材料
A、隐匿阴影任务
1 塑料透明或白色竞技场（41厘米x 19厘米x 20.5厘米）
2 防护罩（13 cm x 12 cm x 10 cm）
3 海报板（钉钉，目录号：28128）
4 白色单色竞技场背景（可选，41 cm x 19 cm x 20.5 cm）
5 LCD监视器向下（Dell UltraSharp 1908FP，19英寸）和机架（8020 Inc，Columbia city，USA.Profile 1010，紧固2811，监视器支架角扣件4332），以将其朝下固定在竞技场上方
6 刺激（视频）
7 乙醇70%v/v
8 实验对象：小鼠（本方案采用C57BL/6-精英和Crh IRES Cre；Ai14小鼠开发）
B、单纤维光度法
1. 400µm直径的单光纤套管直径2.5 mm和0.48 NA（Doric透镜，加拿大魁北克）。MFC U 400/430/0.485毫米MF2.5_UFLT）
2. 光纤贴片弦1.5 m或更长，0.48纳纳（Doric透镜，魁北克，加拿大）。DORIC MFP U 400/460/900-0.48_U2m_UFC/MF2.5）
3. 直径2.5mm的氧化锆套管，用于连接光纤贴片弦和套管（加拿大魁北克多利克透镜）。DORIC套筒\u ZR_U2.5）
设备
1 Windows PC
2 加拿大魁北克市多立克光纤光度测定系统
两个激发LED 465 nm和405nm（Doric透镜）
LED驱动器，Doric minicube滤波器组（FMC4_UAE（405）U E（460-490）（500-550）S）
光感器（NewPort，2151型）
3 功率表（ThorLabs，Newton，NY，USA PM100D）
4 摄像机连接并与光纤测光系统同步（加拿大魁北克的多立克透镜）。BTC_UUSB3.0_UCO）
如果未同时记录钙瞬态，则可使用任何能够可视化整个笼的摄像机用于此协议。
5 三脚架
软件
1. Doric神经科学工作室v5.4.1（加拿大魁北克Doric透镜公司）
2. Windows media player classic 6.4
3. 蟒蛇
4. Windows游戏记录器
5. MatlabR2018A（数学作品）
6. ImageJ
7. GraphPad棱镜8.0
程序
A、创造刺激
视觉刺激是用定制的Python脚本创建的，并用Windows游戏记录器（MicrosoftCorporation）记录，以便在行为测试中重放。隐匿阴影刺激代码可在以下位置获得：www.github.com/kpc-simone/shadow-graphics。
隐约的阴影刺激由一个黑色的圆盘组成，它在光背景上呈现出三个不同的阶段。
1. 提供了直径为2cm的静态圆盘，持续3 s，
2. 磁盘在接下来的2秒内扩展到20 cm。
3. 最后，直径20 cm的圆盘将保持额外3 s。
这些刺激中的一列，间隔2秒，可以通过运行报告为示例1.py的脚本来复制。
在黑盘前后，显示器上显示了一个统一的灰色（RGB参考128、128、128）背景。
B、为习惯会话创建背景
在习惯期内，动物被暴露在隐匿的阴影装置中，没有刺激，只有屏幕上的灰色背景作为唯一的光源。对于习惯期，可以使用PowerPoint或暂停刺激的第一帧创建静态背景。
C、织机阴影试验装置的建立
1. 如果测试室没有统一的背景，则将塑料竞技场放置在一个更大的单色竞技场内，该舞台将充当实色背景。拥有坚实的背景可以提高行为视频录制的质量（图1）。
图1。隐约的影子竞技场的例子。A、隐约的影子竞技场，有庇护所。B、隐现的阴影竞技场，具有较大的单色竞技场，提供统一的背景。
2. 将避难所放置在竞技场的一个角落，这样它只能由动物从一侧进入（图2）。
图2。隐约的阴影竞技场中的避难所安置
3. 将LCD屏幕置于竞技场上方（30厘米）朝下，以显示视觉刺激。如果竞技场大于屏幕，将屏幕中心放置在防护罩未覆盖的区域（图3）。
图3。监视隐藏阴影竞技场中的位置
4. 将PC或笔记本电脑连接到LCD屏幕。复制屏幕，并使用Windows Media Player classic打开全屏视频。关键的是，与大多数现代媒体播放器不同，当视频暂停或完成时，该版本不会改变测试舞台上的亮度（图4）。
图4。笔记本电脑设置和连接
5. 在测试室内，应关闭灯，唯一可供动物使用的光源是位于竞技场顶部的屏幕提供的光源，充当虚拟天空（图5）。
图5。在测试过程中，监视器是唯一的光源
6. 试验室应保持安静，研究人员不应在动物视野范围内（黑暗房间内2m，图6）。
