材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有试剂均应在室温下保存。
1. UltraCruz ®放射自显影带（Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：SC-200214）
2.透明的保鲜膜，例如Saran W rap或Glad Cling Wrap保鲜膜
3.剃须刀（Personna Gem，目录号：62-0179或同等产品）
4. 1.7 ml微型管（无菌，无RNase和DNase）（Genesee Scientific，目录号：24-282S）
5. 0.2 ml PCR管（Axygen ，目录号：PCR-02-C）
6. 1.5毫升杵（Fisher Scientific，目录号：12-141-364）
7. 50 ml，0.22微米的Millipore Steriflip过滤系统（Sigma - Aldrich，目录号：SCGP00525）
8. Ultrafree MC离心过滤器（Millipore，目录号：UFC30HV00 ）
9. 8英寸x 10英寸Hyblot CL自动放射胶片（Denville Scientific，目录号：E3018）
10. 14英寸x 17英寸Hyblot CL自动放射胶片（Denville Scientific，目录号：E3031）
11. TranScreen -HE（柯达，目录号：881-1457）
12. 8英寸x 10英寸胶片盒（国际研究产品，目录号：420180）
13. 14英寸x 17英寸胶片盒（国际研究产品，目录号：421417）
14. 8英寸x 10英寸胶片暗盒安全袋（Thomas Scientific，目录号：E3753-1）
15. 14英寸x 17英寸胶片盒安全袋（Thomas Scientific，目录号：E3753-0）
16.待测试的纯化蛋白和特定蛋白的适当温度保存
17.退火至DNA区域5'末端（通常为20-30个碱基对（bp ））的寡核苷酸，用于PCR扩增足迹所需的DNA片段，以50 pmol / μg溶解于ddH 2 O中l并保存在-20 °C （我们建议使用PCR产生200至300 bp的DNA片段。我们从Integrated DNA Technologies获得了寡核苷酸。但是，可以从许多来源购买寡核苷酸。
18.含有蛋白质结合DNA区域的基因组DNA或质粒DNA，可以用作PCR扩增的模板，以100 ng / ml的浓度溶解于ddH 2 O或TE（参见下文）中，并以4 °C（基因组DNA）或-20 °C （质粒DNA）
19. [ γ - 32 P] -ATP（3 ，000次/毫摩尔，10毫居里/毫升，250 μ次）（珀金埃尔默，目录号：BLU002A;贮存于-20 ℃下）
20. Optikinase （10U / μ升）和10 X Optikinase缓冲液（USB Affymetrix公司，目录号：78334Y;贮存于-20 ℃下）
21.的Pfu涡轮聚合酶（2.5 U / μ升）和10倍的Pfu缓冲液（安捷伦科技目录号：600252;贮存于-20 ℃下）
22. dNTP混合物（New England Biolabs ，目录号：N0447，10 mM ；存储在-20 °C ）
23. DNA酶I（2 U / μ升）和10×DNA酶I缓冲液（Life Technologies公司，目录号：AM2222;存储在-2 ℃下）
24.肝素（Sigma公司- Aldrich公司，目录号：H3149，500 μ克/ ml的溶解在灭菌蒸馏水2 O;储存在-20 ℃下）
25.聚（脱氧肌苷-脱氧胞苷）（Poly（dI-dC ））酸钠盐（Sigma - Aldrich，目录号：P4929，1 mg / ml溶于ddH 2 O；在-20 °C储存）
26.尿素超纯（Invitrogen，目录号：15505-050）
27.凡士林
28.大型活页夹
29. 40％的19：1丙烯酰胺：双溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610144;储存在4 °C ）
30. 40％37.5：1丙烯酰胺：双溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610148;储存在4 °C ）
31.四甲基乙二胺（TEMED）（Bio-Rad实验室，目录号：1610800；在4 °C下储存）
32. pH 8.0的TE饱和苯酚（Sigma - Aldrich，目录号：77607；在4 °C下储存）
33.苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1 v / v，pH 7.9 ）（Life Technologies，目录号：AM9732;储存在4 °C ）
34. 190标准乙醇（华纳－格雷厄姆公司；在-20 °C下储存）
35.引出塑料吸管（Fisher Scientific公司，目录号：13-711-27）
36. GlycoBlue TM共沉淀剂（Invitrogen，目录号：AM9515；在-20 °C储存）
37. 10x TBE Buffer（Quality Biological，目录号：351-001-131）
38. 50x TAE Buffer（Quality Biological，目录号：351-008-131）
39. TE pH 8.0（质量生物学，目录号：351-011-131）
40. 0.5 M EDTA，pH 8.0 （Quality Biological，目录号：351-027-101）
41.甲酰胺（西格玛- Aldrich公司，猫考勤号码：47670）
42. 1-丁醇（Fisher Scientific，目录号：A399-500）
43. 3 M醋酸钠（Sigma - Aldrich，目录号：71196）
44.干冰
45.用于天然凝胶的6x染料加载溶液（Fermentas ，目录号：R0611）
46.二甲苯氰（XC）染料（Sigma - Aldrich，目录号：X4126）
47.溴酚蓝（BPB）染料（Sigma - Aldrich，目录号：B0126）
48. AG ® 501-X8（d）混合床树脂（Bio-Rad实验室，目录Ñ棕土：1426425）
49.鲑鱼精子DNA（Sigma - Aldrich，目录号：D1626； 10 mg / ml，5 mg / ml和1 mg / ml溶于ddH 2 O；在-20 °C下保存）
50. ddH 2 O
51. APS（Bio-Rad实验室，目录号：1610700）
52.醋酸铵（Sigma - Aldrich，目录号：A7330）
53.氯化钙二水合物（西格玛- Aldrich公司，目录号：C3306）
54.高锰酸钾4 （西格玛- Aldrich公司，目录号：223468 ）
55.四水合醋酸镁（Sigma - Aldrich，目录号：M5661）
56.甲酸库存（88％）（Sigma-Aldrich，目录号：399388）。在ddH 2 O中稀释4％（请参阅食谱）
57. 50 mM KMnO 4 （高锰酸钾）（请参阅食谱）
58. 10％过硫酸铵（APS）（请参阅食谱）
59. 10 M醋酸铵（请参阅食谱）
60. 1 M醋酸镁（请参阅食谱）
61. 20％SDS（质量生物学，目录号：351-066-721）；1％SDS稀释在dd H 2 O中（请参阅食谱）
62. 2 mM CaCl 2 （氯化钙）（请参阅食谱）
63.哌啶储备液（10 M）（Sigma-Aldrich，目录号：104094）；在ddH 2 O中稀释2 M和100 mM （请参阅食谱）
64.甲酰胺负载染料；储存在-20 °C （请参阅食谱）
65. 2-巯基乙醇储备液（14.3 M）（Sigma - Aldrich，目录号：M3148）。在ddH 2 O中稀释1 M （请参见配方）
66. 70％乙醇（请参阅食谱；在-20 °C下储存）
67.扩散缓冲液（请参阅食谱）

