材料和试剂

1.高精度盖玻片，12毫米1.5号（Marienfeld ，目录号：0117520）
2.显微镜载玻片，76×26毫米（任何商业可用的，例如，Marienfeld的，目录号：1000200）
3. 6-或10- 10cm细胞培养皿（任何商购的，例如，热，目录号：150288或格雷纳乙IO- ø NE ，目录号：分别664160，）
4.湿室（例如，湿的Whatman纸在10或15厘米的细胞培养皿中被封口膜覆盖）（无菌）
5.定制的重组蛋白或肽（荧光标记或适当标记用于免疫染色）
6. Milli -Q水
7. HEPES （任何商购的，例如，Sigma，目录号：H3375）
8.乙酸钾（任何市售品，例如，Roth，目录号：T874.2）
9.乙酸镁（任何市售产品，例如，MERCK，目录号：7463348）
10. EGTA（任何商购的，例如，GERBU，目录号：1310）
11.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（任何市售品，例如，R oth ，目录号：3904.1）
12.磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 3 ħ 2 O）（任何商购，例如，- [R OTH ，目录号：6878.1）
13.氯化镁氯化镁（MgCl 2 ）（任何商购的，例如，Sigma，目录号：M2670）
14.氯化钠（任何市售品，例如，Roth，目录号：0601.2）
15.氯化钾（KCl的）（任何可商购的，例如，- [R OTH ，目录号：6781.1）
16.磷酸氢二钠（Na 2 H PO 4 ）（任何市售品，例如，R oth ，目录号：P030.2）
17. DMSO（Sigma，目录号：D2438）
18. MG-132（在DMSO中为10 mM）（Sigma，目录号：C2211）
19. DMEM高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Invitogen ，目录号：61995059）
20. 10倍胰蛋白酶-EDTA（Sigma，目录号：59418C）
21.无菌PBS溶液（请参阅解决方案）
22.胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Invitogen ，目录号：10270-106）
23.庆大霉素（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitogen ，目录号：15710049）
24.毛地黄皂苷，高纯度的（中号ilipore ，CAS ：11024-24-1）
25.台盼蓝溶液（Thermo Fisher Scientific，Invitogen ，目录号：152 500 61 ）
26.小麦胚芽凝集素（WGA）（普通小麦的凝集素）溶液（Sigma ，目录号：A2408）
27. 37％甲醛（AppliChem，目录号：131328.1211）
28. TX-100（任何商购的，例如，APPLICHEM，目录号：9002-93-1）
29.血清匹配物种，所述的二级抗体升高在，例如，驴血清（Milipore ，目录号：S30）
30.吐温20（Roth，目录号：9127.2）
31. DAPI（Sigma，目录号：D9542）
32. ProLong钻石抗褪色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitogen ，目录号：P36961）
33. DL-二硫苏糖醇（DTT，Applichem ，目录号：A1101.0025）
34.抑肽酶（Roth，目录号：A162.2）
35.亮丙素半硫酸盐（Roth，目录号：CN33.2）
36.抑肽酶A（Roth，目录号：3083.2）
37. 0.1％（w / v）聚L-赖氨酸溶液（Sigma，目录号：P8920）
38.抗体，以检测SG核心部件，例如，兔抗G3BP1抗体（P rotein Ť ECH ，目录号：13057-2-AP）
39.可选：用于检测重组蛋白标签的抗体，例如，小鼠抗MBP抗体（ProteinTe ch ，目录号：66003-1-1g）
40.可选：蛋白质标记试剂盒（任何市售产品，例如，Thermo Fisher Scientific，Invitogen ，目录号：46403）
41.荧光标记的次级抗体（例如，驴抗兔Alexa 555或Alexa 647；Thermo ，目录号：A-31572或A-31573；驴抗小鼠A-21202）
42. DMEM / 10％FBS /10μg/ ml的庆大霉素（见ř ecipes）
43. 1X胰蛋白酶/ EDTA（见ř ecipes）
44. 10毫MG-132在DMSO中（参见[R ecipes）
45.反应缓冲液，无论是传送缓冲器（TPB）或磷酸钾缓冲液（KPB）（见ř ecipes）
46. 10％毛地黄皂苷/反应缓冲液（见ř ecipes）
47. 2mg / ml的WGA在反应缓冲液（参见ř ecipes）
48.在PBS中的3.7％甲醛（见ř ecipes）
49. 10％和0.5％TX-100 / PBS溶液（见ř ecipes）
50. PBS / 0.1％吐温20（参见ř ecipes）
51.在PBS / 0-1％吐温的或替代的封闭溶液1％驴血清用于免疫染色（见ř ecipes）
52. DAPI溶液（见ř ecipes）

