材料和试剂
1.微管尖（的Rainin ，猫考勤号码小号：17005860 [ 20微升] ; 30389240 [ 200微升] ; 30389213 [ 1 ，000微升]）

2.康宁®未处理培养皿（d×高100毫米× 20mm）的（康宁，目录号：430591）

3.注射器（3毫升）（Fisher Scientific，目录号：14-823-436）

4.锥形管（50毫升）（Thermo Scientific，目录号：339653）

5.细胞过滤网尼龙（100 µm）（BD Falcon，目录号：352360）

6.铝箔

7. Integra TM Miltex TM无菌手术刀片（Fisher Scientific，目录号：12-460-444）

8.微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-137）

9. Falcon TM圆底聚苯乙烯管（流量管）（Corning，目录号：352054）

10. ACK裂解缓冲液（Quality Biologicals，目录号：118-156-101）

11. Dulbecco改良的基本培养基（DMEM）高葡萄糖（MilliporeSigma ，目录号：D5796）

12.热灭活的FBS（HI-FBS）（Fisher Scientific，目录号：SH30109.03HI ）

13. 4型胶原酶（沃辛顿生物化学公司，目录号：CLS4）

14.透明质酸酶（MP Biomedicals，目录号：02151272）

15.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning Cellgro ，目录号：21-040-CV）

16. OneComp eBeads （eBioscience ，目录号：01-1111-42）

17. eBioscience TM固定/透化浓缩液（Thermo Scientific，目录号：00-5123-43）

18. eBioscience TM固定/透化稀释剂（Thermo Scientific，目录号：00-5223-56）

19.抗CD16 / 32抗体（FC阻断剂）（BioLegend公司，目录号：101302），d ilution 1:100

20.僵尸水族（活/死染色）（BioLegend公司，目录号：423102），d ilution 1:100

21.抗CD45-APC-Cy7的抗体（BioLegend公司，目录号：103116），d ilution 1:500

22.抗MHCII- AF700抗体（BioLegend公司，目录号：107622），d ilution 1:200

23.抗CD3- BV711抗体（BioLegend公司，目录号：100241），d ilution 1:500

24.抗TCRγδ - PE抗体（BioLegend公司，目录号：118108 ），d ilution 1：1 ，000

25.抗CD19- BV650抗体（BioLegend公司，目录号：115541），d ilution 1:500

26.反CD49b- PERCP Cy5.5的（BioLegend公司，目录号：108916 ），d ilution 1:200

27.抗CD11b- BV421抗体（BioLegend公司，目录号：101235），d ilution 1:200

28.抗Ly6C- APC抗体（BioLegend公司，目录号：128016），d ilution 1:200

29.抗Ly6G- FITC抗体（BioLegend公司，目录号：127606），d ilution 1:500

30.抗F4 / 80- BV605抗体（BioLegend公司，目录号：123133），d ilution 1:200

31.抗CD11c- PECy7抗体（BD Pharmingen公司，目录号：561022 ），d ilution 1:500

32.抗细胞角蛋白-PE抗体（Abcam公司，目录号：Ab52460 ），d ilution 1:500

33.冰

34.二甲基亚砜（DMSO）

设备

微量移液器
管架和管架
冰架
生物安全柜（BSL2）
旋转器（Fisher Scientific，UVP HB-1000杂交仪杂交箱，货号：UVP 95003001 ）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R ）
稀土永磁（Promega公司，Magnesphere ®技术磁性分离架，C atalog号：Z5343 ）
在5％CO 2的37 °C保温箱中（Thermo Scientific，Heracell 160I，型号：41774412 ）
Nexcelom细胞计数器（Nexcelom Bioscience，Cellometer自动T4自动细胞计数器，型号：Auto T4-003-0489）
流式细胞仪（BD Biosciences，型号：LSR-II）