设备

适用于32 P放射性的工作空间
盖革计数器监测放射性和污染
有机玻璃防护罩可保护用户免受放射性伤害
用于32 P废物的有机玻璃盒子
150 ml，0.22微米过滤器设备（Nalgene，目录号：125-0020或同等产品）
PCR机
Vortex（例如Vortex Genie 2，Scientific Industries）
加热块可以加热到95 ° C
垂直凝胶盒-中等大小（〜7” W X〜9” H）（如科尔-帕克垂直单可调平板凝胶系统，目录号：EW-28570-00或Hoefer说TM风冷垂直电泳单位，目录号：SE400 ）
垂直凝胶箱-大尺寸（〜14” W X〜17” H）（如LABRepCo模型S2测序凝胶电泳装置中，目录号：21105036或BTLab系统核酸测序电泳细胞（330 X 420毫米），目录号：BT210 ）
Elutrap电洗脱系统（GE Healthcare，目录号：10447711）
电泳电源盒（Bio-Rad实验室）
小型微量离心机，例如Benchmark MyFuge Mini，可在6,000 rpm / 2,000 xg的转速下旋转
台式微量离心机，如Eppendorf离心机5425，可以在旋转≥ 14000 ×g下（微量离心，目录Ñ棕土：5405000646）
速度真空（瓦特E使用热电Electron公司萨文特DNA 120 SpeedVac中的系统，其速度是1600转;热电飞世尔科技，产品目录号：13442549）
闪烁计数器
胶片显影剂（或phosphoimager ）
密度计扫描放射自显影[瓦特ë使用GS-800校准的成像密度计从Bio-Rad实验室，目录号：170-7983（停产）; 新型号是GS-900，目录号：170-7989 ]
带有垫片和梳子的玻璃板，适合中型凝胶设备（Gel Company；我们建议凝胶厚度为1 mm）
带有垫片和梳子的玻璃板，适合大型凝胶设备（Gel Company；我们建议凝胶厚度为1 mm）