设备

P1000 ，P200，P20，P10吸管小号
细尖弯曲镊子
细胞培养罩
CO 2培养箱
pH计
V acuum泵
Ø ptional：直立式显微镜明显微镜
Ç onfocal扫描显微镜（例如，徕卡SP8用63X / 1.4油物镜或等同物）装配有匹配的选择的二级抗体和蛋白质/肽标记的激光线。通过标准光电倍增管（PMT）进行的检测已足以可视化和量化我们手中SG的蛋白质定位。

软件

LASX软件（Leica）
斐济/ ImageJ（NIH，https： //imagej.net/Fiji ）
Excel（微软）
GraphPad Prism（GrapPad ）

程序

通过从细菌（或等效表达系统）建立的纯化方案来制备选择的重组蛋白
对于随后的检测时，蛋白质要么被融合到一个荧光蛋白（例如，绿色荧光蛋白）或合适的FO另一个标记- [R后续免疫染色。我们在使用MBP标签方面拥有丰富的经验，因为它还可以作为易聚集蛋白的溶解性标签，并且不会干扰SG募集。或者，也可以使用市售的标记试剂盒标记蛋白质。可以通过荧光标记购买肽。
笔记：
重组蛋白质应该是高纯度的，即，自由RNA（的阿2 6 0 / 2 8 0比〜0.6〜0.7）和污染性蛋白质和/或降解产物的。不需要去除内毒素。
为了避免测定缓冲液组成的重大变化，需要考虑根据存储缓冲液和蛋白质/肽原液的浓度，可以将额外的盐引入反应中。如果可能，将重组蛋白透析到测定缓冲液中。或者，制备高浓度的蛋白质/肽储备液（例如，≥100x ）可以帮助防止最终测定中的非生理盐浓度。
高浓度清洁剂的存在可能会干扰细胞生理和核膜的完整性。因此，存储缓冲液不应包含任何去污剂以改善蛋白质/肽的溶解度。
蛋白质储存缓冲液中的蛋白质稳定剂（例如甘油或蔗糖）不会干扰我们手中的测定，前提是蛋白质储备足够高的浓度（请参见上文第2点）。

用聚-L-赖氨酸涂盖玻片（可选； 30-60分钟）
注意：如果使用粘附良好的细胞系（例如HeLa细胞），则可以省略此步骤。但是，它可以改善盖玻片上的细胞保留能力，从而增加细胞数量以用于后续分析。
在细胞培养罩中无菌条件下工作。
直接在适当的细胞培养皿中（如果随后直接使用）或在细胞培养皿中的封口膜（如果事先准备）上铺开盖玻片。如果盖玻片不被认为是无菌的，则将它们浸入70％乙醇或无水异丙醇中一次，然后在细胞培养皿中（在封口膜上）散布它们。等待EtOH /异丙醇蒸发，然后继续。
使用P1000移液器用0.1％聚L-赖氨酸溶液覆盖每个盖玻片，并在室温下孵育20-30分钟。
使用P1000移液器收集聚L-赖氨酸溶液（该溶液最多可重复使用4次）或使用真空泵抽吸。
用无菌M illiQ水覆盖盖玻片一次。
吸水，使盖玻片干燥。盖玻片可以存放在干燥阴暗的地方长达2周。或者，如果要直接接种细胞，则用3 ml培养基（在6 cm皿中）冲洗盖玻片一次（步骤C）。

