材料和试剂
1. 灭菌袋（VWR，目录号：58753-194）

2. 转移移液管（VWR，目录号：414004-002）

3. 玻璃巴斯德吸管（VWR，目录号：14673-043）

用棉把玻璃吸管的宽端塞上。用本生灯将毛细管端部固定在火焰中并快速旋转，以抛光毛细管端部。每隔几秒钟暂停一次，检查开口的大小，确保边缘光滑圆润，开口不太窄。在研磨过程中，一个狭窄的开口会破坏细胞。使用前将火抛光巴斯德吸管高压灭菌。

4. 35 mm培养皿（VWR，Greiner Bio One，目录号：82050-540）

5. 100 mm培养皿（VWR，目录号：25384-342）

6. 150 mm培养皿（米德兰科学公司，Kord Valmark，目录号：VM 2902）

7. 微流控器件（Xona微流体器件，目录号：XC450）

8. 玻璃底盘（MatTek，目录号：P35G-1.5-14-C）

9. 透析膜管密封件（VWR，光谱实验室[132735]，目录号：25224-075）

10. 玻璃瓶（Qorpak，目录号：GLC-00987）

11. 透析膜管，MWCO 12000-14000（Fisher Scientific，SpectrumTM S432697，目录号：08-667A）

12. 注射器过滤器0.22μm（VWR，目录号：28145-477）

13. 锥形管（VWR，康宁，目录号：21008-656）

14. Eppendorf管（FisherbrandTM，目录号：05408129）

15. E14.5怀孕Sprague-Dawley大鼠

16. 显微镜用浸渍油（嘉吉公司，目录号：16484）

17. 木瓜蛋白酶（沃辛顿生化，目录号：LS003126）

18. L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）

19. 卵粘蛋白蛋白酶抑制剂（沃辛顿，目录号：LK003182）。在32 ml HBSS中重新配制，并在4°C下储存

20. 胶原酶A（罗氏，目录号：10103578001）

21. DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：D5025-15KU）

22. 台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）

23. 汉克斯无钙无镁平衡盐溶液，HBSS（CellGro Corning，目录号：21-022-CV）

24. 富含氢溴酸的PD89D产品目录号：PD89D。在浓度为0.5 mg/ml的HBSS中重组，过滤消毒，在无菌锥形管中制备5 ml等分试样，并在-20°C下储存

25. 层粘连蛋白（康宁，目录号：354232）

在冰上缓慢解冻，将不同体积（10至50μl）的等分试样放入无菌管中，并在-20°C下储存。层粘连蛋白在温度快速变化后会形成凝胶。对于涂层，将不同体积的多个等分试样合并，以达到最终要求的体积。解冻后不要再次冷冻。

26. Alexa FluorTM 647 NHS酯（Thermo Fisher Scientific，目录号：A37573）。在无菌条件下以10 mM浓度在二甲基亚砜中重组，并制备2μl等分试样。储存于-20°C，6个月内使用。随着时间的推移，染料溶液会发生水解，导致标记效率低下。解冻后不要重新冻结。

27. 碳酸氢钠，NaHCO3（Fisher chemicalTM，目录号：S233-500）

28. 神经基础培养基（Gibco，目录号：21103049）TM公司

29. 无血清超培养（Lonza，目录号：BE12-725F）TM公司

30. 谷氨酰胺增补剂（Gibco，目录号：35050079）TM公司

31. 青霉素链霉素（Gibco，目录号：15070-063）

32. HyCloneTM胎牛血清（GE Healthcare/Cytiva，目录号：SH30088.03）。在无菌锥形管中制备50 ml等分试样，并在-20°C下储存。解冻的等分试样在4°C下储存至6个月

33. N-2增补件（Gibco，目录号：17502048）。在冰上解冻，在无菌管中制备500μl等分试样，并在-20°C下储存

34. B-27增补件（Gibco，目录号：17504044）。在冰上解冻，在无菌管中制备1 ml等分试样，并在-20°C下储存TM公司

35. 神经生长因子2.5S亚单位，NGF（Gibco，目录号：13257019）。在冰上解冻，在无菌管中制备15μl的等分试样，并在-20°C下储存，供应量为100µg/ml

36. Hibernate-E介质（Gibco，目录号：A1247601）

37. 胞嘧啶β-D-阿糖胞苷，AraC（Sigma-Aldrich，目录号：C1768）。在浓度为10 mM的水中重新配制，过滤消毒，在无菌管中制备100μl等分试样，并在-20°C下储存。为限制重复冻融，解冻后每个等分试样可在10μl中重新等分，并在-20°C下储存

