材料和试剂

75 cm 2细胞培养瓶（Thermo Fisher，目录号：156499）
10厘米长的盘子（Thermo Fisher，货号：150464）
15 ml锥形管（Corning，目录号：352196）
Falcon TM渗透性支持物，用于带有0.4 µm透明PET膜的24孔板（Corning，目录号：353095）
Falcon TM 24孔TC处理过的细胞聚苯乙烯可渗透支撑伴侣板（Corning，目录号：353504）
小家鼠B16F10皮肤黑色素瘤细胞（ATCC，目录号：CRL-6475）
PBS，pH 7.4（Gibco，目录号：10010023）
0.25％胰蛋白酶-EDTA，酚红（Gibco，目录号：25200072）
台盼蓝溶液（0.4％）（Thermo Fisher，目录号：15250061）
带有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI-1640培养基，液体，无菌过滤（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
热灭活胎牛血清（日本生物血清，目录号：S1820-500）（建议测试不同批次）
MEM非必需氨基酸溶液（100×）（Sigma-Aldrich，目录号：M7145）
丙酮酸钠（100 mM）（Gibco，目录号：11360070）
HEPES溶液（1 M）（Sigma-Aldrich，目录号：H3537）
青霉素-链霉素（10,000 U / ml ）（Gibco，目录号：15140122）
2-巯基乙醇（Gibco，目录号：21985023）
L-谷氨酰胺（200毫米）（Lonza，目录号：17-605E）
完整的细胞培养基（请参阅食谱）

设备

移液器
血细胞计数器
保温箱（37 °C，5％CO 2 ）
水浴（37 °C）
锥形台式冷冻台式离心机
倒置显微镜

程序

单细胞悬液制备
在完全细胞培养基中的75 cm 2细胞培养瓶中接种B16F10细胞的早期（3-4）传代。在37°C下孵育，直到细胞达到80-90％融合为止。
除去并丢弃细胞培养基。
由于它包含胰蛋白酶抑制剂，因此用PBS短暂冲洗单层以除去所有痕量的血清。
通过向烧瓶中添加1.0到2.0 ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，从细胞培养瓶的表面上分离粘附的细胞。在37 °C下孵育直至单层分散（通常在5-10分钟内）。在倒置显微镜下监控细胞。
细胞脱离后，通过向8.0 ml完整细胞培养基中添加8.0 （如下所示）来中和胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻地上下吸移混合物，直到细胞悬浮。
旋转下来后，使用血细胞计数器对细胞计数，并进行稀释以使每25μl完整细胞培养基可接种10,000个细胞。

球体的产生
从10厘米的培养皿上取下盖子，并小心地将25μl液滴滴在盖子的内侧。
在滴液分布后，用10 ml PBS填充培养皿底部，以润湿培养室。
以自信但可控的方式翻转盖子。在重力作用下的细胞将聚集在悬滴的底部。确保液滴彼此之间充分分开，并且不要太靠近培养皿边缘。
小心地将培养皿放在培养箱中，最好在开始的2天避免触摸或移动。
改变细胞培养mediu米上的3次和6次的一天中每个液滴。为此，小心地从盘移除盖子并更换大约10微升与10-15使用的介质的微升在每个液滴的新鲜培养基中，为了保持恒定的重量克分子渗透压浓度和营养供应。从液滴边缘更换介质。避免触摸球体。以自信但可控的方式翻转盖子。
在倒置显微镜下监控液滴。注意在移动培养皿时不要干扰液滴。

图2.皮肤黑色素瘤球体的代表性照片。将B16F10黑色素瘤细胞（每25 ul细胞培养基滴入10,000个细胞）装在含PBS的培养皿盖上，孵育3天和7天。物镜放大倍率：3.2倍（下图）。

与免疫细胞共培养
收集球状体由尖端（100或1的宽端，000微升移液管尖端从广泛5-6毫米切割的端部），并转移到合适的细胞培养板中。
通过在细胞培养板的同一孔中将两个组件一个接一个地层叠在一起，或者通过使用带有多孔膜的细胞培养插入物，将球状体与免疫细胞共培养，以保持免疫细胞与球状体分离。

笔记

可以将抗生素（和抗真菌药）添加到PBS中，以最大程度减少球体生成期间细菌（和真菌）的污染。
在更换介质的过程中，一定要准备多余数量的球体，以防某些液滴从盖子上脱落或在盖子表面上滑动。
可能需要更长的孵育时间，但是应评估细胞活力。孵育7天后，我们观察到大约90％的细胞活力。
为了使用其他类型的癌细胞，应调整细胞数量和液滴体积。

菜谱

完整的细胞培养基
RPMI-1640中
10％胎牛血清
100μM MEM非必需氨基酸
10毫米HEPES
100 U / ml青霉素-链霉素
1毫米丙酮酸钠
50 μM2-巯基乙醇
400 μM L-谷氨酰胺

致谢

这项工作得到了挪威研究理事会（302241）向MW的FRIPRO流动性研究金以及日本科学促进会的科学研究补助金（A）（20H00511）的支持。 SK该方案改编自Wagner等人发表的原始研究论文。（2020）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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莫罗（K.），山田（T.），田边（M.），竹内（T.），井川（T.），河本（H.），藤泽（J.），大谷（M.），藤井（H.）和小安（S.） 2010）。脂肪组织相关的c-Kit + Sca-1 +淋巴样细胞先天产生T H 2细胞因子。自然463（7280）：540-544。
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Wagner，M.和Koyasu，S.（2019年）。先天性淋巴样细胞对癌症进行免疫编辑。趋势免疫学40（5）：415-430。