软件

BD FACSDiva软件（美国加利福尼亚州BD Biosciences ）
Flowjo软件版本10（美国加利福尼亚州BD Biosciences）

程序

消化介质的制备
使用前请准备消化介质。每个实验都必须使用新鲜培养基。向DMEM高葡萄糖培养基中，添加10％热灭活的FBS（HI-FBS），0.1％的4型胶原酶和0.005％的透明质酸酶。4型胶原酶和透明质酸酶均呈粉末状，称重并直接添加到培养基中。轻轻搅拌混合直至所有成分溶解。将25 ml样品分装到每个锥形管中。

样品制备
安乐死以前注射过氧化铁纳米粒子的动物。切除肿瘤并记录其重量。
在培养皿中用剃须刀彻底切碎。
使用注射器柱塞捣碎肿瘤。
转移到装有25 ml消化介质的锥形管中（每150-200 mg肿瘤重量25 ml ）。
在37 °C下旋转30分钟，然后通过100 µm过滤器过滤，同时用注射器柱塞捣碎。
在335 xg下于23 °C离心10分钟。
用含10％HI-FBS的25 ml DMEM /肿瘤清洗。用移液器重悬，然后以335 xg在23 °C下再次离心10分钟。
弃去上清液，并加入3 ml ACK（铵-氯-钾）裂解缓冲液。ACK裂解缓冲液用于裂解流动制备中的红细胞。它是可商购的，但是也可以用氯化铵，碳酸氢钾和EDTA钠制备。用移液器重悬，并在室温下放置3-5分钟。
加入含10％HI-FBS的DMEM直至25 ml，并在335 xg下于23 °C离心10分钟，并弃去上清液。

磁选
加入4 ml含10％H I-FBS的DMEM 。
重悬所有4 ml并将其转移到标记的流量管中。
将所有试管放在永磁磁铁上的稀土上直立放置，并在装有5％CO 2的37 °C培养箱中孵育至少30分钟。
磁分离后，小心地将上清液收集到另一个试管中。
将4 ml含10％HI-FBS的DM EM加入磁性附着的馏分中并重悬。
将所有试管在335 xg下于23 °C离心10分钟，并弃去上清液。图2给出了该方法的架构。

图2.从肿瘤中进行磁辅助细胞分选以进行流式细胞术的总体方案

染色和固定
洗涤沉淀用2细胞（沉淀）毫升PBS通过使用移液管重悬浮。
在335 xg下于23 °C离心10分钟。
加入适量的PBS（通常为1 ml）以进行细胞计数，并在稀释后对细胞进行计数。
从每个试管转移200万个细胞到新鲜试管中。
分别保留1-2百万个细胞用于不染色的控制，活/死控制以及每个FMO管（FMO：荧光减一）用于补偿和门控。
在335 xg下于23 °C离心5分钟。
弃去上清液，加入100 µl活/死溶液（溶于DMSO的溶液）（1 µl / 100 µl PBS），在室温下于黑暗中孵育30分钟。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
用移液管重悬，用100 µl PBS洗涤，并在335 x g下于23 °C离心3分钟。
弃去上清液，加入100 µl Fc阻滞剂（1 µl / 100 µl PBS），在冰上孵育10分钟。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
用移液管重悬，用含5％HI-FBS的100 µl PBS洗涤。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
向没有细胞的新管中加入一滴单一染色珠。
在黑暗中的生物安全柜中准备抗体混合物（50 µl /样品）
所有稀释液均在冰上含5％HI-FBS的PBS中制成：
对于测试样品–以适当的稀释度添加所有抗体。
对于单个染色珠–适当稀释的单个抗体。
对于FMO–所有抗体减去适当稀释后的一种抗体（例如，如果使用12种抗体，则应准备12种单独的抗体混合物，每种混合物都包含11种抗体而不含1种抗体）。
将50 µl抗体混合物加到各自的试管中，并用移液器轻轻混合，然后在室温下于黑暗中孵育30分钟。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
用移液管重悬，用含5％HI-FBS的100 µl PBS洗涤。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
按照制造规程，通过将1份浓缩物与3份稀释剂混合来制备固定/透化（固定/渗透）溶液。
重悬于50 µl的定型液/烫发液中，在室温下于黑暗中孵育30分钟。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
用移液管重悬，用含5％HI-FBS的100 µl PBS洗涤。
在335 xg下于23 °C离心3分钟。
弃去上清液，加入200 µl含5％HI-FBS的PBS 。在流式细胞仪LSR-II（BD Biosciences，San Jose，CA）中运行样品。
可以在黑暗中于4 °C的深红色用铝箔保存，以便第二天（24小时内）运行。