将细胞接种到盖玻片上（15-20分钟）
估计HeLa细胞培养物的融合度。
吸出培养基并用无菌PBS轻轻洗涤一次。使用预热的1x胰蛋白酶并在37°C下孵育2-5分钟，吸出PBS并从培养皿中分离细胞。将细胞重悬在完全适当的培养基（例如，DMEM，补充有10％FBS和10μg/ ml庆大霉素），以抑制胰蛋白酶活性，并实现单细胞小号在悬浮液中。
注意：为了确保最佳的和等于透所有细胞，它避免细胞簇，将与有效的干扰是很重要的透通过毛地黄皂苷。另外，细胞密度应保持每次重复到英里之间相似NI细胞迈兹变异透。
按照标准程序（例如，血细胞计数器）或基于细胞融合度计算细胞浓度。将种子细胞接种到（盖有聚L-赖氨酸的盖玻片上）盖玻片上，以使它们在测定时达到约60％的融合度（例如，HeLa细胞每20-23小时加倍，因此以约30％的融合度接种）。确保该盖玻片不浮在介质上。
让细胞粘附在盖玻片上（过夜[12-20 h]）。

应激颗粒（SG）关联测定（〜1.5 h）
将细胞与10 µM MG-132在37 °C和5％CO 2下孵育2-3小时以诱导SGs。
在冰上冷却humi di fied室内。
具有面向细胞的地方向上盖玻片以及分离成HUMI二田间室（例如，画网格到封口膜，以保持各个反应按顺序）。
吸出盖玻片上残留的培养基，并在50-100 µl反应缓冲液中洗涤细胞一次。笔记：
要完全覆盖12 mm的盖玻片，通常需要40-50 µl的溶液。对于洗涤步骤，应将其增加至每个盖玻片至少100 µl。
反应缓冲液的选择在很大程度上取决于所用蛋白质或肽的性质。我们取得了良好的经验用生理缓冲液，如转运缓冲液（TPB）或磷酸钾缓冲液（KPB），其亦在nucle常用AR导入测定用半透细胞（Adam等，1990;阿诺德，2006）。选择缓冲液，使其产生最佳的信噪比，这是通过与周围细胞质相比，SG中目标蛋白的富集来判断的。
选择性地透化的PLAS细胞毫安膜有关使用0.004-0.01％的冰4-5分钟毛地黄皂苷在反应缓冲液中稀释。对于此步骤，将一滴洋地黄皂苷溶液（每12 mm盖玻片50 µl）放在盖玻片上。2分钟后更新洋地黄皂苷溶液可改善通透性。
注意：确切的孵育时间和最终的洋地黄皂苷浓度在很大程度上取决于洋地黄皂苷批次，细胞类型和细胞密度，需要通过台盼蓝染色实验确定。通透性不足会干扰蛋白质进入SG。Overpermeabilization可导致泄漏核膜和，特别是对于限制性商业惯例，公关富集oteins细胞核，其关联到一个underrepresenation的蛋白质的细胞质中（参见Ñ OTES 1-3下文）。
吸去洋地黄皂素溶液，盖玻片短暂洗一次，然后在反应缓冲液中的冰上洗4次，每次4-5分钟。
块核孔通过施加40微升0的0.2毫克/毫升的麦胚凝集素（WGA）在反应缓冲液中稀释到盖小号嘴唇。在冰上孵育15分钟。
吸出WGA溶液，并用反应缓冲液（最终体积40 µl / 12 mm盖玻片）中的蛋白质替换。为了随后在SG中检测重组蛋白，通常手中大约100-200 nM的最终蛋白浓度就足够了，但这可能需要根据个人情况进行优化。与重组蛋白相比，肽可能需要更高的浓度，这可能是由于分子大小较小以及缺少直接荧光标记物引起的信号放大所致。如果要测试第二种蛋白质（例如怀疑充当分子伴侣蛋白的蛋白质）对SG缔合的影响，建议用恒定浓度的第一种蛋白质进行滴定。
注意：包括“仅缓冲液”对照，以从SG标记（G3BP1）的抗体染色和/或用于检测重组蛋白与SG结合的抗体的非特异性结合中确定渗出。
通过将HUMI在室温下30分钟温育反应二叔从冰田间室到所述替补。避免蒸发，因为这会导致蛋白质/肽浓度的变化和/或盖玻片变干。
地方腐殖化室B在冰上并吸出反应混合物ACK。用反应缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟（最终体积为100 µl / 12 mm盖玻片），每次5分钟（立即用程序E继续）。