38. NaCl（Fisher ChemicalTM，目录号：S671-3）

39. KCl（Fisher ChemicalTM，目录号：P217-500）

40. Na2HPO4（Sigma-Aldrich，目录号：S-7907）

41. 化学品目录号：KH2PO500

42. 胶原酶Ⅰ混合物（见配方）

43. 基本培养基（见配方）

44. 全培养基（见配方）

45. 低NGF中（见配方）

46. 木瓜蛋白酶溶液（见配方）

47. 10倍PBS（见配方）

48. 10x碳酸氢钠缓冲液（见配方）

设备

1. 剪刀（精细科学工具，目录号：91460-11）

2. 镊子（2）（精细科学工具，目录号：11253-20）

3. 弹簧剪刀（精细科学工具，目录号：15023-10）

4. 锋利镊子（精细科学工具，Dumont 5，目录号：11252-20）

5. 解剖显微镜（卡尔蔡司，StemiTM DV4）TM公司

6. 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDropTM 1000）

7. 管旋转器（VWR，目录号：10136-084）

8. 台式离心机（Thermo-ScientificTM，型号：SorvallTM LegendTM Micro 17R）

9. pH计（VWR，型号：SympHonyTM B10P）

10. 组织培养（TC）罩（BSL-2认证）

11. TC显微镜（ZeissT，型号：InvertoskopTM 40C）米

12. 血细胞仪（Bright LineTM，Millipore sigma，目录号：Z359629）

软件

1. 斐济图像(https://fiji.sc/；Rasband，1997-2018年；Schneider等人，2012年）

2. MATLAB（版本9.07.0[R2019b]；马萨诸塞州纳蒂克市：MathWorks公司，2019年；https://www.mathworks.com/products/matlab.html)

程序

A、微流控器件的制备

1. 在电镀图纸前1-2天准备好微流控装置。在TC罩内工作，使用无菌处理技术，保持所有试剂的无菌性。

2. 在一个150毫米的培养皿中放置四个预先组装好的Xona微流控装置。将一个35毫米的无盖培养皿放入较大的培养皿中，并添加3毫升无菌水（图1A）。

图1。微流控设备配置。A、示意图描述了一个微流控装置，微槽连接两个隔室。B-C.每个微流控设备都有两个隔室（B）通过细槽（在C中放大）连接。左室和右室被任意指定为染色体室和轴突室。每个隔室有两个由主通道连接的井。在灭菌和涂层步骤中，可以通过将移液管尖端指向远离主通道入口的方向来增加容量，如左下角所示。如左上角所示，用移液管在主通道入口处注入细胞。D、实验用微流控装置的设置。三个xonamtm微流控装置被安排在一个150毫米的培养皿内，并盖上盖子以保持无菌。一个没有盖子的小的35毫米皮氏培养皿装满水，放在较大的培养皿内，以创造一个加湿的环境。E、典型的显微照片（改编自Aravamudhan等人，2020）显示，在染色体室中游离的DRG神经元电镀后7天，轴突伸入轴突室。神经元用核标记物（DAPI）和轴突（非磷酸化神经丝H，NF）染色。刻度，50µm。

这一装置将提供一个加湿的环境，对于最小化微流控装置中液体的蒸发至关重要。

注：对于大型实验，内部设计微流控设备可能更具成本效益。还可以以较低的价格在玻璃盖玻片上进行内部组装（例如：Xona Microfluidics，SND450）。然而，我们发现后一种方法很麻烦，常常导致设备泄漏，我们更喜欢预装配的设备。

3. 在随后的步骤中，在处理和准备微流控设备时，请遵循这些一般说明（协议改编自制造商的说明）。

a、一次使用四个或更少的设备以保持足够的水分。

b、添加液体时，始终使移液管尖端远离主通道的入口（图1B-1C），并缓慢分配，注意不要将气泡引入主通道或微槽中。除去液体时，留下一些，不要让主通道变干。在添加到设备之前，将所有液体调至室温，以避免形成气泡。

c、消毒、涂上或清洗设备：

i、首先从设备中取出任何液体，然后缓慢地将容量分配到设备的左上角。让液体通过主通道流入井底1分钟。每个装置的左右隔室应相同，名称仅为处理时的一致性。我们用一个永久性的记号笔在每个装置的左上角标记。

二。把左下角的井灌满液体。

iii.用其他装置重复步骤A3ci和A3cii，并等待5分钟，使液体通过微槽流入右侧腔室。

iv.向右上井添加体积，并让其流入右下井1分钟，向右下井添加体积，等待5分钟后再进行下一步。

4按照3中所述的步骤，使用90%乙醇对设备表面进行消毒和湿润，每个孔中加入100μl。使用90-95%的乙醇可使设备均匀湿润，且气泡最少。4按照3中所述的步骤，使用90%乙醇对设备表面进行消毒和湿润，每个孔中加入100μl。使用90-95%的乙醇可使设备均匀湿润，且气泡最少。

5. 使用HBSS清洗设备两次，每孔添加150μl。

6. 用0.5 mg/ml PDL（每个孔100μl）涂覆设备。用盖子盖住装有微流控装置的培养皿，在37°C下培养一夜（至少4小时），然后使用HBSS清洗装置两次。不要让涂层变干。

