材料和试剂

用料

1 耐高压加热的ë rlenmeyer瓶（体积：250米升）（Dutscher ，目录号：211907）
2 耐高压加热的玻璃管（体积：20米升）（Dutscher ，目录号：045209）
3 测帽测试盖（Dutscher ，目录号：110685B）
4 离心管（容积：50 ml ）（Fisher Scientific，目录号：07-000-983）
5 巴斯德移液器
6 低温栅格盒（电子显微镜科学，目录号：71166-10-W）
7 冷冻袋（450毫升，VWR，目录号：82007-706）
8 莱西碳纤维300目铜网格（Ted Pella，目录号：01883）
9 聚醚砜（PES）膜注射过滤器（0.22微米和0.45微米）（Fisher Scientific公司，产品目录号：SLGPR33RS; SLHPR33RS）
10 聚丙烯微量离心管（体积：1.5米升）（Fisher Scientific公司，目录号：07-000-244）
11 锅铲（Dutscher ，目录号442209）
12 分光光度计的比色皿（体积：1.6米升）（Dutscher ，目录号：613101）
13 无菌一次性塑料注射器（容量：50 ml）（Fisher Scientific，目录号：13-689-8）
14 90 x 13毫米无菌培养皿（Dutscher ，目录号：076084B）
15 5级Whatmann滤纸（Dutscher ，目录号：1005055）

试剂种类

1 琼脂（Thermo Fisher Scientific，Fisher Chemical TM ，目录号10548030）
2 二水合氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher BioReagents ，目录号：10306313）
3 乙烷（液化空气）
4 盐酸，33.33％（w / v）水溶液（Thermo Fisher Scientific，ULTREX，JT Baker TM ，目录号：10782232）
5 液氮（低温分布）
6 七水合硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher BioReagents ，目录号：10553335）
7 甘露醇（Thermo Fisher Scientific，ACROS Organics TM ，目录号：10266523）
8 蛋白ept（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM Bacto TM蛋白ept，目录号：16299741）
9 氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Technical，目录号：10498220）
10 Tris-HCl pH为7.5（赛默飞世尔科技，默克化学TM ，目录号：15153685）
11 酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM Difco TM Bacto TM ，目录号：11763553）
12 10x噬菌体缓冲液（请参阅食谱）
13 CaCl 2 ·2H 2 O和MgSO 4 ·7H 2 O 100x储备溶液（请参阅配方）
14 YPM肉汤培养基（请参见食谱）
15 YPM Φ固体（“底部”）培养基（见配方）
16 YPM Φ软琼脂（见配方）

细菌菌株和病原学样本

1 新鲜碎葡萄（请参阅步骤）
2 cerucus cerinus cerbous cernous cerinus cernous cerinus cernous cerinus CRBO11179（法国生物资源科学研究院，ISVV，法国维拉纳夫-德奥农）

设备

1 高压釜
2 配备CCD照相机的低温电子显微镜（Thermo F isher FEI，型号：Tecnai F20 200 kV）（Thermo F isher FEI，型号：Eagle 4kx4k）
3 低温容器和低温转移站（加坦，型号：626）
4 辉光放电装置（Cordouan Technologies，型号：ELMO）
5 保温箱设置为25°C
6 高速冷冻离心机（日立，型号：CR 22N）和R15A-0688转子
7 微波（Thermo Fisher Scientific，Manutan TM MW20G，目录号：15540739）
8 轨道振动器（Stuart，型号：SSL1）
9 pH计（Hanna，型号：pH211）
10 分光光度计（岛津制作所，型号：UV-1280）
11 玻璃化机器人（Leica Microsystem，型号：EM-GP 2）
12 水浴（colume ：4 L）（基准科学，MyBath模型）

软件

1 ImageJ（NIH）
2 Tecnai版本4.3（Thermo F isher FEI）
3 TEM成像与分析4.4版（赛˚F isher FEI）

程序

A 收集葡萄并回收果汁
1 从选定的葡萄园/酿酒厂将新鲜的葡萄收集到冷冻袋中（约200 xg）。
2 在运输过程中应将其储存在4°C，并尽快处理样品。
3 手动粉碎葡萄并离心样品（5,000 xg ，10分钟）。
4 收集上级（果汁）。
5 在无菌条件下依次用0.45 µm和0.22 µm PES膜过滤器过滤果汁。
6 将过滤后的果汁储存在4°C的冰箱中。

