材料和试剂
无菌10 0 mm组织培养板（Corning，目录号：430167）
Eppendorf管
15和50 ml锥形管（Greiner Bio-One，目录号：188271和227-261）
5毫升和15毫升圆底（BD Falcon，目录号s ：352063和352059）
玻璃巴斯德移液器
40 μ米细胞过滤器（康宁，目录号：149925）
Fisherbrand盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-545F）
0.22 μ中号Steriflip滤器（Millipore，目录号：SCGP00525）
CellTrics细胞过滤器（Sysmex，目录号：04-0042-2316）
6孔超低固定板（Corning，目录号：3471）
LS柱（Miltenyi ，目录号：130-042-401）
T25组织培养瓶
无菌手术刀（羽毛，货号：EF7281）
Nunc Lab-Tek II腔室滑动系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：154534）
8-40日龄SD大鼠（查尔斯河实验室，目录号：SAS只SD ®大鼠（SD）| 400）
70％乙醇
HBSS（Gibco，货号：14025-092）
EpiCult B基础培养基和增生补充剂（STEMCELL Technologies，目录号：05610）
胎牛血清（FBS）（VWR，目录号： 1300-500）
青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Gibco，目录号：15140-122）
重组人表皮生长因子（西格玛，目录号：E9644）
人成纤维细胞生长因子（STEMCELL Technologies，目录号：78003.1）
肝素（STEMCELL Technologies，目录号：07980）
温和的胶原酶/透明质酸酶（STEMCELL Technologies，目录号：07919）
氯化铵（STEMCELL Technologies，目录号：07800）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25300-054）
Dispase （STEMCELL Technologies，目录号：07913）
DNase I（STEMCELL Technologies，目录号：07900）
死细胞去除试剂盒–包括死细胞去除微珠和结合缓冲液（Miltenyi ，目录号：130-090-101）
无菌双蒸馏水
CD31-生物素（Miltenyi ，目录号：130-105-935）
CD45-生物素（Miltenyi ，目录号：130-107-841）
抗生物素微珠（Miltenyi ，目录号：120-000-927）
DMEM / F12介质，无酚红（Gibco，目录号：21041-025）
马血清（Gibco，目录号：16050-122）
氢化可的松（Sigma，目录号：H0888）
胰岛素（Sigma，目录号：I6634）
霍乱毒素（西格玛，目录号：C8052）
DAPI （Thermo，货号：28718-90-3）
流程分析抗体：
CD31-BB515（BD Biosciences，目录号565408）
CD45-PE-Cy7（BD Biosciences，目录号：561588）
CD29-AF647（BD Biosciences，目录号：562153）
CD24-PE（BD Biosciences，目录号：562104）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2（Gibco，目录号：10010-023）
牛血清白蛋白（BSA ）（Sigma，目录号：A7906）
EDTA（Fisher Chemical，目录号：E478-500）
DMEM / F12营养培养基（Gibco，目录号：11320033）
10 mg / ml庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15710064）
Y-27632（Tocris ，目录号：1254）
0.25％胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200-056）
大鼠皮肤胶原蛋白（我们将其隔离在内部，请参见下文）或使用以下市售胶原蛋白–胶原蛋白1，大鼠尾巴（Gibco，目录号：A10483-01）
冰醋酸（Sigma - Aldrich，目录号：695092）
甲醛（Sigma - Aldrich，目录号：252549）
SMA-488（Cell Signaling，目录号：34105）
吐温20（Sigma - Aldrich，目录号：P1379）
海卫一X-100（Sigma - Aldrich，目录号：X100）
甲醇（Sigma - Aldrich，目录号：322415）
正常山羊血清（细胞信号传导，目录号：5425）
的ProLong Gold抗淬灭封固（赛默飞世尔科技，目录号：P36930）
台盼蓝（BioRad ，目录号：1450021）
完整的EpiCult B培养基（请参阅食谱）
选择缓冲区（请参见食谱）
HF解决方案（请参阅食谱）
MEC介质（请参阅食谱）
成纤维细胞培养基（请参阅食谱）
抗体稀释缓冲液（请参见食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）
3.7％甲醛（请参阅食谱）
PBST洗涤缓冲液（请参阅食谱）