7. 用层粘连蛋白溶液（每孔100μl；HBSS中2.67 mg/ml层粘连蛋白储备液的1:50稀释）涂覆设备至少16小时，最多48小时。

8. 在分离DRG进行电镀之前，去除层粘连蛋白，用HBSS清洗两次，并在细胞培养箱（37°C和5%CO2）中在完全培养基（每孔100μl）中使装置平衡。

注：对于不需要单独处理神经元胞体和轴突或观察定向运输的应用，DRG也可以在玻璃底的MatTek培养皿中培养，并用于活细胞成像。对于这些应用，在用培养基浸没整个培养皿之前，只在培养皿和板神经元的凹陷玻璃覆盖部分涂上PDL层粘连蛋白涂层，仅在该区域使用小体积培养基4小时。这种策略只在培养皿的成像区域培养神经元，从而有效地利用DRGs。

B、胚胎大鼠背根神经节神经元的分离

1. 在开始解剖前设置以下各项。

a、在灭菌袋中提前高压灭菌解剖工具（剪刀、镊子）。

提示：用10µl吸液管尖盖住工具尖端，以防损坏。

b、解剖前，将器械浸入烧杯中，加入70%乙醇。将金湿巾放在烧杯底部，以防损坏工具。

c、在冰上放置一个15毫升的带无菌HBSS的锥形管手边要有无菌移液管。

d、在冰上冷却两个100毫米的盘子，一半装满HBS。

e、准备好无菌的100 mm培养皿进行解剖（1个培养皿用于2个胚胎）

f、将1.5 ml的Eppendorf管和0.5 ml的完全培养基和HBSS放在冰上。DRG将被收集到这个解决方案中。

注：我们通常从4到5个胚胎收集DRG到每个Eppendorf试管中。如果你正在处理更多的胚胎，那么就设置额外的试管来收集drg。

g、在层流罩或工作台上安装解剖显微镜，用70%乙醇对工作区域进行消毒。

h、将台式离心机冷却至4°C。

i、准备木瓜蛋白酶溶液（1毫升以消化4-5个胚胎的DRG；根据需要放大）。

2如前所述，使用过量的异氟醚对E14.5孕鼠实施安乐死。把老鼠移到一个密封的麻醉汽化室。将汽化器中的异氟醚浓度设置为3-4%，以诱导麻醉。一旦大鼠被深度麻醉，增加蒸发量至5%以诱导死亡。呼吸停止后，将大鼠留在室内3分钟。将大鼠从腔中取出，通过双侧开胸进行二次安乐死。在胸骨下方的腹壁上开一个切口，两侧切开，露出横膈膜。用剪刀或手术刀划破隔膜。2如前所述，使用过量的异氟醚对E14.5孕鼠实施安乐死。把老鼠移到一个密封的麻醉汽化室。将汽化器中的异氟醚浓度设置为3-4%，以诱导麻醉。一旦大鼠被深度麻醉，增加蒸发量至5%以诱导死亡。呼吸停止后，将大鼠留在室内3分钟。将大鼠从腔中取出，通过双侧开胸进行二次安乐死。在胸骨下方的腹壁上开一个切口，两侧切开，露出横膈膜。用剪刀或手术刀划破隔膜。

注：我们发现准确的怀孕日期对于DRG的分离非常重要。

我们用Sprague-Dawley大鼠胚胎进行实验，发现E14.5是最理想的。甚至在一天之后，DRG的神经将它们连接到周围的组织，这使得从脊髓中移除DRG变得更加困难。

注：本方案同样适用于E12.5小鼠胚胎DRG的分离和培养。

3. 取出含有胚胎的羊膜囊，并将其放在一个培养皿中，培养皿上放有HBSS。

4. 小心地切开每个羊膜囊，取出胎盘和胎膜，分离胚胎，并立即用剪刀斩首（图2A）。将断头的胚胎移到一个新鲜的培养皿中，培养皿内装有放在冰上的hbs。重复上述步骤，直到收集到所有胚胎。

注意：最好分离胚胎和d在层流罩中使用无菌条件解剖DRG。然而，我们已经成功地在实验室工作台上分离出DRGs，并在TC罩中使用无菌条件进行进一步的酶解和电镀。

5. 开始DRG解剖时，将一个胚胎腹侧朝上放在解剖显微镜下干净的培养皿上，用移液管滴几滴冷的HBS，以保持组织湿润。在移植到下一个胚胎之前，完成对这个胚胎的DRG的解剖。

注意：在解剖过程中不要让组织变干或变热。将缓冲液和组织放在冰上冷却，尽量减少从安乐死到电镀DRG的时间，以最大限度地提高细胞活力。根据需要再滴几滴HBSS，以保持组织的低温和湿润。

