材料和试剂
1.5 ml微量离心管（Tarsons ，目录号：500010）
90 mm培养皿（Tarson ，目录号460050）
培养皿60毫米（Tarson ，目录号460061）
微尖200-1,000微升（Tarson ，目录号：521020）
微尖2-200微升（Tarson ，目录号：521010）
微尖0.2-10微升（Tarson ，目录号：521000）
脱脂棉（Bengal Surgicals Limi ted，印度/阿兹派克（Abpack），货号：12356477）
薄纸卷（Solimo / Kimberly-Clark WypAll L10纸巾，目录号：13478218）
Polygrid微型管架（Tarson ，目录号：205110）
塑料托盘（农用塑料和包装工业）
棉塞（实验室准备）
喷雾瓶（Abdos ，目录号：P11191）
接种环（Himedia ，目录号：LA014）
手手套（Kimtech ，目录号：97613）
锅铲（Himedia ，目录号：LA007）
封口膜（Himedia ，目录号：LA017）
HiDispo TM Bag-12（Himedia ，目录号：PW040）
番茄种子变种 Pusa Ruby（印度斋桑种子私人有限公司）
青枯菌拮抗细菌（金沃GL1，芽孢杆菌velezensis GL3，B. velezensis GL5和B. velezensis GMC2）是在实验室的作者从olated的endosphere的买麻藤gnemon
青枯菌F1C1菌株（由Tezpur大学SK Ray教授提供）
70％乙醇（Himedia ，目录号：MB106-500ML）
1％NaOCl （Himedia ，目录号：AS102-100ML）
无菌蒸馏水
蛋白ept （Himedia ，目录号：RM001-500G）
Acicase （Himedia ，货号：CR013-500G）
葡萄糖（Himedia ，目录号：MB037-500G）
营养肉汤（Himedia ，目录号：M002-500G）
甘油（Himedia ，目录号：AS100-500ML）
琼脂粉（Himedia ，目录号：CR301-500G）
酪蛋白氨基酸蛋白glucose葡萄糖肉汤（参见食谱）
设备
烧杯（Borosil ，目录号：BRL_1060D21）
锥形烧瓶250 ml（Borosil ，目录号：4980021）
玻璃杯啤酒（Borosil ，目录号：1000D121）
镊子（Tarsons ，目录号：486000）
酒精灯/酒精灯（Himedia ，目录号：LA275）
生长室（Hipoint ，型号：740FHLED）
轨道振动培养箱（Remi，型号：CIS-24 plus）
冷藏离心机（Sigma型号：2-16KL）
高压灭菌器（光学，型号：50升）
水净化系统（Sartorius，型号：Arium mini Plus UV）
移液器（Eppendorf Research Plus，目录号：3120000020，3120000046，3120000062）
称重天平（岛津制作所，型号：BL220H）
层流气流舱（Cleanair Systems，型号：CAH 1200）
Eppendorf生物光度计（Eppendorf，型号：D30）
软件
SPSS 20.0
Microsoft Office Excel 2016

程序
番茄苗准备
用70％乙醇处理5分钟，然后用1％NaOCl处理5分钟，然后在层流气流室中用无菌水洗涤五次，对番茄种子进行表面灭菌。
将种子放入装有无菌水的玻璃烧杯中，轻轻搅拌，等待10分钟。
10分钟后丢弃漂浮在水面上的种子，以使可能存活的种子数量最大化。
将烧杯中剩余的种子在28°C的黑暗环境中放置24小时。
用无菌水将浸泡的种子洗三遍。
在顶部准备三层萌发床-无菌薄页纸，中间准备3 cm厚的无菌棉，在底部准备聚乙烯层（HiDispoTM Bag ）。放置此床在塑料托盘（30×20厘米2 ），并用无菌水（浸泡床V IDEO 1 ）。
视频1.如何准备发芽床