设备

移液器
移液器辅助
无菌剪刀和镊子
离心机
加湿细胞培养孵育箱（5％CO 2 ，37 °C）
涡流
Miltenyi QuadroMACs磁铁（Miltenyi ，目录号：130-090-976）
TC20自动细胞计数器（Bio - Rad，目录号：1450102）
用于细胞培养工作的生物安全柜
CytoFLEXS （贝克曼库尔特，目录号：C09766）
EVOS FL成像系统（Thermo Fischer Scientific，目录号：AMF4300）
尼康A1plus-RSi激光扫描共聚焦显微镜（Nikon）
尼康油浸60倍Plan Apo VC，1.4 NA（尼康）
冰箱

软件

CytExpert v2.1（获取）
FlowJo v10.6.2（分析）
尼康元素v5.11.00
斐济（imagej.nih.gov/ ij /下载）

程序

乳腺组织的解离和单细胞悬液方案的生成适用于STEMCELL Technologies技术公告的鼠乳腺上皮细胞单层培养的大鼠组织。另外，Miltenyi死细胞去除和QuadroMACs细胞选择方案适用于大鼠乳腺组织，以从乳腺上皮细胞去除谱系阳性的大鼠造血细胞（CD45 + ）和内皮细胞（CD31 + ）。该协议的工作流程可以在图1中找到。

图1.隔离和Ñ大鼠乳腺上皮细胞和成纤维细胞的。取下雌性大鼠的第四个乳腺脂肪垫并消化过夜。第二天早晨，通过离心和裂解分别消耗脂肪细胞和红细胞。使用Miltenyi CD31和CD45生物素偶联的抗体对其余细胞进行阴性选择。接下来，添加Miltenyi抗生物素微珠可使用Miltenyi QuadroMACS磁体在LS色谱柱上捕获抗体标记的谱系阳性群体。将洗脱的MEC和成纤维细胞在超低附着（ULA）平板中培养48小时，以耗尽成纤维细胞。然后将纯化的MEC与Y-27632一起加入ULA或平板接种到2D培养物中进行实验分析。图1是使用BioRender.com创建的。

大鼠乳腺组织解离
根据您的机构IACUC协议，通过CO 2窒息对大鼠实施安乐死。
无菌切除大鼠的两个第四乳脂垫，并确保将整个导管树从近端乳头区域切除到可能已经或可能未通过淋巴结的远侧分支，具体取决于年龄。参见视频1去除大鼠乳脂垫。大鼠品系之间的乳腺发育略有不同。我们只使用从Charles River Labs购买的Sprague-Dawley大鼠，它们是在VARI内部繁殖的（图2）。请参阅Filgo等。（Harman Sprague-Dawley）（Filgo et al。，2016），这是另一种常用的大鼠品系，其在特定年龄时的大约乳木大小。请记住，大鼠越老，导管树越发达，您将能够分离出的上皮细胞就越多。不幸的是，与使用这种方案的年轻大鼠相比，我们观察到老年大鼠消化细胞的存活百分比降低（见表1）。活力降低会影响可以否定选择的细胞数量。第四个乳腺脂肪垫是最大，最容易移除的脂肪垫，但是任何脂肪垫都可以替代。请注意，第一，第二，第五和第六个脂肪垫位于肌肉附近，在我们的流式细胞术门控策略中并未考虑肌肉污染。

视频1.无菌除去4个乳房脂肪垫从一个野生型的Sprague Dawley大鼠

图2.大鼠乳脂垫的发育和位置。A.代表胭脂红对产后第8、21和33天的雌性Charles Rivers Sprague-Dawley大鼠的第四个乳腺脂肪垫的完整图像进行了染色，显示了乳腺导管树，基质和淋巴结。分别以4倍（比例尺1,000 µm），2倍（比例尺1,000 µm）和0.8x（比例尺5,000 µm）拍摄图像。B.在对25天大的雌性大鼠实施安乐死后，将锥虫蓝染料注入第四乳腺脂肪垫的乳头中，以指示第四乳腺脂肪垫的位置和大小（在黑色椭圆形内部）。顶部箭头指向注射染料的乳头的大致位置。底部箭头指向乳房内腹股沟淋巴结。在第25天，导管树已到达淋巴结。

表1.从野生型Charles River Sprague-Dawley雌性中消化和阴性选择第四个乳腺脂肪垫后，细胞的平均产量和活力
产后年龄（天）
消化的平均细胞数（x 10 6 ）
解离后的平均生存力（％）
否定选择单元的平均数量
（x 10 6 ）
8（n = 1）
3.0
72
---
20-30（n = 20）
16.7
56
4.4（n = 7）
30-40（n = 16）
33.0
44
6.6（n = 3）
> 40（n = 26）
88
41
2.9（n = 7）