6. 轻轻切开腹侧，用镊子取出内脏（图2B）。

7. 腹侧朝上，吻侧靠近你，小心地通过颈部开口将弹簧剪刀插入脊柱，并在不干扰脊髓的情况下，通过浅表纵向切口切开脊柱。

8. 用细镊子将脊柱张开，轻轻松开脊髓周围的组织，使脊髓完整（这一步将使下一步更容易将DRG与脊髓一起拉出）（图2C）。

9. 用一对细镊子按住脊柱（在颈部），用另一把钳子慢慢地将脊髓连同附加的drg一起从颈部移到尾部（图2D）。这一过程将导致完整的脊髓与周围组织完全分离，DRG附着在其整个长度上（图2E）。

注意：这是一个棘手的步骤。你一定要温柔，不要把DRG从脊髓上取下来。分离出最大数量的drg需要小心地松解组织，并一次从胚胎中移除带有DRGs的小部分脊髓。

图2。胚胎大鼠背根神经节的解剖。A、沿着虚线将分离的胚胎斩首。B、切除内脏后的断头胚胎的腹侧视图。C、打开脊柱后可以看到脊髓。D、脊髓及其附着的背根神经节与周围组织分离并移向侧面。E、孤立性脊髓，背根神经节沿长度分离。

10. 将带有DRG的脊髓移到培养皿上一个干净的地方，并加入几滴冷的HBS。用一对细镊子把脊髓钉住，用另一对钳子捏住DRG的基底或与脊髓的连接处，分离出DRG。将DRG收集到含有完整介质和HBS的1:1混合物的试管中，并放置在冰上，沿着绳索的长度工作。大鼠体内有31对drg，但不可能全部分离出来。

11. 重复这个过程从所有胚胎中收集drg。如果你是在同一天电镀，继续分离。

注意：DRG也可以在含有5的Hibernate介质中保存一周0单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素解离和电镀前在4°C。我们通常在解剖当天从一只大鼠的一半胚胎（约4-5个）中提取DRG，并在一周后储存和放置剩余的DRG。在两组大鼠之间用相同的策略和策略进行优化。

C、 DRG的酶解

1. 让DRG沉入管底（约5分钟）。

笔记：

a。在每个离心步骤之前，让DRG沉淀。不这样做会导致在离心后去除上清液时粘附在试管侧面的DRG丢失。

b。从下一步开始，尽可能采用无菌处理技术并在TC罩内工作。

2. 在300、4°C下离心3分钟至颗粒图纸。在TC罩内使用无菌条件，在不太靠近颗粒的情况下去除上清液，并用1 ml HBSS冲洗。轻轻地轻敲试管以继续使用。不要上下吸管吸管，因为它们会粘在吸管尖端。再次离心并拆下HBSS。x克

3. 加入1ml木瓜蛋白酶溶液，轻拍试管，继续培养DRGs，37°C孵育17分钟。

4. 在350下离心5分钟，使DRGs颗粒化并去除木瓜蛋白酶溶液。不要离小球太近，因为从小球中延伸出来的粘稠物质（溶解细胞释放的胶原蛋白和DNA）会使其容易脱落。x克

5. 取100μl卵黄状粘蛋白和1ml胶原酶dna酶I溶液，使DRG颗粒再悬浮。在37°C下培养10分钟。

6. 用1ml碱性培养基洗涤分离的DRG两次。在350下离心，并在每个清洗步骤中轻拍以重新冷却。最后，向DRG颗粒中添加1 ml完全培养基。x克

注：基本介质和完整介质只在NGF内容上有所不同。完全培养基中含有NGF，而基本培养基不含NGF。

7. 在火抛光吸管上涂上完全介质，移液10次。这将防止神经元在下一个分离步骤中粘附在移液管壁上。用吸管将DRG悬浮液置于完全培养基中~15次分离，直到没有更多可见的簇状物，细胞均匀悬浮。不要引入气泡，避免过多的移液管，以限制对细胞的损伤并保持活力。

8. 将分离的DRG混悬液与台盼蓝各10μl混合。用血细胞仪计数排除台盼蓝的活细胞并测定细胞浓度。从4个胚胎中分离出的DRGs通常能产生1.7×106的游离活细胞。

D、微流控装置中游离DRG神经元的镀覆与维护

1. 根据电镀要求调整电池浓度。我们通常将0.5-2x105活细胞培养在250μl的微流控设备中。

2. 在播种细胞之前，从微流控设备的左侧隔室（这将是种子室或染色体室；图1B）取出培养基。一次只使用一个设备，不要让油井干涸。

3. 将140μl细胞悬液缓慢添加到顶部孔中，将移液管尖端靠近主通道入口（图1B）。细胞将开始流经主通道到达井底。为了逆流并使细胞在主通道中沉淀，用移液管将110μl细胞悬浮液移到主通道入口附近的底部孔中。

注：当细胞流经种子（染色体）室的主通道时，一部分细胞会沉淀下来并将轴突延伸到相对的（轴突）室。大多数细胞在种子孔中沉淀是正常的。

4. 将所有种子设备放回37°C培养箱中，使细胞粘附过夜。

5. 在镀后16～18h，更换含有2μM AraC的培养基，以抑制非神经元细胞的生长，并引入NGF梯度，以促进轴突向轴突室的生长。此时细胞应该已经粘附并开始延伸轴突突起。更换培养基时，从小体室中取出培养基（不干燥），用含有AraC的300μl低NGF培养基代替。从轴突室取出培养基，用含有AraC的200μl完全培养基代替。更换介质时，使移液管尖端远离主通道。