图6。材料和试验人员的拟议定位
7. 相机应该放在竞技场上方的一个角落，这样就可以捕捉到整个竞技场。实录应始终可见，以供实验人员使用（图7）。
图7。摄像头放置，可捕获整个竞技场
D、适应试验室和仪器
1. 在开始器械的习惯化程序之前，将动物习惯于试验室3天。每天用同样的方法把动物送到房间。动物每天至少应在房间里呆30分钟。
2. 在对试验室的3天习惯中，动物应习惯于纤维光度法贴片弦。取下家笼顶部和筑巢材料，并将动物连接到光纤电缆上，让它们自由探索家庭笼15分钟。
3. 使动物习惯于这种装置。在开始习惯化前15分钟将动物移到试验室。15分钟后，关闭房间内的灯，并打开屏幕，显示背景屏幕。在这个习惯的阶段，来自屏幕的光将是唯一的光源。将动物连接到光纤贴片弦上，放在竞技场中，让它探索20分钟。此程序应重复3天。他们不需要连续，但最后一天的习惯应该发生在测试开始前24小时。对装置的习惯性对于确保逃逸行为的正确显示是非常重要的。
E、测试日
1. 在试验前15分钟将动物移到试验室。
2. 电脑应打开并连接到LCD屏幕，视频准备播放。
3. 房间的灯应该关闭，唯一的光源来自设备上方的屏幕。
4. 打开Doric系统并加载会话的协议。分配Doric系统的一个数字端口触发视频录制。465 nm LED的功率使用功率表调整到跳线末端的30µW（图8）。
图8。多立克体内钙的建立
5. 将动物放入隐匿阴影装置中之前，将光纤贴片弦连接到动物上，并开始光纤光度记录。允许在homecage中录制10分钟基线。
6. 把动物引入到对面的竞技场，从那里躲避。在开始刺激演示之前，在记录钙活性的同时，允许3分钟的探索时间。
7. 在最初的3分钟习惯/基线之后，将呈现5个头顶隐现的视觉刺激。
只有当动物在躲避处的竞技场对面时，才应呈现刺激物。动物的方位是无关的。此外，至少留出1分钟的试验间隔。在最近出现的刺激消失后暂停视频，控制试验间间隔（图9）。
图9。测试期间刺激呈现的图像
8. 在5个刺激物的传递之后，测试结束，动物可以被移除。
注：如果动物在阴影之间10分钟内没有离开避难所，则可以暂停试验，并将动物从研究中移除。暂停测试前允许的最大时间可以修改，这里提供的10分钟时间只是基于经验的参考。在收容所中10分钟后，动物在短时间内离开该庇护所的概率很低。
9. 将动物转移到其家中，并记录10分钟。
10. 在测试后记录后，停止录制，并将动物从光纤电缆上分离。
11. 用70%v/v乙醇溶液清洁实验对象之间的仪器。
下面的图详细说明了整个实验的拟议时间表（图10）。
图10。从卡箍放置到测试的拟议实验时间线
数据分析
A、手动行为分析
作为一级分析，可以执行手动目视分析。3视刺激交付后被认为是行为反应的行为：
1. 在8秒视觉刺激中，导致被试到达避难所的飞行反应被归类为逃跑或活动行为（视频1）。
视频1。针对避难所的逃跑行为示例
2. 被认定为没有任何运动的反应，除了与呼吸有关的反应被归类为被动或冻结行为。当动物在整个8s期间内结冰或在刺激演示期间间歇性冻结时，视为冻结（视频2）。
视频2。刺激演示期间冻结反应示例
3. 如果受试者在8秒刺激演示过程中没有冻结、未能改变持续行为或试图逃跑，且未到达避难所，则这被归类为非应答者（视频3）。
视频3。刺激演示期间的非响应者示例
B、自动分析
为了自动检测逃逸的开始，可以执行帧到帧图像差异分析，以分割出显示运动的场景区域。该方法适用于分析背景不变（例如固定的家庭笼子）且前景中有较大运动（例如动物运动）的稳定记录。
为此，我们使用以下算法在ImageJ中逐像素帧减法：
1. 导入原始行为视频。使用FFmpeg解压缩.avi，使用ImageJ打开视频，并将其转换为8位灰度图像堆栈，并根据需要调整对比度。
2. 复制堆栈，并将第一个重命名为“Stack1”，第二个重命名为“Stack2”。
3. 删除“Stack1”的第一帧和“Stack2”的最后一帧。因此，每个堆栈现在有n-1帧，而“Stack1”通过一个帧引导“Stack2”。
4. 从“Stack1”中的对应像素中减去“Stack2”的每个图像中的每个像素，并具有8位精度。
5. 计算结果堆栈中每个图像的平均灰度值。
6. 打印平均灰度值与时间（帧数除以采样率）。当在GraphPad8.0中打印时，将产生以下图形的灰色值（图11）。
图11。用GraphPad8.0绘制ImageJ帧减法后的平均灰度值
7. 以MATLAB脚本要求设置的文件格式保存数据（请参阅“示例”_data.xlsx').