从这里开始，在生物安全柜中执行每个步骤，以保持样品无菌。在放入生物安全柜之前，请务必用70％的乙醇喷洒所有东西并擦拭干净。
用无菌解剖刀将脂肪垫在无菌的100 mm板上以横向方式切碎，直到将腺体变成糊状。
将切碎的垫转移到50 ml锥形管中。
将1份的10x柔和的胶原酶/透明质酸酶混合物与9份完全EpiCult B培养基（加5％FBS）稀释到新的50 ml离心管中。每个脂肪垫加10毫升。
老年大鼠的脂肪垫也具有较高的脂肪细胞含量。因此，建议每个反应仅消化一个脂肪垫（一个反应= 10 ml完整的EpiCult B +温和的胶原酶/透明质酸酶）。
一只30天以内的老鼠的两个脂肪垫可以合并为一个反应。
将乳垫在细胞培养箱中孵育过夜或16小时-无需旋转或摇动。
第二天补足HF溶液并放在冰上。
以高功率涡旋消化的样品10秒钟。
将细胞以350 xg离心5分钟。圆锥管中应有三层：底部的细胞团，其中包含基质细胞，上皮细胞，造血细胞和内皮细胞；中间是液体，顶部是脂肪细胞层。参见图3。

图3.消化和离心的乳脂垫。消化的乳腺脂肪垫离心分离后，呈现出三层的代表性图像。

将试管保持45度角，使用巴斯德玻璃移液管，小心吸出脂肪细胞和液体中间层，同时避免沉淀。我们建议使用移液器从上至下吸尘上清液，以确保去除尽可能多的脂肪。对于此步骤和后续步骤，在清理废物时不要太靠近沉淀物，因为沉淀物由细胞的异质混合物组成，并且不会像组织培养细胞系那样紧密堆积。
用8 ml冷HF和氯化铵的1：4混合物（在2-8 °C融化氯化铵过夜）重悬沉淀。
以350 xg离心5分钟，弃去上清液。

从解离的大鼠乳腺组织中产生单细胞悬液
向消化的乳腺细胞中加入4 ml预热的0.05％胰蛋白酶-EDTA。
轻轻地上下移液1-3分钟。由于死细胞的裂解和DNA的释放，样品应该变得非常严格。
在350中加入10毫升冷的HF和自旋的XG为5分钟。
除去尽可能多的上清液并丢弃。
加入2 ml预热的分散酶（在2-8 °C融化过夜）和200μl1 mg / ml DNaseI。
用移液器吸移样品一分钟，以进一步解离细胞团块。现在样品应该是浑浊的。
用另外的10 ml冷HF稀释细胞悬液。
通过40 µm细胞过滤器将细胞悬浮液过滤到新的50 ml离心管中。取一等份细胞计数。
以350 xg的速度离心5分钟，然后丢弃超级奶茶。
离心样品时，用锥虫蓝计数细胞。进行活细胞计数以准备进行流动分析的细胞，或进行总细胞计数以继续去除死细胞和阴性选择以分离乳腺上皮细胞进行细胞培养。

去除死细胞
注意：重要的是在阴性选择之前使用Miltenyi死细胞去除试剂盒去除死细胞，以提高选择效率和色谱柱结合。死细胞可以非特异性结合抗生物素微珠。
通过稀释20x结合缓冲液原液来制备1x结合缓冲液：每1 x 10 7个总细胞，用4.75 ml无菌双蒸馏水稀释0.25 ml的20x原液。
在100 µl死细胞去除微珠中重悬1 x 10 7个总细胞。
充分混合并在室温（RT）下孵育15分钟。
将LS列放入QuadroMACS磁场中。
通过用3 ml 1x结合缓冲液冲洗来准备LS柱。一个LS色谱柱最多可结合1 x 10 8个死细胞和2 x 10 9个总细胞。
用1x结合缓冲液将细胞悬液调节至1 x 10 7细胞/ ml。
用移液器将细胞悬液吸到柱中，让活细胞流过。
用4 x 3 ml 1x结合缓冲液冲洗色谱柱。收集流出物作为活细胞馏分。
将样品以300 xg的速度旋转10分钟。
进行否定选择。