软件

软件来操作密度（我们使用数量一从Bio-Rad实验室，目录号：1709601）

程序

除非另有说明，否则所有反应均在冰上组装，并在室温下进行离心。
当使用32 P时，请使用安全规程处理放射性，检查表面是否受到污染以及废物处置。我们建议使用不含RNase / DNase的无菌ddH 2 O溶液，并采取适当的预防措施以最大程度地减少DNase污染的可能性。

使5 ' - 32 P DNA末端标记任一上的非模板或模板链
激酶反应：5'- 32 P末端标记模板或非模板链寡核苷酸。
在0.2 ml PCR试管中，合并以下各项：
7 μ升[ γ - 32 P] -ATP
1 μ升Optikinase酶
1 μ升10X Optikinase缓冲
1 μ升的寡核苷酸（50皮摩尔/ μ升）
在37 ° C下孵育30分钟。通过在65 ° C下孵育10分钟来灭活酶。
组装PCR反应。
在激酶反应中添加以下内容：
76 μ升的DDH 2 ö
10 μ升10X的Pfu缓冲
1个μ升10毫dNTP混合物
1 μ升质粒DNA或gDNA的（100毫微克/毫升）
1 μ升其它（非标记）寡核苷酸（50皮摩尔/ μ升）
1 μ升的Pfu涡轮酶（2.5 U / μ升）。
通过以下循环进行PCR生成标记的DNA片段：
95 ° C 2分钟使DNA变性
95 ° C 30秒
（m-5 ° C）*的温度持续30 s
72 ° C 30秒
重复步骤bd 25-35个循环
72 ° C 10分钟
4 ℃储存。
* m-5 ° C –比最低引物熔化温度低5 ° C的温度。
前一天，为中型凝胶仪准备4％聚丙烯酰胺凝胶，以确保凝胶完全固化并提高分离度。
使用凡士林组装玻璃板，以密封侧面和底部垫片和大号活页夹的角，从而将玻璃板固定在一起。
掺在一起：
4 ml 40％丙烯酰胺：双19：1
34.8毫升ddH 2 O
0.8毫升50 x TAE
0.4毫升10％APS
通过150毫升0.22微米的过滤器过滤溶液。添加12 μ升TEMED到滤液中，轻轻涡旋混合（避免引入气泡），并立即倒入凝胶和插入梳子。用保鲜膜小心地盖住梳子区域。在凝胶顶部的保鲜膜上使用粘合剂夹，以在玻璃板和梳子之间形成紧密密封。让凝胶在室温下固化过夜。
在4％垂直聚丙烯酰胺凝胶上电泳PCR生成的标记DNA片段。
将凝胶放入中等大小的凝胶仪器中。移开梳子后，用永久性标记物标记玻璃板前面的孔位置。（这显着改善了加载过程中的插槽可视化。）将凝胶在100 V的1x TAE中预运行1 h。将6倍染料加载溶液添加到PCR样品体积中。将所有样品上样到凝胶上。在1x TAE中以140 V运行，直到6x加载染料的BPB组分距起点约13 cm（约2 h）。
从凝胶中消费已标记的DNA。
拆除凝胶。卸下顶部玻璃板。用保鲜膜包裹底板/凝胶。用放射自显影带标记塑料包裹的凝胶的角。请遵循有关标记磁带的说明。将凝胶暴露在薄膜上几分钟。（大约2-3分钟就足够了。）冲洗胶片并通过将胶片与仍包裹的凝胶对齐来确定放射性标记DNA在凝胶上的位置。使用剃须刀在显影的胶片上切出所需的标记的DNA带，以制成模具。将模板对准塑料包裹的凝胶。使用模板，用永久性标记在塑料包装的凝胶上标记标记的DNA的位置。带有剃须刀的消费品乐队。对每个样品使用干净的剃刀。从凝胶上切下标记的DNA后，一定要除去保鲜膜。移开切片时注意凝胶的方向（-与+末端）。
通过电洗脱分离标记的DNA 。
按照说明手册组装Elutrap 。用½X TAE填充室。以与凝胶电泳相同的方向加载切下的标记DNA。（确保凝胶的“ –”端朝向Elutrap的“ –”端，凝胶的“ +”端朝向Elutrap的“ +”端。）在200 V下电泳1 h。收集含有标记DNA的溶液，并将其放入1.7 ml微管中。重复电泳，收集溶液，然后将其添加到同一管中。
沉淀标记的DNA。
Evapo速率标记的DNA溶液至约200 μ升的速度真空。（注意：这可能需要一个小时或更长时间；请使用环境温度设置，并且不要打开热量以加快干燥速度）。加入200 μ升酚（TE饱和的）。混合30 s，在小型微量离心机中以2,000 xg离心1分钟，然后将顶层（水层）中的标记DNA转移至干净的微管中。将5x体积的190标准乙醇和1/4体积的10 M乙酸铵添加到含有标记DNA的苯酚萃取水层中，充分混合，然后在干冰上孵育1 h或在-20 ° C过夜。离心机在台式微量离心机在最高速度（≥ 14000 ×g下）30分钟，用拉出吸管除去乙醇溶液中，并洗涤沉淀的标记的DNA沉淀与100 μ升冰冷的70％乙醇。如上离心5分钟，除去70％乙醇，并在室温下以高速真空干燥标记的DNA 2-3分钟。重悬沉淀在20 μ升TE。这假定32 P掺入DNA的10％至40％，产率> 25％。然而，如果需要，掺入速率和产率可以通过使用TCA（定量三氯酸）沉淀（小号ee值这里）。