均匀地分布在床的种子，并放置该发芽托盘在生长室中在28℃，75％相对湿度和光照（光强度450的12小时空调微摩尔米-2小号-1 ）。
定期喷洒无菌水以维持幼苗生长。
五天大的幼苗用于青枯菌拮抗细菌的引发。
拮抗bacteri人接种物制备
培养物中的青枯雷尔氏菌拮抗在28±2℃在24小时下在摇动条件下（120转）单独在营养肉汤培养基中细菌的黑暗。
在室温下以430 xg离心培养液10分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬浮在无菌水中，不涡旋。
重复上述步骤2次以上，并调整最终悬浮液的细胞密度至〜10 8 CFU毫升-1 （OD = 0.4）。甲回合10毫升青枯拮抗细菌细胞悬浮液足以素30个苗。
幼苗根系bacterization与拮抗bacteri庵
拔根5 d AYS从发芽托盘旧番茄幼苗不伤根系统。
将30株幼苗放在培养皿中（直径60毫米，高度10毫米），并用10毫升的茄青枯菌拮抗细菌细胞悬浮液。确保根与细菌悬液接触（图1）。
图1.幼苗的根细菌

保持培养皿幼苗在生长室中在28℃，75％相对湿度下调理，以及16小时光照12小时（光照强度450微摩尔米-2小号-1 ）。
用无菌水处理30株幼苗，作为阴性对照组，随后将青枯菌（表1中的CK + R）接种。
模拟地用无菌水接种另外30株幼苗，以作为对照组，以消除在水耕条件下没有暴露于任何细菌的幼苗的自然死亡（表1中的CK + W）。
用拮抗性细菌引发16小时后，即可将幼苗接种青枯菌。

表1.此方法所需的治疗组类型以及说明和目的

既不接种拮抗细菌也不接种青枯菌

为了消除自然枯萎/死苗的治疗组的影响。该组中的幼苗不应枯萎/死亡。

用无菌水模拟接种，然后接种青枯菌

充当阴性对照组。全部或大部分幼苗都应枯萎/死亡。

测试组

（GL1 + R，GL3 + R，GL5 + R，GMC2 + R）

接种拮抗细菌，然后接种青枯菌

计算拮抗细菌的生物防治功效。枯萎/死亡的幼苗数量将取决于被测试的拮抗细菌的生物防治功效。

青枯菌接种物的制备
培养R. solanac earum在住处在用于24小时振荡条件（120 rpm）的28±2℃美浓酸-蛋白胨-葡萄糖（CPG）肉汤的黑暗。
在室温下以430 xg离心培养液10分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬浮在无菌水中，不涡旋。
重复上述步骤2次以上，并调整最终悬浮液的细胞密度至〜10 8 CFU毫升-1 。

青枯菌在拮抗细菌引发的幼苗中的接种
从青枯菌接种前，从培养皿中取出幼苗，并放在另一个无菌，干燥的培养皿中。立即在5分钟内使用这些幼苗进行接种，否则幼苗可能会变干。
接种与苗青枯雷尔氏菌通过辛格描述根浸接种方法等。（2018）。简要地，将青枯菌悬浮液放在宽口管中，将幼苗浸入接种物中直至根芽交界处几秒钟。
CK + W组的幼苗不应接种青枯菌。它被保留为控件。
将接种的幼苗置于1.5 ml微量离心管中，然后向其中加入1 ml无菌水。每个微量离心管仅使用一棵幼苗。
放置微量离心管在一个机架和记P中侧的生长室中调节28℃，75％相对湿度，和10个d光周期12小时AYS （光强度450微摩尔米-2小号-1 ）。定期向试管中添加等量的无菌水，以维持幼苗的活力。
当叶子变成黄色到深褐色并且枝条沿着微量离心管的侧面弯曲成锐角时，幼苗被认为是枯萎的（图2）。