B 分离病毒斑块，纯化和生产一级原种（原种I）
1 葡萄糖酸蜡状文化准备
a 制备无菌250米升ë与15米rlenmeyer烧瓶升YPM肉汤。
b 接种用10μ升一个的准备使用的冷冻在细菌菌株甘油小号滴答孵育过夜，在25°振荡（200rpm）下进行。
c 第二天早晨，回稀释培养1/1015米升新鲜YPM的Φ肉汤并孵育在25℃下在振荡培养箱中直至OD 600nm处获得0.2（4〜5小时）。
2 底部顶部YPM的制备Φ板
a 熔融仔细底部顶部YPM Φ通过在加热琼脂烤箱微波。
b 在水浴中冷却至55 °C。
c 倾注平板，使用〜20 m升熔化介质（准备3块板每汁样品分析）
d 让琼脂基培养基在室温下固化1小时。
3 双琼脂覆盖试验
a 对于每个样品汁来分析，熔液3 YPM Φ软琼脂管在沸水浴中。
b 使用前，将试管保持在55°C的水浴中。
c 刚好在使用之前，采取过滤果汁出从4 ℃的冰箱（步骤A6），并准备连续稀释在缓冲液噬菌体1×（10 -1 ，10 -2 ）。
d 删除YPM Φ从水浴软琼脂管，并将其放置在支架上，在室温下（RT）1-2分钟。
e 加入200 μ升细菌培养物在OD 600nm处0.2（步骤B1）和100 μ升未稀释滤汁在YPM Φ软琼脂管。
f 涡旋3次，并均匀地散布在固体YPM的顶部Φ板。
g 重复步骤B3D-F与每个稀释（10 -1 ，10 -2 ）的果汁样品的（步骤乙使用两个剩余3C）YPM Φ琼脂平板上。
h 将板在25°C下孵育24小时。
4 斑块的隔离
a 选择带有单个噬菌斑的板。
b 视觉上识别斑块在YPM不同形态（大，小，清晰，混浊）Φ板（如果相关）。
c 用记号笔在板的底部每个选定的噬菌斑周围画一个圆圈。
d 冲床各斑块出使用无菌巴斯德吸管与抽吸灯泡。
e 将每个回收含单个噬菌斑到含有500微管琼脂塞μ升YPM的Φ肉汤。
f 轻轻涡旋
g 在室温下，使噬菌体在肉汤培养基中扩散20分钟。
h 用永久性标记在该微管上书写R1（第一轮纯化）。
i 储存于4 ℃或立即进行小号TEP B5 。
5 再进行两轮纯化
a 将R1样品在微管中的噬菌体缓冲液1x（10 -1至10 -4 ）中稀释
b 对4个稀释样品进行双层琼脂平板接种（每个稀释样品重复S teps B1至B3）。
c 孵育24小时后，观察并选择包含单个噬菌斑的板。
d 冲一个单个噬菌斑到含有500μ的微管升YPM的Φ 。
e 用永久性标记在微管上写R2（第二轮纯化）
f 在同一敏感细菌菌株上重复第三轮也是最后一轮噬菌体感染，以确保纯度。所有步骤都必须在无菌条件下进行。
g 500 µl R3样品是您的主要纯噬菌体原种（原种I）。储存在4℃。

C 使用融合板裂解液方法制备二级噬菌体原液（原液II）
该步骤对于获得适当体积的噬菌体裂解物是必需的。

1 双琼脂覆盖试验
a 制备15微米升的培养G.蜡状CRBO 11179培养物（OD 600nm的在YPM 0.2）Φ肉汤（见步骤B1）。
b 填3个无菌1.5米升微管与900微升1个的X无菌噬菌体缓冲液，并用稀释的数字（10标注管-1 〜10 -3 ）。
c 在10 -1试管中加入100 µl储备液I并进行系列稀释。
d 制备24个YPM Φ琼脂平板上。
e 熔体24 YPM Φ在55软琼脂管，并放置在一水浴℃下。
f 除去8 YPM Φ从水浴软琼脂试管并将其放置在支架上，在室温下（RT）1-2分钟。
g 在每个试管中，将100 µl的十倍噬菌体原液I与200 µl的敏感细菌混合，如S teps B1至B3所示。
h 倾上的YPM每个管Φ琼脂平板。
i 重复小号TEPS C1F到C1H与8个额外的软琼脂管和YPM Φ琼脂板上，并使用100μ升的股票我稀释至10 -2 。
j 重复小号TEPS C1F到C1H与剩余的8支软琼脂管和YPM Φ琼脂板上，并使用100μ升的股票我稀释至10 -3 。
k 在25°C下将24个板孵育24小时。
2 回收存货II
a 对于涂布在YPM每个稀释Φ板（10 -1 ，10 -2 ，10 -3 ），观察噬斑的密度。
b 选择最高的稀释度以进行融合裂解（见图1 ）。仅处理与该稀释液相对应的8个板。

