞世尔科学公司，目录号：A17027）
11. 3-氨基吡咯烷盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：404624）
12. 2-（N-吗啉基）乙磺酸（MES）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：341-01622）
13. D-樟脑-10-磺酸钠盐（CSA）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：037-01032）
14. 1,3,5-苯三甲酸（Trimesate）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：206-03641）
15. 亚精胺（Merk/Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
16. 精胺（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：194-09813）
17. N1乙酰精胺（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：014-20421）
18. N1乙酰亚精胺（Sigma-Aldrich日本，01467）
19. N8乙酰亚精胺（Fluka，目录号：A3658）
20. DL-a-氨基-n-丁酸（2AB）（西格玛·奥尔德里奇，目录号：A1754）
21. 甲醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：134-14523）
22. 醋酸铵（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：019-02835）
23. 六（2,2-二氟乙氧基）磷腈（Synquest Laboratories，目录号：8H79-3-02）
24. 甲酸甲酸（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：063-05895）
25. 甲酸铵（Kanto Kagaku，目录号：01294-00）
26. 乙酸（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：012-00245）
27. Milli-Q水（默克，日本东京，Milli-Q IQ 7000 ICP-MS）
28. 内标混合物（见配方）
29. 鞘液（见配方）
30. 运行缓冲区（见配方）
31. 标准混合物（见配方）

设备

1. 5 ml量瓶（IWAKI，目录号：5640FK5S）
2. 实验室瓶100毫升（SCHOTT/DURAN，目录号：017200-100A）
3. 100μl和10μl移液管（Eppendorf，目录号：3121 000.074、3121 000.015）
4. 离心机（TOMY，型号：MX-307）
5. Roter（TOMY，型号：AR015-24）
6. 微混合器（TAITEC，型号：E-36）
7. CE系统（安捷伦科技，型号：7100）
8. LC/MSD TOF系统（安捷伦，目录号：G1969A）
9. 等比例高效液相色谱泵（安捷伦，型号：1260系列）
10. CEMS适配器套件（安捷伦，目录号：G1603A）
11. CE-ESI-MS喷雾器套件（安捷伦，目录号：G1607A）
12. 循环式手冷器（THOMAS，目录号：2241059）

软件

1. 安捷伦化学工作站软件用于CE，ver。B、 02.01.SR1（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉市，美国）
2. 安捷伦Mashunter软件，版本。B、 02.01.SR1（安捷伦），用于TOF-MS数据分析
3. R、版本。3.4.3（R统计计算基金会，奥地利维也纳）
4. 吉咪，弗。13.2.0（SAS Institute Inc.，美国北卡罗来纳州卡里）
5. 韦卡，弗。3.6.13（怀卡托大学，汉密尔顿，新西兰）
6. GraphPad Prism，7.03版（GraphPad软件公司，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）
7. MasterHands，2.17.3.18版（日本筑冈庆应大学）

程序

在室温下制备所有溶液和混合物。所有样品处理均使用丁腈手套。不需要厌氧条件。

A、唾液收集
1. 既往无恶性肿瘤病史的原发性疾病患者。
2. 先前未接受任何化疗、放疗、手术或替代治疗的受试者。
3. 在前一天晚上9:00以后，唾液提供者除了喝水外，不允许进食任何食物。
4. 所有样本采集时间为上午8:00至11:00。
5. 要求受试者在唾液收集当天不使用牙膏刷牙，并且在收集唾液前1小时不得喝水、吸烟、刷牙和剧烈运动。
6. 他们被要求在收集唾液之前用水漱口。
7. 在50cc聚丙烯管中收集约400μl未刺激唾液（见注1）。
8. 用直径1.1cm的聚丙烯吸管辅助唾液收集。
9. 采集后，唾液样本立即保存在-80。摄氏度

B、唾液样本的处理。
唾液处理的概述如图1所示。

图1。唾液处理方案
1. 冷冻唾液样本在4℃下解冻。
2. 用移液管将100μl唾液样品移到1.5-ml的管中，该管带有5-kDa截止过滤器。
3. 试管在9100×g下在4°C下离心3小时，以消除大分子。
4. 如果滤液不少于45μl（图2），其余的原始唾液样本应单独处理（步骤B2和B3），并合并滤液。

图2。带过滤器的管子。滤液为45μl。

5. 用移液管将45μl滤液移到1.5 ml的微管中。
6. 使用移液管将含有内标混合物（配方1）的5μl水添加到试管中，使用涡流混合30 s，并在4550×g下在4°C下离心1分钟，以充分混合。
7. 将7μl混合物转移到一个小瓶中，并在小瓶上盖上一个扣盖。