准备一个G + A测序阶梯（Maxam and Gilbert，1977）
在1.7 ml微量管中，合并以下内容：
1点μ升标记的DNA
1 μ升1mg / ml的鲑鱼精子DNA
8 μ升TE
加入1和μ升4％甲酸（见ř ecipes）。
在37 °C下孵育45分钟。
置于冰上管，加入150 μ升的2M哌啶（见ř ecipes）。
在90 °C下孵育30分钟。
置于冰上管，并加入5 μ升10毫克/毫升鲑鱼精子DNA。
加入1毫升1-丁醇，涡流以充分混合，然后离心在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心5分钟。小心取出并丢弃上清液。
注意：由丁醇沉淀形成的丸粒有从试管侧面浮起的趋势，因此确保除去上清液时不要丢弃丸粒，这一点很重要。
添加150 μ升1％SDS于粒料（见ř ecipes）。
加入1ml丁醇，涡流以充分混合，然后离心在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心5分钟。小心取出并丢弃上清液。
洗涤沉淀两次用0.5毫升丁醇，离心1分钟在台式微量离心机在≥ 14000 ×g下每次洗涤后。小心取出并丢弃上清液。
在室温下以vac-vac干燥沉淀1-2分钟。
添加10 μ升甲酰胺负载溶液溶解并储存在-20 ℃下。