数据采集
使用BD FACSDiva软件在LSR II中获取数据。首先，运行单一染色控件以设置负门和正门。然后运行FMO和sample来记录每个样本至少200,00 0个事件收集的数据。在BD FACSDiva软件中进行补偿后，将数据导出为FCS文件（Staats等人，2019）。

数据分析

使用Flowjo软件分析数据。
将FCS文件导出到Flowjo软件，并将它们分组为FMO和Tumor示例。
打开一个FMO文件，并绘制SSC-Avs 。FSC-A 。
在所有单元格上门–P1 。
选择P1并绘制FSC-H与FSC-A的关系以选择单个单元格–P2 。
选择P2并绘制SSC-A与活/死的关系以排除死细胞。负人口门–P3
选择P3并绘制“实况/死点vs” 。CD45 + ve人口。使用CD45 FMO设置门。在CD45 FMO中，CD45的信号为负。这有助于以公正的方式设置门。同样，为所有其他颜色设置基于FMO的门。通过将最终设置的所有样品门拖至肿瘤样品组，对所有样品使用相同的设置。
根据下面给出的特定标记识别细胞群体。门控策略中给出˚F igure 3和˚F igure原纸的S8（Korangath等人，2020）。
肿瘤细胞– CD45-ve，CK + ve
T细胞–CD45 + ve，CD3 + ve
γT细胞–CD45 + ve，CD3 + ve，TCR + ve
B细胞– CD45 + ve，CD3-ve，CD19 + ve
NK细胞– CD45 + ve，CD3-ve，CD49b + ve
中性粒细胞– CD45 + ve，CD3-ve，CD49b-ve，CD19-ve，CD11b + ve，Ly6G + ve
树突状细胞– CD45 + ve，CD3-ve，CD49b-ve，CD19-ve，MHC II + ve ，CD11c + ve，F4 / 80-ve
单核细胞– CD45 + ve，CD3-ve，CD49b-ve，CD19-ve，CD11b + ve，Ly6G-ve，Ly6C + ve，F4 / 80-ve
肿瘤相关巨噬细胞– CD45 + ve，CD3-ve，CD49b-ve，CD19-ve，CD11b + ve，Ly6G-ve，Ly6C-ve，F4 / 80 + ve
*我们将两个相同样品的独立试管分别用于肿瘤细胞（活/死，CD45，CK抗体）和免疫亚群（活/死，CD45，CD3，CD49b，CD19，CD11b，Ly6G，Ly6C，F4 / 80，MHC II，CD11c，TCR抗体）鉴定。

图3.流式细胞术门控策略以识别不同的细胞群

致谢

该方案源自Jayne Koskinas Ted Giovanis卫生与政策基金会资助的已发表研究（Korangath等，2020）。此外，还使用了NIH 5R25GM109441和NIH / NCI资助P30 CA006973的部分支持。作者希望感谢Tricia L Nilles女士在流式细胞术实验中的协助。

利益争夺

RI是纳米粒子专利的发明者。RI为Imagion Biosystems公司提供咨询，Imagion Biosystems公司是一家开发磁性氧化铁纳米粒子成像技术的公司，该专利由Johns Hopkins University或Aduro BioTech ，Inc提供。以及为Magnetic Insight研发磁粉成像技术的公司。所有其他作者都报告没有利益冲突。

伦理

所有动物研究均得到约翰霍普金斯大学动物保护与使用委员会的批准。

参考文献

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