SG（和重组蛋白）的免疫染色（约3小时或过夜）
修复细胞用3.7％甲醛/ PBS搜索解决方案Ñ （终体积为50μl/12毫米盖玻片）在室温下7-10分钟。
注意：˚F ormaldehyde是有毒的和应处理，并用必要的谨慎处置。
用PBS洗涤细胞2次（最终体积为100 µl / 12 mm盖玻片）。（可能的断裂点；可以将细胞过夜保存在PBS中，并在第二天继续进行免疫染色，尽管如果协议不能在同一天完成，我们更喜欢在一夜之间进行一抗孵育步骤。）
在室温下，使用0.5％TX-100 / PBS （50 µl最终体积/ 12 mm盖玻片）使细胞通透5分钟。此步骤可确保获得抗体和有效的SG染色。
用PBS洗涤细胞2次（最终体积为100 µl / 12 mm盖玻片）。
在室温下，使用1％驴血清（50 µl最终体积/ 12 mm盖玻片）的PBS / 0.1％Tween-20（或其他封闭缓冲液，如5％BSA或类似溶液）封闭非特异性结合位点10分钟。
染色使用G3BP1抗体的SG（1：1 ，000在封闭缓冲液），如果需要，重组蛋白质和（例如，使用抗MBP抗体; 1：1 ，000在封闭缓冲液）1-2为H RT或过夜在4°C （50 µl最终体积的抗体稀释液/ 12 mm盖玻片）上。
分别在PBS / 0.1％Tween-20 （100 µl最终体积/ 12 mm盖玻片）中清洗盖玻片3 x 5分钟。
与孵育30-60分钟，在室温下第二抗体（1：1稀释，000在封闭缓冲液; 100μl的终体积/12毫米盖玻片）。如果渗出通过是一个问题，使用在光谱上良好分离染料（例如，Alexa的488和Alexa 647）。染色在可见光范围内的SG，但是，允许更容易地判断透效率（参见Ñ下面OTES）。
在PBS / 0.1％Tween-20 （100 µl最终体积/ 12 mm盖玻片）中洗涤3x 5分钟。
在室温下，用0.5 µg / ml DAPI新鲜稀释的PBS染色细胞核5分钟（最终体积50 µl / 12 mm盖玻片）。
在PBS中洗涤细胞两次（最终体积为100 µl / 12 mm盖玻片）。
将一滴（5-10 µl /盖玻片）ProLong Diamond安装介质放在显微镜载玻片上，避免产生气泡。
用尖头弯曲的镊子取下单个盖玻片，用纸巾蘸取过量的PBS，然后将盖玻片倒入安装介质中。
让安装介质聚合并在水平位置（过夜）中的黑暗处干燥。已安装的盖玻片可在4 °C下保存几个月。