进行DNase I或KMnO 4反应
注意：蛋白质和特异性结合缓冲液的量将取决于所用蛋白质。首先，请使用您知道蛋白质活跃的条件或参阅Boulanger等人中列出的条件。（2015）和Hsieh等。（2018和2020）。
DNase I反应
在总共10 μ升体积，感兴趣孵育蛋白（或作为阴性对照只是蛋白质的缓冲液），标记的DNA，并且所述蛋白质结合到DNA结合缓冲液为宜。此外，缓冲液应含有2 mM CaCl 2以用于DNase I活性。温度应适合所测试的蛋白质，但通常在室温至37 °C之间。我们建议每个反应使用0.1至0.5 pmol的DNA。之比亲TEIN：DNA可根据被测试什么条件来改变。为了获得良好的结合，我们建议至少要比标记的DNA多5至10倍过量的蛋白质。为了消除不稳定和非特异性复合物，我们也建议在加入1的μ升1毫克/毫升的聚（DI-DC ）在结合反应或0.5至1 μ升的500 μ克/ ml肝素的结合反应之后完成了。稀释股票DNA酶I酶（2U / μ升在1×DNA酶I）缓冲剂配制至所需浓度。我们建议尝试一定范围的DNase I浓度。我们以前总共使用了约0.3U。以引发DNA酶I反应，加1 μ升稀释DNA酶I酶（或1 μ升1×DNA酶I缓冲液作为对照）。最终反应体积为11 μ升。反应也可以扩大规模。通过用手指在试管上轻敲2-3次来混合反应成分，然后使用小型微量离心机以2,000 xg的速度快速离心样品。该步骤仅需约15 s。将样品置于37 ° C加热块中，孵育30 s。（如果需要更多或更少的裂解，可以改变这个时间。）立即将样品加载到已经以100 V / h运行的凝胶上。参见下面：步骤D3 。
高锰酸钾4 reactio NS
感兴趣孵育蛋白（或作为阴性对照只是蛋白质的缓冲液中）与一个标记的DNA适当的结合缓冲液（10 μ升在37总体积）° C至开始形成的DNA的单链区，诸如在使用RNAP时的开放转录复合体。我们建议使用0.1至0.5 pmol的标记DNA。在该温育，竞争对手，诸如肝素（1之后μ升的500 μ克/ ml溶液），可与约1分钟的额外温育被添加到除去不稳定的复合物。添加0.5 μ升50毫的KMnO 4 （参见ř ecipes）（或0.5 μ升的的DDH 2 O作为阴性对照）。确保在使用当天制作KMnO 4溶液。温育在37 2.5分钟° C.淬灭反应，加入5 μ升的1M 2-巯基乙醇（见ř ecipes）。立即将样品加载到已经以100 V / h运行的凝胶上。参见下文：步骤D3。

在4％丙烯酰胺天然凝胶上电泳DNase I处理或KMnO 4处理的复合物
前一天准备用于大型凝胶设备的4％聚丙烯酰胺凝胶，以确保凝胶完全固化并提高分辨率。
使用凡士林组装玻璃板，以密封垫片和大的活页夹的角，以将玻璃板固定在一起。
掺在一起：
12 ml 40％丙烯酰胺：bis 37.5：1
12毫升10x TBE
95.28毫升ddH 2 O
0.72毫升10％APS。
通过150毫升0.22微米过滤器过滤溶液。除去4毫升凝胶溶液中，添加4 μ升TEMED该等分试样，拌匀，并倒入平板。一旦为插头的凝胶固化的该部分（〜15分钟），加入20 μ升TEMED剩余凝胶溶液，通过反转拌匀，但不要引入气泡。立即倒入盘子。轻敲玻璃板上的气泡以清除所有气泡。将其水平放置在支架上，然后立即插入梳子。用保鲜膜小心地盖住梳子区域。在凝胶顶部的保鲜膜上使用粘合剂夹，以在玻璃板和梳子之间形成紧密密封。使凝胶在室温下固化过量。
在100 V / h下预电泳2小时。（请确保使用永久性标记在玻璃板正面的孔位置上进行标记。这显着改善了装载期间的插槽可视化。）
当凝胶以100 V / h的速度运行时，在一个泳道中加载一个反应的所有样品。为了确保良好的分离，在加载每个新样品时跳过一个泳道。（如果需要更多样品，可以将相同的反应进行多次并加载到多个泳道中。在切下凝胶切片后将产物合并。）
在380 V下运行凝胶3小时。
拆除凝胶。取下顶板，并用保鲜膜包裹凝胶/底部板。