图1 。Ilustration一个融合的裂解

c 在无菌条件下，添加1米升的无菌YPM Φ肉汤每个所选琼脂平板8双层的表面上。
d 在室温下孵育20分钟。或者，在此步骤中，板可以在4 °C下保存过夜。
e 用无菌刮刀小心地将每块板中的软琼脂和液体培养基收集在离心管中。
f 在15°C下以10,000 xg离心10分钟。
g 使用0.45 µm PES膜滤器过滤上清液（6-8 ml ）。
h 将储存液II储存在4°C下。

3 按以下方法确定原料II的效价（图2 ）
a 制备15微米升的培养G.蜡状CRBO 11179培养物（OD 600nm的在0.2）YPM Φ肉汤（参见B1）。
b 制备8个无菌1.5毫升微管含有900μ升1X无菌的噬菌体buffe和š erially稀股票II 10 -1至10 -8 。
c 采取YPM Φ琼脂平板和绘制的8-10位的网格在板底部。
d 除去5μm的升YPM Φ在55从水浴软琼脂管℃，并用0.2M接种升中制备的培养的步骤C 3a中。
e 短暂涡旋均化，倒在YPM Φ琼脂板，并让在室温琼脂固化（30分钟）。
f 在网格的可用空间中滴入10 µl稀释的每份储备液II （纯至10 -8 ）。盖上盖子，将培养皿放在工作台上，直到液滴被吸附（1小时）。
g 在25°C下孵育过夜。
h 确定稀释液的最佳范围，以每个空间计算2至20个噬菌斑。滴度（PFU /米升）可以通过下面的公式来计算：PFU /米升（二次库存的）=斑块X 1的1 /稀释因子x个/（0.01）。

FIGURE 2 。快速滴定噬菌体原液（II和III）

D 液相法制备高浓度GC1噬菌体悬浮液（原液III）
1 引入无菌15米升YPM Φ肉汤在无菌250米升ë rlenmeyer烧瓶中。
2 接种10 µl的G. cerinus CRBO11179冷冻培养物。
3 在25°C下于200 rpm的振荡培养箱中孵育过夜。
4 测量OD 600nm的培养物并在含有60米新烧瓶转移的体积升YPM Φ肉汤以获得OD 600nm处的0.1，对应于大约10 8 CFU /米升。
5 划分成三个独立的无菌250米升锥形烧瓶（20米升/烧瓶）（见图URE 3 ）。

图3 。噬菌体储备I，II和III的制备摘要

6 用噬菌体GC1感染两个烧瓶，其中200个细菌的感染复数（MOI）约为1个噬菌体。第三种培养物用作未感染的阴性对照。
7 允许噬菌体在RT下30分钟吸附到细菌细胞上，而不会产生斑点。
8 在200 rpm的振荡培养箱中于25°C孵育。
9 定期测量OD 600nm （在14-16小时后，被感染的检测物和对照物的平均值分别为1和2.5）。
注意：不要È XTEND孵育14-16以外H作为在最终的噬菌体效价的2数值的减少通常被观察到。

10 将裂解的培养物在10,000 xg下于15°C离心10分钟。
11 通过0.22过滤上清液微米PES过滤器。
12 如步骤C3所述，测量裂解物的效价。
注：〜10的滴度10 PFU /米升在实验室中常规获得。噬菌体滴度应超过10 7 PFU / ml ，才能在冷冻电镜下观察到。