成像（1-4小时，取决于样品数量）
注意：采集设置（激光功率，增益，检测器设置）需要单独确定。它是IM portant避免为了允许定量图像分析的像素的饱和度。此外，需要使用相同的设置记录要直接相互比较的样本。检查应用标准规程的流血和串扰（例如，在随后的免疫染色中包括“仅缓冲液”对照，或在不存在一抗的情况下应用二抗等）。
使用显示您的蛋白质/肽最强SG募集的样品建立采集设置。
避免盖玻片边缘成像，因为此处的细胞更容易干燥，导致信号不明确或核泄漏。
选择（均等）通透性好的细胞。这些细胞通常会显示很少或在c没有漫G3BP1染色G3BP1（图ytoplasm且仅强SG富集URE 1 ）。
注意：如果实验进行第一时间，它可以是有帮助的包括一个MG-132处理的，非透盖玻片在第一个实验中，为了区别以及-从不良透细胞（图URE 1 ）。TIA-1（另一种常用的SG标记）的染色由于其主要位于核中，因此不太适合适当地判断细胞的通透性。
通过关注由G3BP1（或替代SG标记）抗体染色的SG找到理想的z位置。用63倍物镜对73.81 x 73.81 µm（分辨率为0.059 µm）的区域进行成像，可以为每个SG提供足够的像素面积，以进行后续分析。将所有独立的视场记录为所有通道中的单个z平面，每个条件总共至少10个像元。

图1 。SG标记G3BP1在透化与未透化细胞中的免疫染色。固定未受应激（未经处理）的细胞或经MG-132处理的细胞，并在使用洋地黄皂苷（MG-132 +烫发）进行透化之前（MG-132）或之后对G3BP1进行染色。请注意，与未处理的细胞相比，通透性良好的细胞（MG-132 +烫发）具有较强的SG形成特征，但与在MG-132处理后直接固定的细胞相比，G3BP1的细胞质染色减少。规模b AR，20微米。

数据分析

在斐济/ ImageJ的打开的图像文件作为hyperstack并选择G3BP1（SG）信道。

选择魔术棒工具。双击将允许调整阈值，以便将SG识别为ROI（以实线标记）。
按[t]会将此ROI添加到ROI Manager（或者，“分析→工具→ROI Manager→添加[t]”）。
标记图像中的所有SG，然后将它们添加到ROI Manager。ROI可以重命名为“ SG1”，“ SG2”等。通过在ROI管理器中选择“重命名”。
最后，在任何细胞区域外绘制ROI，以确定背景荧光强度。重命名此ROI为“背景”。
将ROI转移到要量化的通道中。选择每个ROI，在ROI管理器中选择“属性”，然后输入与您要量化的通道相对应的通道号（通常按录制顺序编号）。
通过“分析”→“设置测量”来设置测量。请确保“区域”，“平均灰度值”和“栈位置”和“显示标签”生成“最小和最大灰度值”。
标记所有ROI，然后按“测量”。可以将ROI保存为文档（“文件”→“保存”）
将生成的测量结果另存为Excel文件。
打开E xcel文件。对于每个图像，从针对各个SG ROI的“平均值”中减去针对各个背景测得的“平均值”。
将经过背景校正的测量值转移到GraphPad Prism中，并绘制值（例如，点或小提琴图），除各个值外还显示平均值±SEM。要合并多个重复样本（建议至少3个独立的重复样本），请计算各个实验的平均值，并将其显示为平均值±SEM。
应用适当的统计检验。如果要将两组进行相互比较，则应用Shapiro-Wilk正态性检验来检查数据分布。对成正态分布的样本应用成对t检验，对非正态分布的样本应用Wilcoxon-Mann-Whitney检验。如果要比较> 3个条件，请使用适当的事后测试进行1通方差分析。图2显示了RBP FUS SG缔合在不存在或不存在其进口受体和分子伴侣的情况下的典型结局。

图2 。典型数据集由在半对SG协会测定获得透化细胞。A. MBP-FUS-EGFP（合并图像中的绿色）在没有（但不存在）其核输入受体和分子伴侣TNPO1的情况下与SGs（标记为G3BP1染色，合并图像中的红色）相关。DAPI在合并中以青绿色显示。刻度条：10微米。B.通过Wilcoxon配对t-检验定量（B）中显示的单个重复的FUS SG缔合，*** P ＜0.001 。