CD24 + / CD29 +细胞的阴性选择
使用选择缓冲液将细胞数调整为1 x 10 6个细胞/ 40 µl。
用CD31和CD45生物素化抗体标记细胞：在2-8°C下，每1 x 10 6个细胞5 µl（0.15 µg），持续10分钟。
每1 x 10 7个细胞用2 ml冰冷的选择缓冲液洗涤细胞。
以300 xg离心10分钟。
完全吸出上清液并丢弃。
每1 x 10 7个细胞在80 µl冰冷的选择缓冲液中重悬沉淀。
每1 x 10 7个细胞中加入20 µl抗生物素微珠。
充分混合并在2-8°C下孵育15分钟。
每1 x 10 7个细胞用2 ml冰冷的选择缓冲液洗涤细胞。
以300 xg离心10 m in。
完全吸出上清液并丢弃。
在500 µl冰冷的选择缓冲液中重悬1 x 10 8个细胞。
在QuadroMACS分离器的磁场中放置一个新的LS柱。
通过用3 ml缓冲液冲洗来准备色谱柱。
用移液器将细胞悬液吸到色谱柱上，收集含有未标记细胞的流通液-该洗脱液将包含CD29 + ，CD24 +和基质细胞。
用3 x 3 ml缓冲液洗涤色谱柱。
收集未标记的流通池，并与步骤D15的流出液合并。
如果需要将磁性标记的CD45 +和CD31 +细胞悬浮在色谱柱中，请用移液管吸取5 ml选择缓冲液到色谱柱上，并通过将柱塞牢固地推入色谱柱立即冲洗掉细胞。

成纤维细胞系的产生
负选择后，立即将0.5 ml细胞悬液置于4 ml含有庆大霉素的成纤维细胞培养基中的T25烧瓶中。Gentamici n是有毒的初级上皮细胞和胚胎成纤维细胞而产后衍生的成纤维细胞在含有抗生素媒体常规生长（阿方索等人，1990;埃尔Mouedden等人，2000）。
如果庆大霉素的使用在实验上不受欢迎，您还可以通过差异附着将成纤维细胞从上皮细胞中分离出来（Smalley等，2012）：
板0.5米升细胞悬浮液，并允许成纤维细胞附着于板1个小时。
抽吸并丢弃细胞悬浮液，该溶液将包含所有未附着的细胞。
用足够的介质冲洗板1 x，以覆盖板的底部。
吸出并丢弃介质。
添加4毫升的成纤维细胞培养基，使成纤维细胞生长。请注意，使用此方法在成纤维细胞培养物中可能存在上皮污染。多轮差异附着过程将有助于纯化培养物。

MEC细胞系的产生和维持
为了耗尽成纤维细胞，将从阴性选择中分离的CD24 + / CD29 +细胞置于MEC培养基中的超低附着（ULA）平板中48 h。在这种情况下，成纤维细胞会因阳极氧化而死亡。您可以板高达200万个细胞在一个很好的6 -以及ULA板。
48小时后，检查活细胞，该活细胞将在肉眼可见的菌落中。单个单元格指示单元格无法适应ULA条件，并且可能会死亡。
此时，请更改单元格上的介质：
移液管的用过的培养基和细胞成15米升锥形管中。
用PBS洗涤ULA板1次，然后将其添加到步骤F 3a中的细胞中。
以350 x g的速度离心细胞3分钟。
吸出上清液并丢弃。
将细胞重悬于ULA板中的MEC培养基+ 10 µM Y-276 32中。Y-27632是ROCK抑制剂，其防止从管腔细胞apoptosing通过失巢凋亡低附着条件下，并防止管腔细胞从经历细胞凋亡，才可以在二维或三维培养附着。
我们将细胞保持在ULA板中，直到准备用于实验为止。我们手中的主要MEC只能存活到第4或5代，因此请仔细计划实验时间。
每两天（周末除外）更换媒体。
当菌落大小在100-200 µm之间时，它们需要分裂，否则菌落中心的细胞将死亡。
分割菌落以进行维护或n实验：
用吸管将用过的培养基和细胞吸进50 ml锥形管中。
用PBS洗涤ULA板1次，然后将其添加到步骤F 7a中的细胞中。
将细胞以350 x g离心3分钟。
吸出上清液并丢弃。
加入4 ml的0.25％胰蛋白酶到细胞沉淀中。
上下移液20倍。
加入10 ml HF以中和胰蛋白酶。
将细胞以350 x g离心3分钟。
吸出上清液并丢弃。
向细胞沉淀中加入2 ml分散酶。
上下移液20倍。
加入10毫升HF中和分散酶。
离心细胞350 X克FO ，R 3分钟。
吸出上清液并丢弃。
在生长培养基+ 10 µM Y-27632中重悬细胞。
将板置于ULA板中或胶原蛋白包被的板上。
要分离生长在胶原蛋白包被板上的腔和基底细胞，请使用差异化胰蛋白酶消化：
用PBS洗涤培养板1次。
吸出PBS并丢弃。
向细胞中加入0.05％胰蛋白酶-EDTA。
加入胰蛋白酶5分钟后，将已从烧瓶中分离的细胞收集到50 ml锥形管中。
用含有FBS的培养基洗涤平板1次，以中和胰蛋白酶。
将洗液添加到胰蛋白酶处理的细胞中。
将MEC介质+ 10 µM Y-27632添加回板上。这些是粘附力强的腔细胞。
离心trypsini ZED细胞以350 X克3分钟。
吸出上清液并丢弃。
将细胞重悬于MEC培养基+ 10 µM Y-27632中。
将细胞放入新的胶原蛋白涂层板中。这些是松散粘附的基底细胞。