笔记：

a。为了维持质体和轴突隔室之间的流体隔离，通过建立两个隔室之间的体积差来引入静水压力。在上述情况下，我们在轴突室中引入100μl的体积差，以维持较高浓度的NGF。溶剂分子从体积较大的腔室缓慢扩散到体积较小的腔室。小分子或病毒添加到体积较小的隔室中，与相对隔室保持至少24小时的隔离。

b。不要完全去除培养基，干燥主通道，或将神经元暴露在空气中。

6定期在明亮的视野显微镜下检查培养皿中细胞的组成。当大多数非神经元细胞死亡时，去除AraC并用维持NGF梯度的完全培养基代替。我们发现用2μM的AraC处理48h能有效地杀死非神经元细胞。然而，AraC浓度（高达4μM）和治疗时间应根据经验确定。6定期在明亮的视野显微镜下检查培养皿中细胞的组成。当大多数非神经元细胞死亡时，去除AraC并用维持NGF梯度的完全培养基代替。我们发现用2μM的AraC处理48h能有效地杀死非神经元细胞。然而，AraC浓度（高达4μM）和治疗时间应根据经验确定。

7. 此后每3天更换一次培养基。在镀后4-5天可以观察到突起伸入轴突室，8天后形成致密的网状结构（图1D）。我们通常在8到12天之间进行实验，并在镀后14天内将DRG神经元保存在微流控设备中。

注：培养的DRG神经元的突触形成和成熟度可以使用其他地方描述的程序进行评估（Joseph等人，2010年；Newberry等人，2016年）。使用类似程序培养的DRG神经元在11-14 DIV左右表现出峰值自发电活动（Newberry等人，2016）。

E、呼肠孤病毒的荧光标记（改编自Fecek等人，2006）

1. 如所述繁殖和纯化呼肠孤病毒（Berard等人，2009年；Kobayashi等人，2010年）。用纳米滴分光光度计测定260nm处纯化病毒的光密度。使用关系式确定颗粒浓度，1 OD260=2.1 x 1012颗粒/毫升（Smith等人，1969年）。计算获得3 x 1012颗粒用于标记所需的病毒制剂体积。

注：呼肠孤病毒是一种BSL2传染源，在处理病毒时，应采用机构生物安全委员会批准的标准安全措施。我们建议使用手套和实验室外套，只在生物安全柜内处理病毒。

2. 新制备并过滤消毒50 mM NaHCO3缓冲液。

3. 将（在生物安全罩中）50μl NaHCO3缓冲液、3 x 1012呼肠病毒颗粒和无菌去离子水混合，在无菌管中获得499μl的总体积。在用所需体积的水稀释NaHCO3后添加病毒颗粒。

4. 向在碳酸氢钠缓冲液中稀释的病毒离子添加1μl Alexa FluorTM 647 NHS酯染料（储备10 mM）。在使用前将一小份染料解冻，不要在室温下长时间放置。

5. 将试管放在摇杆或旋转器上，并在室温下在黑暗中进行标记反应90分钟。含有标签混合物的试管可以用铝箔覆盖以防止光线照射。

6. 标记反应进行时，使用无菌去离子水（如果水不是无菌的，在TC罩中过滤消毒）将10x PBS稀释至1x，并在4°C下预冷3L 1x PBS。

7. 在4°C下（在冷藏室）用1L 1x PBS透析标记病毒，以去除多余的未标记染料。我们通常三次更换缓冲液（2小时、18小时和20小时）。

8. 将标记病毒转移到玻璃瓶中，并在4°C下避光保存。我们通常在长达6个月的实验中使用标记病毒。

注：如果病毒离子不降解，即使在6个月后也可以使用标记的病毒制剂。用10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后，病毒蛋白质的电泳迁移率可证实降解不足。

F、活神经元中呼肠病毒转运的影像学研究

1. 造影前30min～1h接种荧光标记呼肠孤病毒。

a、在200μl完全培养基中制备含有109个荧光标记呼肠孤病毒颗粒的接种物。

注：接种量可根据研究的病毒和应用情况减少。

b、将培养基从轴突室中取出，但不要使孔干燥。确保染色体室充满培养基（~300μl）

c、将120μl的病毒接种物加入顶孔中，使接种物通过主通道流入底部井中1min，然后将80μl接种物添加到底部井中。

注：相对体室（300μl）中较高的体积将阻止病毒从轴突室（200μl）的主动扩散。

2. 在37°C下用接种物培养细胞30分钟至1小时。

3. 同时：

a、将各1 ml HBSS和完整培养基加热至37°C。

b、将显微镜的成像室、载物台和物镜加热至37°C。我们使用配备有63x（NA=1.4；HC-PL-APO）油浸物镜和HyD探测器的徕卡TCS-SP8激光扫描共焦显微镜进行成像。该显微镜还配备了环境室（GSI TOKAI HIT标准加热台顶部培养箱）和透镜加热环，可在成像过程中将活细胞维持在37°C。该程序可适用于任何共焦成像装置。