从4％丙烯酰胺天然凝胶中分离并提取ct标记的DNA
用放射自显影带标记塑料包裹的凝胶的每个角。这将有助于模板对齐。
将未曝光的胶片放在暗室胶卷暗盒中的凝胶上。
将胶片曝光过夜。
冲洗胶卷。
详见在步骤A6使模版，但是在这种情况下，切出的游离的标记的DNA条带，并从膜中任何所希望的配合物两者。采取获得所有放射性所需的最小量的凝胶。切片的宽度通常约为4-5毫米（凝胶泳道的宽度），长度约为3毫米。但是，如果需要，可以采用更长的切片。乙Ë确保标签。
将每个凝胶切片放入一个空的1.7 ml微型管中。
在微管中用1.5毫升的杵粉碎聚丙烯酰胺凝胶。
加入200 μ升扩散缓冲液（见ř每切片带ecipes）。（如果将多个切片合并，则添加适当量的扩散缓冲区。）
将试管在60 ° C下孵育至少2 h或在室温下孵育过夜。
离心机在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心5分钟。
用移液器吸头倾析或小心除去溶液。
将溶液转移至MC离心过滤器。
离心在台式的MC离心过滤器的离心在≥ 14000 ×g离心5分钟以除去聚丙烯酰胺的痕迹。
将流通液转移到干净的1.7 ml微管中。
在高速真空，减少体积至约200 μ升对于DNA酶I反应和〜100微升为的KMnO 4个反应，如果必要的话。
注意：这可能需要一个小时或更长的时间；请使用环境温度设置，请勿打开热量以加快干燥。
对于DNase I反应，可通过苯酚提取溶解。加入200 μ升苯酚：氯仿：异戊醇，在小混合30秒，离心分离机的离心在2000 ×g下进行1分钟，和含有该标记的DNA的顶部（水溶液层）转移到一个干净1.7毫升微型管。
乙醇沉淀DNA。加入5倍体积的190标准乙醇，10μM的乙酸铵¼DNA体积（见ř ecipes），和1 μ升GlycoBlue在干冰上苯酚萃取水层DNA，拌匀，孵育1个小时或在-20 °下过夜，离心分离机在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心30分钟，除去乙醇/醋酸铵/ GlycoBlue与引出吸管溶液，洗涤标记的DNA沉淀与100 μ升冰冷的70％乙醇，离心如上5分钟，除去70％的乙醇，并在室温下真空高速干燥2-3分钟。
在F或KMnO 4反应中，乙醇沉淀标记的DNA。在-20添加10倍体积的190标准乙醇，搅拌均匀，孵化°下进行20分钟，在离心机台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心20分钟，用拉出吸管除去乙醇溶液，洗标记的DNA沉淀与100 μ升冰冷的70％乙醇，离心分离机在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心5分钟，除去70％乙醇，并在高速真空干燥2-3分钟。重悬沉淀在100 μ升100毫哌啶（见ř ecipes）孵育，在90 °下进行30分钟，以进行裂解反应。之前置于冰上5分钟，将样品在加入2的μ升5毫克/毫升鲑鱼精子DNA的。加入1毫升1-丁醇，涡旋样品以充分混合，并离心在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心5分钟（注意：由丁醇沉淀形成的颗粒具有从管的一侧漂走的倾向，因此是重要确保除去上清液当团粒是不被丢弃。）。W¯¯灰与10 μ升1-丁醇，自旋在台式微量离心机在≥ 14000 ×g离心5分钟，并移除丁醇洗涤。在高速真空下干燥样品2-3分钟。重悬沉淀在18.75 μ升TE和6.25 μ升3M乙酸钠。如步骤17所述，重复进行乙醇沉淀。
重悬在10粒料μ升甲酰胺上样染料（见ř ecipes）。
在闪烁计数器中计数样品。

