材料和试剂

1. 1升和2升锥形烧瓶（ThermoFisher Scientific，FisherBrand ）

2. 60毫米带三通孔的培养皿（Tarsons ，目录号：460061）

3. 96 -孔平底黑色荧光读数板（SPL大号IFE科学，目录号：30496）

4. 50毫升带刻度的离心管（Tarsons ，目录号：546021）

5. 15毫升带刻度的离心管（Tarsons ，目录号：566041）

6. 0.45 µm过滤器（GE Healthcare，Whatman TM ，目录号：9913-2504）

7.直径为0.010英寸的铂丝

8.铝箔（PRS员工，MYFOIL）

9. 1.5毫升微量离心管（Trasons ）

10.秀丽隐杆线虫

11.大肠杆菌大肠杆菌OP50（甘油原液）

12. NaCl（ThermoFisher Scientific，Qualigens ，目录号：7647）

13. MgSO 4 （ThermoFisher Scientific，SQ，目录号：10034）

14. CaCl 2 （默克生命科学，EMPLURA，目录号：QE5Q651429）

15. K 2 HPO 4 （Avantor TM ，RANKEM，目录号：P2607）

16. KH 2 PO 4 （ThermoFisher Scientific，Qualigens ，目录号：7778）

17. Na 2 HPO 4 （ThermoFisher Scientific，Qualigens ，目录号：7558）

18. NaOH（SDFCL，目录号：20252 K05）

19.次氯酸钠溶液（NaOCl ）（Sigma-Aldrich，目录号：239305）

20.绝对乙醇（默克生命科学，EMSURE，目录号：64-17-5）

21.分子级水（SIGMA，目录号：W4502）

22.琼脂粉（HiMedia ，目录号：RM301）

23. LB肉汤（BD Biosciences，Difco TM LB肉汤米勒（Luria-Bertani），目录号：244620）

24. LB琼脂（BD Biosciences，Bacto TM琼脂，目录号：214010）

25.蛋白ept （BD Biosciences，Bacto TM蛋白ept，目录号：211677）

26.胆固醇（SIGMA，目录号：C8667）

27.链霉素（Alfa Aesar ，目录号：J61299）

28. NP-40解决方案（SIGMA，目录号：74385）

29. BioVision甘油三酸酯定量比色/荧光测定试剂盒（BioVision ，目录号：K622）

BioVision套件中提供的试剂

甘油三酯测定缓冲液（TAB）

甘油三酸酯探针

脂肪酶

甘油三酸酯酶混合物

甘油三酸酯标准品（1 mM）

30.线虫生长培养基（请参阅食谱）

31. 1 M KPO 4 （请参阅食谱）

32. 1 M CaCl 2 （请参阅食谱）

33. 1 M MgSO 4 （请参阅食谱）

34. 5 mg / ml胆固醇（请参阅食谱）

35. 50 mg / ml链霉素（请参阅食谱）

36. 5 N NaOH（请参阅食谱）

37. LB介质（请参阅食谱）

设备

水浴
高压灭菌器（JSR，型号：JSAX-80 ）
层流（JSR，型号：JSCB-1200SB）
BOD培养箱（JSR，型号：JSBI-840C）
翘板（SHALOM，GEL ROCKER，型号：SLM-GR-100）
离心机（Hettich，Universal 320 R，1406）
离心机（Eppendorf，Centrifu ge 5424 R）
超声波仪（BRANSON，DIGITAL SONIFIER 450 ）
分光光度计（TECAN，型号：I nfinite M200 pro ）

软件

i-control TM （TECAN，https : //lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro ? p = Software ）
GraphPad Prism5（PRISM，https: //www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
程序