笔记:

一。为了对活细胞进行长期成像，必须使成像室达到含5%二氧化碳的平衡，以维持培养基的pH值。然而，我们在没有二氧化碳平衡的情况下对神经元成像30分钟，也没有观察到对轴突运输的任何不利影响。

二。任何共焦显微镜，无论是旋转圆盘显微镜还是线扫描显微镜（LSM），都可以用来成像荧光病毒在轴突中的传输。显微镜必须有一个快速扫描选项，以至少每秒4帧的速度获得图像。我们对使用不同LSM显微镜（蔡司710）和PerkinElmer公司的旋转圆盘共焦显微镜获得的图像进行了类似的分析。虽然外荧光显微镜也可以用于这些分析，但共焦显微镜提供了更好的z分辨率，并且可以区分病毒在含有轴突的不同平面上的运动。

4. 从微流控装置的轴突室中取出多余的接种物，用预热的HBS轻轻冲洗两次，并添加200μl完全培养基。注意，病毒离子会粘附在轴突室的涂层上，这使得很难想象病毒在这一区域的传输。

5. 在物镜上加一滴油。将微流控装置转移到预热的显微镜台上。移动载物台并将物镜大致与微流控装置中的凹槽对齐。升起物镜，直到油刚好开始接触设备底部。使装置和介质重新平衡到37°C，持续10分钟。

6. 用目镜和亮场光聚焦，找到一个含有轴突的凹槽。

7. 建立成像参数。我们使用Leica Application Suite X（LAS X）软件和以下参数对活神经元中呼肠孤病毒的转运进行成像：

a、钻头深度：12

b、格式：512 x 512像素（82 x 82μM区域，一次成像两个凹槽）

c、光学变焦：2.25

d、双向扫描：打开

e、针孔：1 AU

f、帧间隔：0.26秒

g、成像间隔：30秒（在1分钟的成像时间内，我们不会遇到太大的漂移。在较长的成像间隔期间，您可能需要校正偏移。）

h、设置激光强度和增益。打开PMT。

注：长时间暴露在高激光强度下会导致光漂白，而高增益设置将导致背景放大，从而导致低信噪比。在实现高帧速率跟踪运动粒子的同时，应为每个设置在激光强度和增益之间建立良好的平衡。

i、获取延时图像并另存为“文件”_名称.lif“文件。可以使用ImageJ进一步分析这些文件。

j、为了方便起见，我们在录制连续的电影时从设备的顶部凹槽移动到底部凹槽。同一个凹槽不要多次成像，以减少光毒性。如果成像室未与二氧化碳平衡，则将每个设备的成像时间限制为30分钟。

数据分析

A、手动粒子跟踪和kymograph生成

1. 使用Fiji ImageJ打开包含病毒传输的延时图像的文件。

2. 从斐济任务栏中，为投影方法选择“图像>堆栈>工具>分组Z项目和最大强度”。此操作将打开一个新的图像窗口，其中每个像素的最大强度投影到延时图像系列的单个帧上。单个荧光呼肠孤病毒颗粒的轨迹可以在这张图像中清晰地显示出来（图3A）。

3. 使用分段线工具，从投影图像跟踪轨迹（图3B），并将线跟踪添加到ROI管理器（分析>工具>ROI管理器>添加）。重复此过程以向ROI管理器添加更多轨迹。ROI可以保存以备将来参考。

4. 要生成kymograph，请从ROI manager窗口中选择原始图像窗口和感兴趣的ROI。从斐济任务栏中，选择分析>多Kymograph>多Kymograph，线宽为3。此操作将打开一个新的图像窗口，显示所选轨迹的kymograph（图3C；kymographs显示X轴上ROI的位置和Y轴上的时间）。

注意：如果图像有多个颜色通道，请使用“图像>颜色>分割通道”将各个通道分割为单独的图像，并选择包含荧光呼肠孤病毒的图像以生成kymograph。

5. kymograph中单个线段的斜率（距离除以间隔）提供了评估间隔期间病毒点的速度。

图3。使用ImageJ生成粒子跟踪和kymograph。A、代表性的图像显示了多个呼肠病毒颗粒在微流控装置凹槽内的轴突中的轨迹。使用ImageJ中的“分组Z投影”函数，将26秒的延时图像序列的每帧的最大强度投影到单个帧上，从而获得轨迹。比例尺，10µm.B.手动跟踪单个轨迹（红线）。C、使用ImageJ中的“多Kymograph”函数沿（B）中的跟踪线生成Kymograph。曲线图上的每一条线都显示了病毒点沿轴突（X轴）随时间（Y轴）的位置。