C、阳离子测量设置
1. 总工程师
a、毛细管：熔融石英，内径50μm×100 cm
b、缓冲液：1M甲酸
c、电压：正，30 kV
d、温度：20°C
e、喷射：压力喷射50 mbar，5 s（约5 nl）
2. TOFMS公司
a、离子源：电喷雾电离（ESI）
b、极性：正极
c、毛细管电压：4000V
d、破碎器：75 V
e、撇渣器：50 V
f、 OCT射频：500 V
g、干燥气体：氮气，10 L/min
h、干燥气体温度。：300摄氏度
i、喷雾器气压。：7磅/平方英寸
j、鞘液：阳离子鞘液（配方2）
k、流速：10μl/min
l、锁固质量：2MeoH13同位素m/z 66.063061和六（2,2-二氟乙氧基）磷腈m/z 622.028963

D、负离子测量设置
1. 总工程师
a、毛细管：COSMO（+），内径50μm×105 cm
b、缓冲液：50 mM醋酸铵，pH 8.5
c、电压：负极，30 kV
d、温度：20°C
e、喷射：压力喷射50 mbar，30 s（约30 nl）
f、预处理：在50 mM醋酸铵下2 min，pH 3.4，在运行缓冲液中5 min
2. TOFMS公司
a、离子源：ESI
b、极性：负极
c、毛细管电压：3500 V
d、破碎机：100 V
e、撇渣器：50 V
f、 OCT射频：200伏
g、干燥气体：氮气，10 L/min
h、干燥气体温度。：300摄氏度
i、喷雾器气压。：7磅/平方英寸
j、鞘液：阴离子鞘液（见配方）
k、流速：10μl/min
l、锁固质量：2CH3COOH13C同位素m/z 120.038339，六（2,2-二氟乙氧基）磷腈+CH3COOH m/z 680.035541
m、 ESI针：铂金
3. 测量
a、样品预处理
i、标准混合物的阳离子：在阳离子缓冲液中4分钟（见配方）。
二。样品的阳离子：甲酸铵溶液中5分钟，Milli-Q溶液中5分钟，阴离子流动缓冲液中5分钟（配方3）。
iii.标准混合物和样品的阴离子：在50 mM乙酸铵（pH 3.4）下2 min，在阳离子流动缓冲液（配方3）下5 min。
b、测量三个样品和一个标准混合物以获得质量。
c、评估总离子电泳（TIE）的稳定性（图3和图4）。如果扎带不稳定，调整ESI喷洒器，直到扎带强度稳定。

图3。阳离子测量稳定关系的一个例子。 X轴表示迁移时间。Y轴表示TIE的强度，即观测数据中m/z范围内强度的总和。在成功的条件下，这条线变平了，除了一些部分。由于无机阳离子如Na+和K+的存在，在左侧观察到两个显著的TIE滴。观察到中性分子存在的两个大峰。其他小的变化可以忽略不计，而另一部分的平坦表明了调节的稳定性。

图4。阳离子测量不稳定的一个例子。与图3中的连接线相比，这里的线是波动的，这表明调节不成功。在大多数情况下，ESI喷雾器的调节不合适，电流波动较大，从而引起这种波动。

d、在测量过程中评估电流的稳定性（图5和图6）。稀释最终溶液，如果领带不稳定，再次测量样品。

图5。电流稳定测量的一个例子。 X轴表示迁移时间。Y轴表示测量过程中的电流。在成功测量的情况下，除开始测量外，该线变平。

图6。阳离子测量中不稳定电流的一个例子。 X轴表示迁移时间。Y轴表示测量过程中的电流。这个例子显示了许多尖峰。当毛细血管的状况变得异常时，线就不会保持平坦。

e、测量唾液样本。

数据分析

数据分析包括数据处理和统计分析（图7）。数据处理包括每个原始数据的数据转换和峰值积分。对工艺数据进行校准，并在填充缺失峰后生成数据矩阵（Sugimoto等人，2012年）。该矩阵用于后续数据分析，即统计分析。

图7。数据处理和数据分析概述

1. 对于每个示例，MassHunter都会生成一个数据文件夹（.d扩展名），MassHunter是一个供应商为CE-MS控件提供的软件。准备标准混合物、质量控制和唾液样本的数据文件夹。
2. 使用MasterHands的数据转换功能将每个数据文件夹转换为另一个格式文件（.kiff扩展名）（Sugimoto等人，2012）
3. 随后的数据处理将使用MasterHands进行
4. 使用所有数据文件的默认选项检测并整合峰值；对于峰值检测，信号/噪声（S/N）无线电>2.0，对于峰值分离，两个峰值之间深度的50%（见注2）。
5. 运行校准功能以校正和匹配所有样本的峰值，并使用默认选项进行。如果对齐函数不稳定（图8），则使用不同的间隙惩罚选项重新运行校准（Sugimoto等人，2010b）。