秀丽隐杆线虫的维护
STREA ķ大肠杆菌ö P50ö ÑLB琼脂平板上没有任何抗生素（见ř ecipe小号）和孵育板12小时，在37℃。
将单个OP50菌落接种到50 ml带刻度的离心管中的10 ml LB培养基中，使其在37°C下生长过夜（10-12 h）。
将约150 µl过夜生长的OP50培养物点样到60 mm NGM板上，并在层流中干燥约30分钟。这些板可在室温（RT）下保存。
使用热灭菌的铂丝镐，将5-6枚蠕虫蠕虫（图2A）转移到OP50播种的NGM板中，并在20°C下繁殖，直到它们到达成年阶段并开始产卵。
成年蠕虫可以再次转移到新的NGM OP50板上进行维护。

图2.秀丽隐杆线虫的（A）妊娠成虫，（B）成年成虫和（C）卵的图像

脂质定量
通过采集〜10个妊娠成虫（在20 °C时有60-65 h大的蠕虫，见图2A ），并让它们在用OP50播种的NGM板上产卵6-8 h，来准备同步种群。每盘可产生约500个鸡蛋。将这些培养板在20°C下孵育，直到蠕虫到达妊娠成熟阶段。
将15个带刻度的离心管中的3个皿中的蠕虫收集到6 ml M9缓冲液中。
让蠕虫安定10分钟。
去除多余的M9缓冲液，而不会干扰蠕虫的沉淀，并加入10 ml高压灭菌水。
让蠕虫安定下来，然后在15毫升带刻度的离心管中除去高达2毫升的水。
通过加入制备2倍漂白混合物5 N NaOH和次氯酸钠（漂白剂）的水（见ř ecipe小号）。
将2毫升2x漂白剂混合物加到蠕虫在水中的悬浮液中。
剧烈涡旋30秒钟，使蠕虫破裂。在显微镜下检查以确定溶液中卵的释放（图2）。
注意：涡旋的持续时间会随漂白剂的强度而变化。剧烈涡旋直至蠕虫破裂并在溶液中释放卵。

鸡蛋释放后立即添加15 ml M9缓冲液。
以850 xg离心3分钟，使鸡蛋在底部沉降。除去多余的M9缓冲液，不要干扰沉淀。
重复步骤B9和B10两次。
将卵重悬于带刻度的离心管中的1 ml M9缓冲液中。在20°C的离心管上孵育18-20 h。
18-20小时后检查卵悬液是否孵化。
适当摇动试管，并在普通的NGM板上点三滴5 µl滴。计算每个位置的蠕虫数量。取三个读数的平均值，估计存在的蠕虫总数。
在五个NGM OP50板上斑点孵化的L1幼虫，每个板上平均有300-400个蠕虫，并在20°C时繁殖蠕虫，直到成年阶段（点L1后45-48 h，见图2 ）。
使用M9缓冲液将蠕虫收集在15毫升带刻度的离心管中，用10毫升M9缓冲液洗涤两次（样品置于冰上直至步骤B23）。
让蠕虫解决并删除多余的M9缓冲区。
将蠕虫重悬于15毫升的5％NP-40水溶液中，使蠕虫再次沉降。
除去过量的N P-40溶液，然后将蠕虫重悬在2 ml的5％NP-40溶液中。
观察50 µl蠕虫的悬浮液并计算蠕虫的数量。如有必要，请进行稀释，以使不同样品中的蠕虫平均数量相同（每50 µl约40-50个蠕虫）。
让蠕虫再次落在冰上，并重悬于500 µl 5％NP-40溶液中。
将蠕虫在5％NP-40溶液中的冰上超声处理30分钟，并以60％的振幅打开15 s和关闭10 s。如果需要，每10分钟更换冰块。
将超声处理的裂解物转移到新的1.5 ml微量离心管中。
在水浴中将样品加热至100°C，持续2-5分钟，然后在室温下冷却。这对于完全溶解样品中的所有甘油三酸酯很重要。
重复步骤B24一次。
以12,130 xg在4°C下离心2分钟。
将上清液转移到新的1.5 ml微量离心管中，而不会干扰沉淀。将上清液放在冰上，弃去沉淀。
将样品在水中以1：100的比例稀释以进行测量。