胶原蛋白涂布–薄涂程序
注意：分离大鼠胶原蛋白的方案由Pacak等发表。在2014年。请注意，使用Pacak方案获得的胶原蛋白已变性。我们发现，尽管大鼠MEC可以附着在塑料组织培养表面上，但它们甚至在最薄的干扰下也容易从板上剥离下来。因为乳腺基质中的胶原蛋白含量很高，所以我们在板子上覆盖了一层薄薄的大鼠皮肤胶原蛋白，细胞可以在其上形成更牢固的附着。尽管可以用作替代品，但我们大鼠的MEC较之于市售的大鼠尾部胶原蛋白更喜欢大鼠皮肤胶原蛋白。组织培养板，室内玻片，玻璃盖玻片等都可以用胶原蛋白包被。我们一次喷涂许多板，并在4°C下保存1年。保护胶原蛋白和胶原蛋白涂层板避光。
在无菌过滤的20 mM乙酸中将胶原蛋白稀释至50 µg / ml，达到所需的最终体积。
用足够的溶液将胶原蛋白/乙酸溶液吸移到组织培养板，培养皿或烧瓶上，以覆盖底面。
轻轻摇动组织培养容器，以确保溶液将覆盖细胞生长的整个表面。
在室温下在生物安全柜中孵育1小时。避光。
从组织培养容器中吸出溶液并丢弃。吸入的废物应仍然是液体，而不是凝固的。抽吸的废物的体积应几乎等于输入的体积。薄薄的，看不见的胶原蛋白涂层将保留在组织培养容器的塑料表面上。
用等体积的1x PBS清洗组织培养容器2-3次，以除去任何痕量的乙酸。丢弃所有废物。
立即使用组织培养容器或封口膜的边缘，在避光的条件下于4°C存放1年。

流式细胞仪分析
使用HF缓冲液+ 0.01 mg / ml DNase I将细胞数调整为1 x 10 7个细胞/ ml 。
分装100 µl（1 x 10 6个细胞）到15 ml圆底聚苯乙烯管中。
将表2中所示的指示抗体的微克量添加到每个样品中-通过滴定每种抗体以获得最佳信噪比来确定含量。
强烈建议使用荧光减一（FMO）控件设置门控和补偿控件，以防止每个实验使用的所有荧光通道溢出。

表2.流式细胞仪抗体
抗体
荧光团
公司
目录＃
抗体含量
微克抗体/样品
CD31
BB515
蓝光
565408
0.2毫克/毫升
0.125微克
CD45
PE-Cy7
蓝光
561588
0.2毫克/毫升
0.0625微克
CD29
AF 647
蓝光
562153
0.2毫克/毫升
0.03125微克
CD24
聚乙烯
蓝光
562104
0.2毫克/毫升
0.125微克

涡旋3 s。
在室温下孵育30分钟。
向细胞/抗体混合物中加入3 ml HF（无DNase I），并以300 xg离心10分钟。
倒出上清液并丢弃。管底应有可见的细胞沉淀。请勿抽吸上清液。
将细胞沉淀涡旋3秒钟。
向细胞中加入300 µl HF + DAPI（10 mg / ml），并通过CellTrics细胞过滤器过滤。
收集30 000，活，CD31 - ，CD45 -对事件CytoFLEXS和分析使用的FlowJo 。