B、单个呼肠孤病毒粒子的自动跟踪

1. 要跟踪单个呼肠病毒粒子在视野中的运动并记录轨迹，请打开文件（文件_姓名.lif)包含使用斐济图像的延时图像。

2. 加载TrackMate插件（插件>跟踪>TrackMate）。详细描述了该插件中使用的算法和参数（Tinevez等人，2017）。

3. TrackMate应该自动从与图像文件相关联的元数据中提取并显示成像参数（图4A）。验证这些值是否正确，然后继续执行下一步。使用屏幕右下角的箭头移动到上一步或下一步。

4. 根据大小和强度建立识别单个呼肠孤病毒斑点的参数。

a、选择狗探测器。

b、 “估计的水滴直径”是对粒子大小的粗略估计。在我们的实验条件下，直径为0.75μm最适合于识别颗粒。阈值取决于图像质量（背景上的信号强度），并且可以根据经验确定，如下所述。选择使用“中值滤波”和“亚像素定位”。

c、选择preview并使用Zoom工具，以确保所使用的阈值能够实现病毒斑点的最佳识别。选定的粒子将用洋红色圆圈标记。有关图中apt值和4C值之间的差异，请参阅图中的“低”和“4C”中的“粒子选择”值。

d、如果图像具有高信噪比，则无需对斑点进行进一步滤波。

图4。使用TrackMate跟踪呼肠孤病毒的运动。A、初始TrackMate窗口显示从图像元数据自动提取的参数。B-C.一个代表性的例子，显示了分别使用最佳（B）或低（C）阈值时，在沟槽中的DRG轴突内选择荧光呼肠病毒颗粒或背景斑点。比例尺，5µm.D。识别的轨迹（黄色）叠加在延时序列的单个图像上。关于显示相应的点状病毒的视频，请参考视频1。

视频1。追踪呼肠孤病毒在轴突中的运动。来自TrackMate的代表性输出影片，显示荧光呼肠孤病毒病毒离子在微流控装置凹槽中的DRG轴突内运动超过26秒。该装置定位于成像槽的左侧和右侧的轴突室。

5. 向前导航并设置参数以跟踪粒子轨迹。

a、选择“simple LAP tracker”。该跟踪器最适合于识别轴突中粒子传输的轨迹，轴突遵循相对线性的轨迹。

b、我们推荐以下初始参数：链接最大距离：2.5μm，间隙闭合最大距离：3μm，间隙闭合最大帧间距：3帧。这些参数可能需要根据经验进行优化，以实现最佳跟踪。

c、确定的轨迹将叠加在图像上显示，如图4D和视频1所示。

6. 在接下来的几个步骤中过滤并记录感兴趣的轨迹。

a、过滤掉位移小于6.5μm的轨迹。

b、符合此标准的轨迹将叠加显示在图像屏幕上。

注：手动查看延时图像或使用投影图像来确定所选参数是否导致选择大多数轨迹。另外，确定各个轨迹是否正确链接。例如，如果步骤5b中的参数不是最优的，单个病毒粒子的运动可以被分割成多个轨迹。迭代地转到前面的步骤并更改参数以实现最佳轨迹选择。鉴于单个粒子跟踪的性质，可能不可能完美地识别出视野中所有粒子的轨迹。因此，选择能够在不同的图像和实验中产生一致的可重复性结果的参数。我们建议您阅读TrackMate文档中的“配置简单的LAP跟踪器”一节，了解更多详细信息。

c、当参数满意时，使用“分析”按钮编译结果。将结果保存在窗口“Spots in tracks statistics”下，并选择一个文件名（例如：Virus_trackline_1）。

C、从粒子轨迹中提取动力学参数

1. 我们使用一个自制的MATLAB脚本来分析使用上一节描述的步骤获得的单个呼肠孤病毒粒子的轨迹。该脚本是为在Windows 10中执行的Matlab2019（b）编写的，并作为该协议的补充（轨迹分析_MATLAB）。

2. 这个脚本有三个部分：（a）用户定义，（b）主程序，和（c）导出文件。

a、用户定义：运行程序前需要定义5个参数。

i、要分析的文件名\路径包括：U\U中的病毒名\引文：U。

二。no_fr：1s内捕获的帧数。我们将默认值设置为4，因为图像每隔~250毫秒采集一次。

iii.阈值时间：设置包含轨迹的最小持续时间阈值。默认值设定为5秒（跟踪时间小于5秒的粒子轨迹将被丢弃）。

iv.thresh_dist：定义粒子在1s内移动的最小距离，以便将其视为“运动中”。默认值设置为0.15µm（如果粒子在1s间隔内移动<150 nm，则在该间隔期间将被视为“暂停”）。

v、阈值级别：在“运动”时获取粒子瞬时速度的阈值。默认值设置为0.15µm/s。

b、主程序：此部分构成程序的主体，根据前一部分的输入值计算生物物理参数，用户无需修改。

c、导出文件：单击“运行”按钮执行MATLAB程序将生成五个Microsoft Excel文件，计算值如下：

i、 “仪表_标高.xlsx'：此文件提供输入文件中所有轨迹的瞬时速度列表。瞬时速度计算为连续~1s间隔内单个点的位移。来自输入文件的所有轨迹的瞬时速度连接成一列。