在8％变性测序凝胶和图像凝胶上电泳标记的DNA和G + A阶梯
前一天准备针对大型凝胶设备的8％变性变性测序凝胶，以确保凝胶完全固化并提高分离度。
使用凡士林组装玻璃板，以密封垫片和大的活页夹的角，以将玻璃板固定在一起。
合并在250毫升的烧杯中：
24 ml 40％丙烯酰胺：双19：1
53.3克尿素
50.3毫升ddH 2 O
1克混合床树脂
将烧杯置于37 ° C直至所有尿素溶解（这可能需要≥20分钟）。混合床树脂将保留。旋转混合，然后通过150毫升0.22微米过滤器过滤。向滤液中加入6 ml 10x TBE和0.72 ml 10％APS。通过加入4倒入凝胶“插头” μ升TEMED至4毫升上述凝胶溶液。充分混合并倒入玻璃板中。等待固化（〜15分钟）。添加20 μ升TEMED剩余凝胶溶液，以及通过反转混合，但不引入气泡。立即倒胶。轻敲玻璃板上的气泡。将水平放置在支架上，然后立即插入梳子。用保鲜膜小心地盖住梳子区域。在凝胶顶部的保鲜膜上使用粘合剂夹，以在玻璃板和梳子之间形成紧密密封。让凝胶在室温下固化过夜。
在500V进行预运行凝胶≥ 30分钟，750伏为≥ 30分钟，然后1 ，000 V为≥ 30分钟以½ X TBE。
注意：请确保使用永久性标记在玻璃板前面的孔位置进行标记。这显着改善了加载期间的插槽可视化。
停止运行前凝胶。在95 ° C下加热样品2分钟。在这段时间内，使用抽出的移液器用运行缓冲液冲洗每个孔，以除去扩散到孔中的所有尿素。
加载样品（以及G + A梯道以确定DNA的序列）。在每个通道中加载大约相同的cpm （基于闪烁计数器值）。我们建议每个泳道至少加载8,000个计数。可以使用较少的量，但需要延长胶片的曝光时间。
在1运行凝胶，000 V /为〜3小时小时。（确切的时间将取决于标记的DNA区域，该区域需要具有最大的分辨率才能观察到足迹）。
从设备上去除凝胶。取下顶板，并用保鲜膜包住凝胶/底部板。
将未曝光的胶片放在暗室中的塑料包装的凝胶/底板上，并将凝胶板/凝胶/胶片存放在放在-80 ° C冰箱的暗盒安全袋中的暗盒中。为了帮助减少静电，您还可以在未曝光的胶片和塑料包裹的凝胶之间添加一个额外的曝光的胶片。可替代地，可以代替地使用磷光体成像屏幕和磷光体成像器。
所需的天数后，从凝胶上除去薄膜并显影。如果需要其他曝光，请添加新胶卷。如果信号微弱，并且需要信号放大，请考虑使用TranScreen 。
在密度计上扫描放射自显影照片。我们使用Bio-Rad Laboratories的GS-800密度计。