免疫荧光
注意：以下程序描述了八孔腔载玻片中细胞的中频，但是可以修改附着在其他表面（包括玻璃盖玻片）上的细胞。要记住的重要事情是根据表面积调整体积。细胞密度必须凭经验确定，因为腔细胞要比基底细胞或成纤维细胞小得多。当将任何东西吸到细胞上时，要非常温和，因为MEC容易脱落，即使附着在胶原蛋白上也是如此。通过将移液器尖端接触到腔室孔的侧壁，将溶液缓慢地添加到孔中。
将2 x 10 4个细胞接种到八孔腔玻片的一个孔中。
对于MEC，使用涂有胶原蛋白的腔室玻片。
让细胞在组织培养箱中过夜附着。
洗各孔3 X无线第200μ升RT PBST。丢弃洗涤液。
在室温下用4％甲醛（200微升/孔）固定15分钟。
用移液器吸出电池中的甲醛，并放入标记的废物容器中以进行适当处理。
用冰冷的甲醇固定3分钟（200微升/孔）。
吸入甲醇并丢弃。
加入200 µl /孔的封闭缓冲液。
孵育1小时RT。
当细胞在封闭缓冲液中孵育时，在抗体稀释缓冲液中以1：100的比例稀释SMA-488抗体。将稀释的抗体放在冰上并避光。
吸出阻塞缓冲液。
向每个孔中添加100 µl稀释的SMA-488抗体。
在黑暗中孵育2小时。
洗涤3 X用200μl/孔PBS T.舍弃洗涤。
加入200 µl /孔的DAPI，在抗体稀释缓冲液中以1：1,000的比例稀释，在黑暗中室温放置10分钟。
用200 µl /孔PBST洗涤3次。丢弃洗涤液。
轻轻地取下介质室并粘上幻灯片。
用移液管吸取100 µl ProLong Gold安装试剂到细胞上。
立即将玻璃盖玻片放到安装介质上，确保所有电池都被盖好并且没有气泡。
让安装介质在黑暗中于室温固化过夜。
如果可能，第二天使用荧光显微镜成像。我们使用激光扫描共聚焦显微镜获取z堆栈，这使我们能够分析样品的整体。此外，我们使用Z堆栈在FIJI中生成最大强度的投影图像。
将幻灯片存放在黑暗的地方。如果在4 °C下保存，荧光信号将持续1-2周。

数据一nalysis

我们优化了一组可商购的荧光团偶联抗体，以验证阴性选择对纯化谱系阴性大鼠乳腺上皮细胞的效率（图4）。

图4.抗体的优化和阴性选择的验证。答：每种抗体的滴定度为1至0.003 µg，以确定流式细胞仪最佳信噪比所需的量。B.对新鲜消化的脂肪垫进行阴性选择，并通过将输入的或未选择的细胞与选择的细胞进行比较，用流式细胞仪分析该选择的有效性。将单个活细胞门控在CD31和CD45上。选择后，将细胞的99.5％是CD31 - CD45 -相比，在输入78.4％。

一旦被否定选择，纯化的MEC可以在胶原蛋白包被的平板或ULA中的培养物中生长（图5）。

图5.在培养中生长的大鼠MEC。A.将大鼠MECs接种在MEC培养基+ Y-27632中的胶原包被的板上。注意，通过形态学，可以验证腔和基底细胞的存在。红色轮廓的腔细胞岛被肌上皮基底细胞包围。在EVOS上以4倍于比例尺1,000 µm采集明场图像。B.将大鼠MEC在ULA条件下接种在MEC培养基+ Y-27632中。顶部菌落的大小大约为100 µm，在达到200 µm之前需要进行分裂。在EVOS上以10倍的比例尺= 200 µm采集明场图像。