甘油三酸酯标准曲线的生成
将BioVision套件中提供的甘油三酸酯标准品在水浴中加热至100°C 1分钟，并涡旋1分钟。
重复步骤C1两次，使其冷却。确保解决方案明确。
用甘油三酸酯测定缓冲液（TAB）将1 mM甘油三酸酯标准溶液稀释至0.4 µM （0.4 pmol / µl ）。
准备缓冲液对照液（单独使用TAB）以及0.4 µM甘油三酸酯标准品与TAB的1：5、2：5和4：1稀释液，以每孔生成0、4、8和16皮摩尔的甘油三酸酯，用于荧光定量。 96孔微量滴定板。用TAB将体积e调节至50 µl。注意：为创建“ 0、4、8和16 pmol甘油三酸酯”，我们分别向50、40、30和10 µl TAB缓冲液中添加了0、10、20和40 µl的0. 4 µM标准液。对于技术重复样品，应在1.5 ml微量离心管中为每种标准样品准备总反应体积为100 µl。
向每50 µl标准溶液中加入2 µl脂肪酶并充分混合。对于重复样品，在每100 µl标准溶液中加入4 µl脂肪酶，混合均匀，然后在96孔微量滴定板的每孔中分开50 µl。将混合物在室温下在摇床上孵育20分钟。
注意：本实验使用平底黑色96孔微量滴定板。

通过将2 µl TAG酶混合物，0.4 µl TAG探针和47.6 µl TAB混合在一起来制备TAG反应混合物。为标准孔的总数准备一个预混液，再加一个缓冲液反应以减少变化。例如，对于一式四份的4个标准品（包括缓冲液对照），将是18 µl TAG酶混合物，3.6 µl TAG探针和428.4 µl TAB缓冲液。加入缓冲液反应以防止由于移液错误而造成的体积损失。
注意：保护反应避光。

加入50 µl的TAG反应混合物到缓冲液对照液和96孔微量滴定板的每个标准孔中。在室温下将反应物在摇杆上孵育60分钟。
测量荧光用Ex / EM的使用TECAN五百九分之五百三十五纳米我nfinite M200亲分光光度计（小号EE图3）。
图3.使用Biovision试剂盒定量甘油三酸酯的甘油三酸酯标准曲线生成步骤

通过使用PRISM绘制荧光相对于甘油三酸酯浓度（pmol ）的曲线来生成标准曲线（参见图3中的步骤）。通过应用线性回归获得拟合。
使用标准曲线对已知的y值内插x值（甘油三酸酯浓度）（遵循图4中的步骤）。

图4.从标准曲线进行插值以获得生物样品中的甘油三酸酯浓度

秀丽隐杆线虫样品中甘油三酸酯的测定
用TAB将蠕虫上清液（来自步骤B28）稀释至1：2、1：5和1:10，在96孔微量滴定板中一式两份，使最终体积达到50 µl 。
向每个样品中加入2 µl脂肪酶，并充分混合。将混合物在室温下在摇床上孵育20分钟。
每个样品均不包含脂肪酶对照，以测量样品中存在的基础水平甘油。
对于每个孔，通过添加2 µl甘油三酸酯酶混合物，0.4 µl甘油三酸酯探针和47.6 µl TAB制备50 µl甘油三酸酯反应混合物。为所有孔准备单一的预混液。
注意：保护反应避光。

将50 µl甘油三酸酯反应混合物添加到96孔微量滴定板的每个样品孔中（来自步骤D2），并在室温下孵育60分钟。
用脂肪酶和无脂肪酶的对照分别测量每个样品在535/590 nm的Ex / Em处的荧光（原始值显示在图5的快照中）。