13 将过滤后的上清液转移到50 ml的离心管（约38 ml ）中，并在4°C下以20,000 xg离心2 h （确保所有样品管均已装满以适当平衡离心机）。
14 小心除去上清液，然后风干沉淀。
15 在20至50 µl无菌噬菌体缓冲液1x中轻轻重悬噬菌体沉淀
16 储存在4℃。
注意：用于冷冻-EM观察的样品不应不透明，如果需要，可将噬菌体缓冲液稀释1倍。

E冷冻EM观察GC1噬菌体颗粒
我们使用以下标准协议。

1玻璃化：使用EM-GP设备冷冻制剂（该过程已总结在图4中）。
a 向加湿器中注入蒸馏水，并使用Whatman 5级更换吸墨纸。

b 设置腔室条件：温度为25°C，湿度为80％，乙烷温度为-184°C。

c 设置镊子条件：必须调整“吸墨设置”，以使滤纸在不拉动的情况下接触网格。必须调整“栅格印迹位置”以将栅格放置在纸张边缘上方1毫米处，并调整“栅格Tf位置”以将栅格完全浸入乙烷容器中。

d 调整冻结设置：取消选择旋转和传感器。选择“ A插入”以在印迹后自动插入网格。如下设置时间设置：延迟为0.0；以2.0 s吸干并保持0.0。

e 放置乙烷容器和栅格箱支架后，用液氮填充容器，直到100％。

f 在-120°C附近，在0.1 mBar的压力下冷凝乙烷。

g 辉光放电网格。将Lacey网格（碳朝上）放在一块覆盖有Parafilm的载玻片上。使用以下辉光放电条件：真空度为0.3 mBar ，强度为3 mA，计时器为40 s。

h 在网格的碳侧上涂抹4 µl的足够量的水，然后通过按“印迹/ A浸入”激活吸水和浸入冻结。在样品滴的另一侧进行印迹。

i 将栅格转移到低温栅格盒中。当所有冷冻的油脂都在格栅盒内时，拧紧盖子，将格栅盒转移至在液氮下预先冷却的，穿孔的50 ml Falco n管中。将格栅盒容器存放在带有液氮的杜瓦瓶中，直到观察。

图4 。玻璃化步骤的图形摘要

2 Cryo-EM观测：使用配备CCD摄像机（Eagle 4kx4k，Thermo F垫圈FEI），运行在200 kV的Tecnai F20（Thermo F垫圈FEI）进行采集。
a 抽气GATAN 655低温保持器，直到真空度超过10-4托。

b 将栅格安装在冷却的低温支架上。

C 将显微镜的测角仪旋转到-55°，以水平插入支架，以防止所有液氮流出。小心地将低温保持器引入显微镜，并等待直到“真空概览”中的倒数计时结束。一旦“真空概览”中的倒数结束，就将冷冻保持器完全引入显微镜，并将测角仪旋转至0°。

d 快速用液氮重新填充冷冻柜的杜瓦瓶。

e 将控制站的电缆连接到低温保持器，并检查-175°C附近的温度。

f 在低剂量条件和光斑尺寸5.搜索模式记录的图像在X5 ，000和曝光模式在X50 ，000和20e中- / A 2秒。

3 数据分析
噬菌体形态和大小的可靠测量是从冷冻TEM图像获得的，并使用ImageJ软件进行。

资料分析

彻底冻结GC1颗粒使我们能够观察到衣壳收缩减少的确切形状（图5 A- 5 D）。GC1是直径约60 nm的无尾噬菌体，带有内部脂质膜（图5 D，白色箭头）。病毒体在其表面上固定了钉状复合物的表面上具有11个顶点。独特的顶点可通过从直径约10 nm，长度约60 nm的膜形成管状结构来确保病毒DNA的包装和注射（图5 D，黑色箭头）。当不触发DNA注射时，病毒颗粒被遗传物质完全填充（图5 C），而当管状结构出现时病毒颗粒被部分填充（图5 D）（Saren等人，2005 ；Peralta等人，2013）。。我们向读者推荐原始论文（Philippe等，2018）。

图5 。负染色和冷冻固定的GC1噬菌体颗粒的比较图像。AB：通过阴性染色制备的GC1噬菌体，并由TE M观察到（Philippe等，2018）。C- D：通过骤冷制备的GC1噬菌体，并通过冷冻-EM观察。比例尺= 50 nm。