菜谱

我们建议使用不含RNase / DNase的无菌ddH 2 O溶液，以最大程度地减少RNase或DNase污染的可能性。除非另有说明，否则溶液是在室温下制备和储存的。
4％甲酸
9.1 μ升88％库存加上190.9的μ升的DDH 2 ö
注：中号使用前阿克新鲜的权利。
1％SDS
7.5 μ升的20 ％SDS库存加上142.5 μ升的DDH 2 ö
10％APS
1克过硫酸铵溶于10毫升ddH 2 O
溶液在使用前新鲜配制。
甲酰胺加载染料
混合1毫升去离子甲酰胺和10 μ升XC的饱和溶液和10 μ升饱和溶液BPB。溶液可以在-20 °C下保存1周。
注意：要的去离子甲酰胺，加入约0.5克AG ® 501-X8（d）的混合床树脂到5ml的甲酰胺使用0.22微米微孔在室温下，温育至少10分钟，和过滤器Steriflip 。要制成XC或BPB的饱和溶液，请向无菌的1.7 ml试管中加入约0.2 g的染料，并加入1 ml的ddH 2 O，剧烈涡旋，并使用小型微量离心机以2,000 xg的速度进行短暂离心，以沉淀未溶解的粉末。除去10 μ升从剩余的粉末上方的液体添加到升ö ading色素溶液。
10 M醋酸铵
将77 g乙酸铵溶于100 ml ddH 2 O，并用0.22微米过滤器过滤
2毫米CaCl 2
将0.029 g脱水氯化钙溶于100 ml ddH 2 O中，并用0.22微米过滤器过滤
50毫米KMnO 4
对于250 mM的储备液，将3.95 g KMnO 4溶解在100 ml ddH 2 O中
注意：可以在室温下保存数周。
对于50毫米的KMnO 4 ，应在使用的当天新鲜制，混合10 μ升250毫米的KMnO 4与40 μ升的DDH 2 ö
100 mM哌啶
注意：溶液在使用前是新鲜配制的。
10 μ升的哌啶股票（10 M）
990 μ升的DDH 2 ö
2 M哌啶
注意：溶液在使用前是新鲜配制的。
30 μ升的哌啶原料（10 M）
120 μ升ħ 2 ö
1 M 2-巯基乙醇
注意：溶液储存在-20 °C ，可解冻/冷冻数月。
7 μ升的2-巯基乙醇的库存（14.3 M）
93 μ升的DDH 2 ö
1 M醋酸镁
将21.45 g四水合乙酸镁溶解在100 ml ddH 2 O中，并用0.22微米过滤器过滤
70％乙醇
注意：溶液在使用前是新鲜配制的。
7.37毫升190标准乙醇
2.63毫升ddH 2 O
扩散缓冲液（100毫升）
0.5 M醋酸铵（5 ml 10 M醋酸铵）
10 mM醋酸镁（1 ml 1 M醋酸镁）
1 mM EDTA，pH 8.0（0.2 ml的0.5 M EDTA，pH 8.0）
0.1％SDS（0.5 ml的20％SDS库存）
ddH 2 O（93.3 ml ddH 2 O）

Acknowled克È换货小号

资金来源包括美国国立卫生研究院（NIH）[F30GM123632至MLH]；密歇根州立大学DO / PhD计划（MLH）；美国国立卫生研究院（NIH）的壁内研究计划，美国糖尿病与消化，肾脏疾病研究所（针对MLH，ABC，LGK和DMH）。协议基于先前发表的论文（Boulanger等，2015； Hsieh等，2015； Hsieh等，2020）。

利益争夺

对于任何作者来说，都没有经济或非金融竞争利益。

参考文献

Boulanger，A.，Moon，K.，Decker，KB，Chen，Q.，Knipling ，L.，Stibitz ，S. and Hinton，DM（2015）。百日咳博德特氏菌FIM3基因调控由BvgA ：磷酸化控制无活性与活性转录复合物的形成。PROC国家科科学院科学USA 112（6）：E526-535。
Galas，DJ和Schmitz，A。（1978）。DNAse足迹：检测蛋白质-DNA结合特异性的简单方法。 Nucleic Acids Res 5（9）：3157-3170。
汉普郡（AJ），鲁斯林（Rusling），DA，布劳顿-海德（Broughton-Head），VJ和福克斯（KR）（2007）足迹：一种确定DNA结合配体的序列选择性，亲和力和动力学的方法。方法42（2）：128-140。
Hsieh，ML，Waters，CM和Hinton，DM（2020）。VpsR直接激活霍乱弧菌多个生物膜基因的转录。Ĵ细菌学202（18）：e00234-20。
Hsieh，M. L.，Hinton，DM和Waters，CM（2018）。VpsR和环状双GMP共同驱动转录起始，以激活霍乱弧菌的生物膜形成。核酸研究。46 （17）：8876-8887。
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