阴性选择后，将基底细胞和腔细胞彼此分离以用于实验目的。通过流式细胞术免疫表型，2D形态和免疫荧光验证了这些群体的身份（图6）。

图6.成纤维细胞，管腔和基底MEC的分离和验证。在ULA中放置48小时后，将MECs在MEC培养基+ Y-27632中涂在胶原蛋白包被的板上。当培养物汇合率为80％时，通过差异胰蛋白酶消化法分离腔和基底细胞，并铺板作为纯化的群体。在阴性选择之后但在ULA平板中培养之前，通过差异连接选择成纤维细胞。A.通过表达CD24和CD29对成纤维细胞和MEC进行免疫分型。尽管在所有三个细胞系中CD29的表达都是恒定的，但成纤维细胞为CD24阴性，基底细胞CD24为中间，而腔细胞CD24为hi 。B.与铺在胶原上的基底细胞和腔细胞相比，成纤维细胞的2D形态。亮场图像是在EVOS上以4倍拍摄的，比例尺= 1,000 µm。注意基底细胞的间充质外观和腔细胞的紧密堆积的立方形外观。C.我们使用免疫荧光作为最终验证，通过对大鼠成纤维细胞和阴性选择的MECS（管腔和基底细胞池）染色，我们的上皮培养物中不含成纤维细胞（反之亦然，我们的成纤维细胞培养物不含上皮污染）。抗平滑肌肌动蛋白抗体（绿色）和DAPI（核染色，蓝色）。成纤维细胞具有独特的肌动蛋白应激纤维形成，而MEC培养中的阳性基底细胞呈现膜性平滑肌肌动蛋白。Z堆栈是在Nikon A1plus-RSi激光扫描共聚焦显微镜上以60倍的分辨率获得的。使用FIJI生成最大强度的投影图像。

笔记

适用的协议中包含所有有用的提示和技巧。

菜谱

完整EpiCult B培养基
在EpiCult B基础培养基中将10x EpiCult B增殖补充液稀释至1x
添加增生补充剂后，该培养基可在2-8 °C的温度下稳定1个月
在使用前立即添加以下组件：
10 ng / ml重组人表皮生长因子
10 ng / ml重组人碱性成纤维细胞生长因子
4 µg / ml肝素
加入细胞因子后，培养基在1周内良好
冻结EpiCult B增殖补充剂的工作等分试样和每种细胞因子的储备液，以避免冻融
选择缓冲区
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2
0.5％牛血清白蛋白（BSA）
2毫米EDTA
使用0.22 µm Steriflip过滤器的无菌过滤器
在4 °C下存放6个月
Miltenyi建议在每次使用前对选择缓冲液进行除气，但是我们对LS色谱柱的空气阻塞没有任何问题
高频解决方案
HBSS补充2％FBS
在4 °C下存放6个月
MEC媒体
DMEM / F12介质，无酚红
10％马血清
20 ng / m l EGF
0.5 µg / ml氢化可的松
100 ng / ml霍乱毒素
10 µg / ml胰岛素
含有补充剂的培养基将在4 °C下稳定1-2周
配制用于人乳腺细胞的这种培养基（Debnath等，2003）
成纤维细胞培养基
DMEM / F12，营养培养基
10％FBS
50 µg / ml庆大霉素
在4°C下保存1个月
抗体稀释缓冲液
1x PBS
1％BSA
0.3％的Triton X-100
对于10 ml，将30 µl T riton X-100、0.1 g BSA和1x PBS加入10 ml。保持冰上。在使用前应使其新鲜，并在实验结束时将其余部分丢弃。
阻塞缓冲区
1x PBS
5％正常山羊血清
1％BSA
0.3％的Triton X-100
对于10毫升，在0.5毫升中加入0.5毫升普通山羊血清，30毫升Triton X-100、0.1克BSA和1倍PBS，在使用前使其新鲜，并在实验结束时将其丢弃
3.7％甲醛
在1x PBS中将37％甲醛稀释10倍
使用前应使其新鲜，并丢弃在甲醛废物容器中
PBST洗涤缓冲液
1x PBS
0.05％吐温20
对于1升，添加500 µl Tween-20，并充分混合
该缓冲区可以无限期存储在RT上，或者直到缓冲区变浑浊为止

致谢

我们要感谢Bryn Eagleson和VARI Vivarium员工的专业知识。此外，我们还要感谢VARI光学成像核心经理Corrine Esquibel对显微镜的帮助以及VARI的Cassandra Diegel在乳腺研究方面的专业知识。在乳腺癌研究基金会，Muskegon诱惑表，Bee Brave基金会，NF密歇根州和Van Andel基金会支持下的多项研究中使用了此处描述的方案。该协议源自：Dischinger等。2018. NF1缺乏症与雌激素受体信号转导和乳腺癌生存率降低有关。NPJ乳腺癌4：018-0080。

竞争我nterests

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

范安德尔研究所的机构动物护理和使用委员会根据AUP＃19-02-007批准了本协议中对动物的使用。

参考文献

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