笔记

1. 乙酸细菌（AAB）通常被认为是安全细菌，所有实验都可以在生物安全1级实验室中进行。可以很容易地从成熟/过量葡萄中回收AAB ，并在YPM琼脂上分离，补充0.1 ml的0.25％青霉素溶液（抑制乳酸菌的生长）和0.2 ml的0.25％pimaricin乙醇溶液（抑制酵母菌和霉菌的生长）。5
2. 另外，也可以从酿酒厂（而不是葡萄）收集芥末。
3. 我们分析了红葡萄和白葡萄的几种葡萄汁。从白葡萄单一样本产生上斑块G.蜡状CRBO11179。全部具有相同的形态型。分离出两个单独的噬菌斑，并且都对应于噬菌体GC1。5
4. 在制备过程中的库存I（小号TEPS B4和B5），中间R1，R2和R3的裂解物可以储存在4 ℃下几个星期。
5. 不要使用氯仿来避免细菌污染您的噬菌体原种，因为它会导致Tectiviridae噬菌体颗粒失活。
6.股票II的噬菌体效价为1 ，000至10 ，在该步骤比的库存000倍更高的I。
7. 步骤C产生足够量的新鲜噬菌体原液（原液II），以通过液体方法制备更浓缩的裂解液（原液III）（步骤D）。Stock II不适合通过cryo EM进行视觉分析。

菜谱

1. 噬菌体缓冲液10 x （1 L）
将58 g NaCl和20 g MgSO 4 ·7H 2 O溶于500 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5中
用蒸馏水补足至1 L
高压灭菌
室温保存
为了制备1 X噬菌体缓冲液，D ilute10米升10的X噬菌体缓冲液用90毫升蒸馏水和通过高压灭菌进行灭菌（1巴，20分钟）
2. CaCl 2 ·2H 2 O和MgSO 4 ·7H 2 O 100 x储备溶液
将35.5 g CaCl 2 ·2H 2 O溶解在100 ml蒸馏水中
将19.3 g的MgSO 4 ·7H 2 O溶于100 ml的蒸馏水中
将两种储备溶液在1巴下灭菌15分钟
3. 酵母蛋白ept甘露醇（YPM）汤（1升）
重量5克酵母提取物，3克蛋白ept和25克甘露醇
添加800米升蒸馏水
用盐酸水溶液调节pH至5
用蒸馏水补足至1 L
高压灭菌（1 bar，20分钟）
4 改性酵母蛋白胨-甘露醇固体培养基（YPM Φ “底部”琼脂）（1 L）
准备1 L的YPM汤（3a 。至c 。）
添加10米升的CaCl 2 ·2H 2 O和硫酸镁4 ·7H 2个ö100 X原液
加入20克颗粒琼脂
用蒸馏水补足至1 L
高压灭菌（1 bar，20分钟）
室温保存
5 修饰的酵母-蛋白胨-甘露醇软琼脂培养基（YPM Φ ）（1 L）
制备1升的YPM Φ肉汤（4a上。至c。）
加入6克颗粒琼脂
通过在微波炉中加热直至琼脂完全融化来溶解琼脂
分布在5米升在玻璃管中的等分试样（20米升与帽邻测试帽）和密切
高压灭菌
储存在4°C

参考文献

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d2 e Melo，AG，Levesque，S.和Moineau ，S.（2018年）。噬菌体在食品加工中是朋友和敌人。Curr O pinion Biotechnol 49：185-190。
3 De Roos ，J.和De Vuyst ，L.（2018）。发酵食品和饮料中的乙酸细菌。Curr O pinion Biotechnol 49：115-119。
4 Du Toit，M。和Pretorius，I。（2000）。微生物变质和葡萄酒的保存：使用自然界自己的武器库中的武器-A评论。S Afr J Enol Vitic 21：74-96。
5 佩拉尔塔，B.，吉尔-纸箱，D.，卡斯塔NO-DI EZ ，D.，贝尔坦，A.，布洛涅，C.，奥克萨宁，HM，班福德，DH和Abrescia ，NG（2013）。病毒基因组传递中膜隧穿纳米管形成的机制。PLoS生物学11（9）：e1001667。
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7 Saren ，AM，Ravantti ，JJ，Benson，SD，Burnett，RM，Paulin，L.，Bamford，DH和Bamford，JK（2005）。病毒进化的快照，来自tectiviridae家族的基因组分析。分子生物学杂志350（3）：427-440。
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