图8。对齐函数的示例。稳定（左）和不稳定（右）病例。
6. 评估内部标准的重叠峰。如果没有观察到重叠的峰值，请使用不同的选项重新运行对齐（图9）。

图9。叠加峰值的示例。成功（左）和不成功（右）结果。

7. 运行重新组合函数，根据对齐的峰值矩阵填充缺失的峰值。
8. 将小于定量下限的峰面积换成0。
9. 将产生所有峰的峰面积，并将这些峰面积除以内标物（甲硫氨酸砜用于阳离子，CSA用于阴离子）。
10. 根据校正的迁移时间和标准混合物与样品之间的m/z值，将代谢物命名。
11. 将峰值矩阵导出为CSV文件。
12. 计算唾液代谢物浓度的绝对浓度。

式中，M，IS，STD，PA，V分别表示代谢物、内标物、标准品、峰面积和体积。

统计分析
1. 使用JMP进行主成分分析（PCA），以可视化唾液样本中代谢物浓度模式的总体相似性和差异性（见注3）。
2. 使用R进行Mann-Whitney试验，以了解两组之间代谢物浓度的差异。的R函数威尔科克斯检验（）使用正确的=F选项（见注4）。
3. 使用错误发现率（Benjamini和Hochberg方法）使用R校正P值，考虑多个独立测试。使用带有method=“fdr”选项的R vector的adjust（）方法。
4. 仅选择显示胰腺病人（PC）和非PC组（慢性胰腺炎健康对照组）平均浓度校正P<0.05和折迭变化（F.C.）>4.0的代谢物。
5. 使用JMP为MLR选择最小代谢物集。消除了前向和后向选择的组合（P<0.05）。在JMP上选择[analysis]-[fit model menu]，并为个性设置逐步选项。停止规则选择“P值阈值”，方向选择“混合”。输入0.05作为阈值并按下“Go”按钮。
6. 建立多元logistic回归（MLR）模型来区分患者和非PC患者，并计算受试者操作特征曲线（AUC）下的面积。按“运行模型”按钮。
7. 用Weka评价MLR模型的泛化能力。运行k-fold交叉验证（CVs）来评估所开发的MLR的泛化能力。用200个随机值重复CV测试，k=5、10和20（总共600个测试）。跑weka.classifiers.函数.weka包的逻辑等级为–x k（k替换为数值）。
8. 修正AUC值以计算其平均值和95%机密区间。使用GraphPad选择[Analyze Data]-[ROC Curve]菜单。

笔记

1. 聚丙烯的使用应事先进行评估。利用所提出的方案，我们证实洗脱化合物对唾液代谢物的定量质量没有影响。但是，此确认仅限于我们的标准库。比较了各种储存条件和溶剂（Tomita等人，2018年）。基于观察到的这些数据波动，我们计算产生了唾液代谢物量化水平上的噪声，并评估了唾液生物标记物（Asai等人，2018）对其辨别能力的影响。根据这些数据，应确定操作程序的标准化。
2. 在分析唾液样本之前，应使用标准混合物确定每种代谢物的校准范围。在我们的方案中，我们确认了我们标准库中的代谢物在峰面积和浓度之间表现出高度的线性关系，高达1mm。根据这些数据，确定了定量上限500mm，并预先计算了相应的峰面积。显示大于该阈值的峰面积被视为饱和峰。S/N<1.5的峰被认为是定量下限。
3. 对于PCA分析，只应使用经常观察到的代谢物数据。我们使用每组检测到至少50%的代谢物（Asai等人，2018年），而该阈值取决于样本数量和代谢物数量。
4. 多组的比较取决于研究设计。检测胰腺癌的唾液生物标志物发现研究包括对照组（C）、胰腺癌（PC）和慢性胰腺炎（CP）（Asai等人，2018年）。通常采用三组比较法。在这里，我们的目的是找到高浓度的代谢物只在PC组。因此，我们将C组和CP组作为一组，并使用Mann-Whitney检验比较PC组和（C+CP）组。

食谱

1. 内标混合物
2毫米蛋氨酸砜
2毫米MES
2毫米CSA
2毫米3-氨基吡咯烷
2毫米Trimesate
2. 护套液
阳离子：甲醇/水（50%v/v），含有0.1 M六烷基（2,2-二氟甲氧基）磷腈μ
阴离子：乙酸铵（5 mmol/L）溶于含有0.1μM六（2,2-二氟甲氧基）磷腈的50%甲醇/水（50%v/v）中
3. 运行缓冲区
阳离子：1 M甲酸
阴离子：50 mM醋酸铵（pH 3.4和pH 8.5）
4. 标准混合物
阳离子：内标200μM，每种代谢物20μM
阴离子：内标200μM，每种代谢物50μM

致谢

这项研究得到了日本株式会社和日本株式会社开放式研究所的资助。

相互竞争的利益

没有相互竞争的利益要宣布。

伦理学

这项研究得到了东京医科大学伦理委员会的批准（批准号：1560，2010年9月30日）。从所有患者和同意作为唾液捐赠者的志愿者处获得书面知情同意书。我们的研究是在赫尔辛基宣言之后进行的。

工具书类

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