二’msd.xlsx公司'：此文件提供绘制均方偏差所需的信息。列对应于时间、平均均方偏差和相应的标准偏差，以及数据点的数量。

三、轨道_标高.xlsx'：此文件提供粒子在各个轨迹中的平均速度，计算结果为粒子所行驶的总距离除以轨迹持续时间。

四、压裂_持续时间.xlsx'：此文件中的各个值提供粒子在每个轨迹中处于“暂停”状态的时间分数。

v、 '暂停_持续时间.xlsx'：此文件提供输入文件中编译成一列的所有轨迹的暂停持续时间列表。暂停持续时间定义为粒子在每次“暂停”（瞬时速度<0.15µm/s）中花费的时间

笔记

1. 皮层和海马神经元也可以用来研究病毒的轴突转运。尽管其他研究小组已经报道了在微流控设备中培养皮层神经元的成功经验，但根据我们的经验，在这些设备中使用相同的生长条件，这些神经元无法存活。

2. 用活性Alexa荧光染料对衣壳蛋白进行荧光标记，为不适合用荧光蛋白进行基因标记和成像的病毒提供了一种快速适应的策略。然而，由于脱膜后病毒离子标签的丢失，限制了该策略在研究病毒进入和贩运的早期步骤中的应用。

3. 我们已经成功地用其他Alexa荧光载体（Alexa-fluor488tfp酯和Alexa-fluotm 546 NHS酯）标记呼肠孤病毒。然而，与Alexa FluorTM 647 NHS酯相比，Alexa FluorTM 488 TFP酯稳定性较差，溶解后水解速度更快，因此批次间的标记效率差异较大。TM公司

食谱

1胶原酶Ⅰ混合物1胶原酶Ⅰ混合物

a、在1.5 ml HBSS中溶解15 KU DNA酶I

b、将12 mg固体胶原酶A溶解于10.5 ml HBSS中

c、结合胶原酶A和DNA酶I溶液

d、加入120μl 100x青霉素链霉素

e、用0.22μm过滤器在TC罩内进行过滤消毒

f、在无菌管中制备1ml等分试样，并在-20°C下储存

2. 基础培养基（50毫升）

24毫升神经基础培养基TM公司

24ml超培养基TM公司

1.5毫升杂交血清

0.5毫升N-2

1毫升B-27

0.5毫升谷氨酰胺

0.5ml青霉素链霉素

注：按要求新鲜制备培养基，并在4°C下保存。培养基的保存时间不超过一周。

3. 完全培养基

将NGF添加到基础培养基中，最终浓度为50 ng/ml

4. 低NGF中

向基础培养基中添加NGF，最终浓度为20 ng/ml

5. 木瓜蛋白酶溶液（在DRG解剖前新鲜制备）

a、新鲜制备NaHCO3:0.24 g的饱和溶液于2.4 ml水中

b、将16 mg L-半胱氨酸溶解于6 ml HBSS中

c、混合1.5 ml HBSS+4µl饱和NaHCO3溶液+0.5 ml l-半胱氨酸溶液

i、使用0.22μm过滤器对溶液进行消毒

二。添加木瓜蛋白酶至最终浓度为20单位/毫升

d、在37°C下激活木瓜蛋白酶20分钟，然后在工作台上准备解离DRG。

6. 10倍PBS（1升；pH值7.4）

80克氯化钠

2克氯化钾

14.4克Na2HPO4

2.4克KH2PO4

溶于900毫升去离子水中，将pH调至7.4，并使体积达到1升。高压灭菌器并在室温下储存

7. 10x碳酸氢钠缓冲液（50 mM，pH值8.5）

将0.21 g NaHCO3溶解于5 ml无菌去离子水中。在标记呼肠孤病毒之前，应立即制备此溶液

致谢

我们感谢Dermody laboratory的成员，Bruce Carter和Amrita Pathak在本文描述的协议开发过程中提供的技术建议和有益的讨论。这项工作得到了美国公共卫生服务（）奖R01AI038296（PA和TSD）的支持。UPMC匹兹堡儿童医院（PA和KR）和Heinz捐赠基金（TSD）提供了额外的支持。研究方案改编自以前的工作“呼肠病毒利用大粒细胞介导的进入和快速轴突运输感染神经元”（Aravamudhan等人，2020年）。美国政府网站https://www.usph.gov/

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

伦理学

所有动物工作均按照公共卫生服务政策进行，并经匹兹堡大学动物护理和使用委员会批准。所有人员遵守适用的联邦、州、地方和机构法律和政策，包括动物福利法（AWA）、公共卫生服务（PHS）政策、用于试验、研究和培训的脊椎动物使用和护理原则，以及健康研究扩展1985年法案。

工具书类

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