笔记

的毛地黄皂苷浓度和温育时间以实现有效透化，而不会引起核以获得泄漏需要预先通过实验确定。通过将锥虫蓝溶液中的盖玻片倒置，可以控制成功的通透性。足够的透化作用会使细胞核染成蓝色。孵育时间应保持最短，以最大程度地渗透细胞。长时间的洋地黄皂苷孵育可能会导致核膜泄漏，阻止WGA成功阻止核孔，并导致重组蛋白的强烈核定位（特别是如果它具有核酸结合能力）。
我们已经观察到，在数个冻融循环后，DMSO中10％的洋地黄皂苷储液会失去通透效率。因此，准备小等分试样（10 µl），一旦通透效率下降，就使用新鲜的等分试样。
这里描述的协议使用HeLa细胞，因为它们具有良好的粘附性，并且可以选择性地透化其质膜而不会损害核膜。但是，它适用于满足这些条件的任何其他细胞系。我们自己的观察结果表明，HEK293 （T）细胞太脆弱，不适合通过洋地黄皂素进行选择性通透。
朝向盖玻片边缘的细胞可能会受到蒸发伪影的影响。因此，请确保对位于盖玻片中央的细胞进行成像，并且在操作过程中不要让盖玻片变干。
我们已经成功地将TPB和KPB用于重组蛋白和肽的SG结合。但是，我们有时会观察到周围细胞质背景信号中SG缔合水平的差异，并建议进行实验性试验，以确定每种蛋白质/肽的理想缓冲条件。
SGs是依赖RNA的MLO，在存在RNase的情况下会溶解，但是根据我们的经验，没有必要制备不含RNase的溶液。
我们已经使用G3BP1作为SG标志来验证我们的蛋白质的SG定位很好的经验-的-的兴趣。G3BP1代表一种核心SG蛋白，其信号在洋地黄素介导的质膜通透性稳定。TIA-1是SG的另一种常见标记，也可以使用，但我们观察到SG强度的显着降低和更强的变异性，这可能是由于透化后被洗掉了。此外，unpermeabilized细胞显示在细胞质中周围的SG漫G3BP1的实质水平，从而允许区分unpermeablized /不能很好-透从那些适合于分析的细胞。雏用户可以很容易学会判断的水平permeabilizatio Ñ通过包括未用处理的盖玻片毛地黄皂苷在G3BP1免疫染色（图URE 1 ）。
由于与SG中残留的细胞蛋白发生交叉反应，针对标签的抗体可能会引起相当大的背景染色。确保在没有外源添加重组蛋白的情况下，对经过MG-132处理的细胞进行免疫染色，以测试由您选择的抗体引起的非特异性SG信号。
SG组成已被描述为根据压力而变化或用于SG诱导（Aulas等人，2017）。因此，蛋白质/肽的SG协会-的-兴趣可能取决于用于SG感应试剂/治疗而变化。我们主要使用了MG-132，因为这种治疗有效且不会干扰细胞形态（例如，细胞聚集，这可能会妨碍后续分析）。
当比较使用市售标记试剂盒标记的不同蛋白质时，必须检查每种蛋白质的标记程度（DOL），并且仅比较具有相似DOL的蛋白质。由于标记效率在各个蛋白质/实验之间可能会发生很大变化，因此例如可以通过掺杂未标记的蛋白质直至达到相似的DOL来实现。