图2.青枯菌接种7天后不同处理对番茄幼苗的影响。CK + W ：既不接种拮抗细菌也不接种青枯菌；GL1 + R ：不接种拮抗细菌华氏葡萄球菌GL1，然后接种青枯菌；以及CK + R：模拟用无菌水接种，再接种青枯菌。该图转载自原始研究文章Agarwal等（略作修改）。（2020），并得到Elsevier的许可。

保持枯萎苗记录每天的基础上从1日d AY至10日d AY张贴青枯菌接种在24小时的间隔。
亲的逐步示范母生育酚被赋予在图3中。

图3 。代表青枯菌拮抗细菌的生物防治功效测定的示意图

生物防治功效的计算
使用以下公式计算疾病严重性指数（DSI）：

DSI

使用以下公式计算生物防治功效（BE）：

BE =

从青枯菌接种后第10天的记录计算各组的DSI和拮抗细菌的BE 。

数据分析

在两次治疗之间对计算的DSI和BE进行单向方差分析，P值小于0.05，以测试治疗组中生防菌的性能。
为了进一步研究对照和不同处理手段之间差异的性质，请在统计上具有显着性的方差分析后执行邓肯多范围测试（DMRT）。
在所有治疗组中对计算出的DSI和BE进行描述性统计（均值和标准误）。
Dat a （图4）可在标题为“ Gnetum gnemon L.的内生菌可以保护幼苗免受植物病原性细菌Ralstonia solanacearum的感染并促进番茄的植物生长”的原始文章中找到；doi：10.1016 / j.micres.2020.126503，发表于微生物学研究（Agarwal等人，2020年）。

图4 。治疗组细菌分离物的生物防治效果和疾病严重程度指数。CK + R ：仅青枯菌处理的对照，GL1 + R ：金沃GL1 +青枯菌，GL3 + R ：芽孢杆菌velezensis GL3 +青枯菌，GL5 + R ：B. velezensis GL5 +青枯菌，GMC2 + R ：乙。velezensis GMC2 +青枯菌。。根据邓肯的多范围测试，不同的小写字母表示处理之间的显着差异（单向方差分析，P <0.05）。该图转载自原始研究文章Agarwal等（略作修改）。（2020），并获得Elsevier的许可。

笔记

通过任何标准方法（如琼脂孔扩散，圆盘扩散或草坪上点样法），至少要重复三遍，才能确认细菌分离株对青枯菌的拮抗能力，然后再开始进行植物生物防治功效测定。
从将种子放在发芽托盘上的那一天开始计算幼苗的年龄。
对于不同的青枯菌拮抗细菌，培养基和最佳生长的孵育条件可能不同。这种变化将不会有任何影响，因为在用无菌水反复洗涤后，所有分离株的细胞数都会被调整，并且细菌细菌会去除培养基污染。
在最初的根部杀菌阶段，再处理一些幼苗，以补偿处理时幼苗的任何损害/死亡。
可以根据需要增加处理组中的幼苗数量，并确保细菌分离物的生物防治功效，至少重复此测定3次。
这种测定不能超过10个d进行AYS张贴青枯雷尔氏菌在番茄接种，如苗（对照组1，表1）无法无任何补充在无菌水中此时间周期之后的维持。直至该苗可以在无菌水维持年龄是考虑尝试这种驴前受一个在其他主机年。

菜谱

酪蛋白p蛋白葡萄糖肉汤（pH 6.5-7.0）（100 ml ）
100毫克阿西切

1克蛋白ept

500毫克葡萄糖

加入蒸馏水至100 ml的体积，并在121°C和15 psi压力下高压灭菌20分钟。

致谢

笔者想感谢教授Suvendra库马尔雷，提斯浦尔大学提供R.菌在本研究中使用F1C1应变。作者对DST Govt表示感谢。印度政府，向开展这项研究工作的高哈蒂大学植物学系提供了DST-FIST支持。利用SERB创建的设施，是由印度政府资助的，授予NA的ECR奖励项目（授权号：ECR / 2017/000710）用于开展研究工作的。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

无需道德许可。

参考文献

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