图5.秀丽隐杆线虫样品中甘油三酸酯定量的计算

数据分析

用脂肪酶从蠕虫样品的荧光值中减去无脂肪酶对照的荧光值。这提供了校正的荧光值。
将校正后的荧光值应用于甘油三酸酯线性回归拟合线（来自步骤C9），以通过在P ad Prism5中进行插值来获得每个孔中样品中存在的TAG的皮摩尔（请参见图4和图5）。
计算蠕虫样品中每微升甘油三酸酯的浓度（图5）。

w ^这里，

Z：每微升样品中的甘油三微微摩尔

a：添加到孔中的样品量

d：样品稀释倍数

可以计算出每个蠕虫中甘油三酸酯的绝对量（图5）

w ^这里，

问：每蠕虫的甘油三酯皮摩尔

w：每个样本ul的蠕虫数量

w ^这里，

n：每个样本的蠕虫总数（来自步骤B20）

r：步骤B19中的蠕虫悬浮量

在这里，我们显示了野生型N2动物（表示为WT）和str-2（ok3148）动物中TAG量化的示例。STR-2化学感应G蛋白偶联受体通过调节脂肪代谢来控制线虫的高温寿命。如油红Red O染色和BioVision试剂盒中的甘油三酸酯定量所证实，str-2 mutan ts的总脂质含量降低（图6）。对于野生型和str-2（ok3148）动物，我们发现每条蠕虫的甘油三酸酯水平分别为0.78 ± 0.03和0.58 ± 0.03纳摩尔（Dixit等，2020）。生化方法的告诫之一是它不能提供有关蠕虫各种组织中储存的脂肪的空间分布的信息。因此，染色方法和生物化学的结合是研究蠕虫中脂肪代谢的理想方法。

图6.秀丽隐杆线虫的WT和str-2（ok3148）突变体中的甘油三酸酯水平。一。WT和str-2动物的平均值±SEM甘油三酸酯/蠕虫。乙。WT和str-2动物中的脂滴被油红O染色（比例尺：200 µm）。

菜谱

线虫生长培养基（1 L）
3克氯化钠

2.5克蛋白ept

17克琼脂

水高达1 L

在121°C和15 p si下高压灭菌30分钟

将介质冷却至〜50°C，然后添加以下内容：

1毫升1 M CaCl 2

1毫升1 M硫酸镁4

1毫升5毫克/毫升胆固醇

1毫升50毫克/毫升链霉素

25毫升1 M KPO 4

充分混合并倒入60毫米培养皿中

1 M KPO 4 （200毫升）
21.66克KH 2 PO 4

7.12克K 2 HPO 4

水高达200毫升

在121°C和15 psi下高压灭菌制备物30分钟

1 M CaCl 2 （100毫升）
14.7克CaCl 2

水高达100毫升

在121°C和15 psi下高压灭菌溶液30分钟

1 M MgSO 4 （100毫升）
12.037 g的MgSO 4

水100毫升

在121°C和15 psi下高压灭菌溶液30分钟

5毫克/毫升胆固醇
0.25克胆固醇

50毫升无水乙醇

过滤器用0.45 µm过滤器对溶液进行灭菌

50 mg / ml链霉素
0.5克链霉素

水高达10毫升

用0.45 µm注射器过滤器对过滤器进行消毒

5 N氢氧化钠
8克NaOH

水高达40毫升

用0.45 µm注射器过滤器对过滤器进行消毒

LB媒体
2.5克LB汤

水高达100毫升

将LB肉汤在121°C和15 psi下高压灭菌30分钟

LB琼脂
2.5克LB汤

2克琼脂

水高达100毫升

在121°C和15 psi下高压灭菌制备物30分钟

将介质冷却至〜50°C，然后倒入60 mm培养皿中

M9缓冲液（500毫升）
1.5克KH 2 PO 4

3克Na 2 HPO 4

2.5克氯化钠

0.5 ml的1 M MgSO 4

水高达500毫升

在121°C和15 psi下高压灭菌溶液30分钟

2x漂白粉（2毫升）
400 µl 5 N NaOH

900 µl NaOCl （漂白剂）

水高达2 m l

致谢

这项工作得到了Varsha Singh授予的Wellcome Trust / DBT印度联盟研究金的支持（授权号IA / I / 13/1/500919）。2）该协议用于我们在衰老细胞中的原始研究（AGING CELL 2020 Jun 20; 19（6）：e13160）。

利益争夺

我们声明没有财务或非财务竞争利益。

伦理

我们的协议上线虫并不需要从伦理委员会的批准。

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