菜谱

含有10％FBS，10 µg / ml庆大霉素的DMEM
将50 ml FBS添加到500 ml DMEM中
加入0.5毫升的10毫克/毫升庆大霉素
充分混合并储存在4°C（保持无菌）
1x胰蛋白酶-EDTA
在45 ml 1x无菌PBS中稀释5 ml 10x胰蛋白酶-EDTA（保持无菌）
1x无菌PBS（也可以10x溶液存储或购买）
1 L，溶解8克的NaCl ，17.8mmol克Na 2 HPO 4 ，2克的KCl和2.4克KH 2 PO 4在800ml ml的中号illiQ ħ 2 ö
将pH调节至7.4，并将体积调节至1 L
高压灭菌并保持无菌
DMSO中的10 mM MG-132
在DMSO中准备10 mM MG-132储备溶液
分装并储存在-20 °C
准备DTT和蛋白酶抑制剂的库存
在M illiQ H 2 O中准备1 M DTT
分别在M illiQ H 2 O中制备1 mg / ml抑肽酶和亮丙肽半硫酸盐
在DMSO或乙醇中制备1 mg / ml胃酶抑素
分装并储存在-20 °C（可解冻/冷冻多次）
1x传输缓冲液（TPB）（也可以准备并以10x溶液存储）
P repare 20毫HEPES pH值7.3-7.4，110毫的KOAc ，2毫的Mg（OAC）2 ，1 mM的EGTA
˚F通过0.2微米的过滤器和储存ILTER在4 ℃下
d irectly一个DD 2毫DTT和蛋白酶抑制剂右使用前（1微克/毫升的每抑肽酶，亮抑酶肽和抑胃酶肽）
1x KPB（可以在室温下存储）
准备1 M KH 2 PO 4储备溶液
P repare钾的1M储备溶液2 HPO 4
将19 ml 1 M KH 2 PO 4与81 ml 1 MK 2 HPO 4混合，以在pH 7.4下获得1 M K-磷酸盐缓冲溶液
P repare 20毫磷酸钾缓冲液pH 7.4，5毫的MgCl 2 ，200毫摩尔乙酸钾，1毫EGTA
DMSO中的10％洋地黄皂苷
在DMSO中准备10％的储备溶液
注：d igitonin是有毒的，有理有据地照顾，例如，通过戴口罩！
准备10微升等分试样，并在-20°C下储存
如果需要，可以制备1％DMSO储备溶液并分装成小份
新鲜地准备好待测的洋地黄皂苷浓度的洋地黄皂苷工作溶液（见以下说明）
2 mg / ml WGA溶液
在反应缓冲液中准备2 mg / ml WGA溶液。分装并储存在-20°C
在反应缓冲液中新鲜配制工作稀释液（最终0.2 mg / ml）
3.7％甲醛/ PBS
使用前新鲜稀释PBS中的37％甲醛溶液
注意：甲醛是有毒的和将被处理的需求和二小号小心造成的（例如，下通风橱）
0.5％TX100 / PBS
将10 ml TX-100储备溶液溶于100 ml PBS中。溶液可能需要长时间搅拌，并可以在室温下保存
使用10％TX-100 / PBS溶液新鲜配制0.5％TX-100 / PBS工作溶液
1x PBS / 0.1％吐温
将1 ml Tween-20溶于1 L PBS中，并充分搅拌。溶液可在室温下保存
0.5 µg / ml DAPI工作溶液
将DAPI以1 mg / ml的最终浓度溶于M illiQ水中（DAPI不溶于PBS！）。
分装并储存在-20 °C
新鲜制备：PBS中的0.5 µg / ml DAPI工作溶液

致谢

我们感谢Erin Sternburg对手稿的评论并感谢生物医学中心的生物成像设施。这项工作是由德国支持的研究联合会（DFG，德国研究基金会）内艾美奖诺特授予DO1804 / 1-1和DO1804 / 1-2，研究经费DO1804 / 3-1，优先程序SPP2191（ID 402723784），慕尼黑集群的神经系统（EXC2145 SYNERGY - ID 390857198），弗里茨蒂森基金会（AZ 10.19.1.001MN。）和t Ludwig-的他少年研究员基金马克西米利- Universität大学慕尼黑。
该方案首先针对FUS （Hofweber和Dormann，2018），随后针对Tau和富含赖氨酸的肽（Ukmar-Godec et al。，2019）以及RBP冷诱导RNA结合蛋白（Hum CIRBP）（布尔乔亚等人，2020）。我们承认亚当等。，（亚当等人，1992年），谁第一个成立的半通透细胞检测发现蛋白质，它充当了此协议基础上的核进口。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

亚当（Adam，SA），斯特恩·马尔（Sterne-Marr）和里斯（Gerace ）（1992）。核蛋白的导入是使用经过digitonin渗透的细胞进行的。方法酶219 ：97-110。
Alberti ，S.和Dormann ，D.（2019年）。疾病中的液相分离。Annu Rev Genet 53：171-194。
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