8. 使用MATLAB检测基线（链接）的4*MAD。MATLAB脚本测量每个鼠标基线运动的标准偏差中值。在我们的经验中，4*MAD是一个可靠的逃生运动的指示器。同样，我们使用了8秒的时间限制来进行自动逃逸行为分析，但时间可以修改。
提供了一个自定义的ImageJ宏和一个样本图像，用于差分图像分析。同时，还提供了一个自定义的MATLAB脚本和样本数据，用于检测运动的起始和偏移https://github.com/tpgovind/DIA。
C、纤维光度分析
1. 从Doric系统中提取原始数据。
2. 将原始数据加载到以下链接中提供的Matlab脚本中(https://github.com/leomol/FPA). 简而言之，本脚本所做的分析如下：465nm和405nm数据都分别用二阶多项式曲线拟合，然后减去它们以去除漂白引起的伪影。接下来，将最小二乘线性拟合应用于405nm数据，以使其与465 nm对齐。荧光（ΔF）的变化通过从每个时间点465nm减去405nm通道来计算。
3. 在计算ΔF后，按照公式z=（F−F0）/σF计算z分数指数，其中F是试验信号（ΔF），F0为平均值，σF是基频信号的标准偏差。
4. 逃逸反应过程中钙信号峰值检测分析：峰值检测分析采用低通滤波器（5Hz），过滤高振幅事件，计算出结果道的中值。峰值检测阈值设置为MAD的2倍。用于此分析的脚本保存在https://github.com/leomol/MSA。
最后，利用上述MATLAB脚本，绘制了测光信号和自动逃生响应的结果（图12）。
图12。使用MATLAB自定义脚本创建的绘图，描述钙的活动和运动与时间
承认
我们感谢L.A.Molina先生的专家技术支持。我们感谢康明医学院光遗传学核心设施的支持。这项工作得到了加拿大健康研究所（FDN-148440）和加拿大脑-加拿大神经热电子学平台向JSB提供的一项操作补助。ND得到了阿尔伯塔省的研究金的支持，创新健康解决方案。
竞争利益
作者声明不存在任何竞争利益。
伦理
所有动物协议均获得卡尔加里大学动物护理和使用委员会的批准。协议编号AC17-0040。
工具书类
1. 布兰查德，R.J.、弗兰内利、K.J.和布兰查德，D.C.（1986）。实验室和野生褐家鼠的防御行为。J康普心理100（2）：101-107。
2. Dayu，N.、Fuzesi，T.、Roseneger，D.G.，Rasiah，N.P.、Sterley，T.L.，Peringod，G.和Bains，J.S.（2020）。室旁核CRH神经元编码应激可控性，调节防御行为选择。Nat神经症23（3）：398-410。
3. DeMarco，R.J.、Thiemann，T.，Groneberg，A.H.、Herget，U.和Ryu，S.（2016）。光基因增强垂体促肾上腺皮质激素细胞活性在应激后的发作引起快速组织效应的行为。纳特公社7:12620。
4. Evans，D.A.，Stempel，A.V.，Vale，R.，Ruehle，S.，Lefler，Y.和Branco，T.（2018）。计算逃逸决策的突触阈值机制。自然558（7711）：590-594。
5. Mobbs，D.，Petrovic，P.，Marchant，J.L.，Hassabis，D.，Weiskopf，N.，Seymour，B.，Dolan，R.J.和Frith，C.D.（2007）。当恐惧接近时：威胁的迫在眉睫会引起人类前额导水管周围的灰色变化。科学317（5841）：1079-1083。
6. Yilmaz，M.和Meister，M.（2013）。小鼠对视觉刺激的快速天然防御反应。Curr Biol 23（20）：2011-2015。