材料和试剂

动物
成年斑马鱼（Danio Rerio，斑马鱼国际资源中心，俄勒冈州尤金）4至12个月

用料
1. Colorfrost Plus显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-18）
2.矩形玻璃盖1 ½，24 x 50毫米（Corning，目录号：2980-245）
3. 1.5 ml微量离心管，不含可检测的RNase，DNase，DNA和热原（美国科学公司，目录号：1615-5500）
4. 1毫升无针注射器（BD，REF 309659）
5. ProLong黄金防褪色固定剂（固化； ThermoFisher Scientific，目录号：P36930）

试剂种类
组织准备和固定
Tricaine-S / MS-222（华盛顿州芬代尔Syndel）
碳酸氢钠（Sigma - Aldrich，目录号：S5761-500G）
多聚甲醛（SPI Supplies，目录号：02615-AB）
氢氧化钠/ NaOH粒料（Sigma - Aldrich，目录号：S-0899）
一水磷酸钠/ NaH 2 PO 4· H 2 O（Millipore Sigma，目录号：SX0710-3）
磷酸氢二钠/ Na 2 HPO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：S7907-1KG）
蔗糖（Sigma - Aldrich，目录号：S9378-1KG）
10倍麻醉/三卡因储备溶液（请参阅食谱）
麻醉/三卡因工作溶液（请参阅食谱）
1.0％碳酸氢钠溶液（请参阅食谱）
40％多聚甲醛库存（请参阅食谱）
在0.1 M磷酸盐缓冲液和5％蔗糖中的4％低聚甲醛（请参阅食谱）
10x磷酸盐缓冲液储备液（1.0 M，pH 7.4）（请参见配方）
具有5％蔗糖的0.1 M磷酸盐缓冲液（请参见食谱）

免疫组织化学
柠檬酸钠二水合物/ C 6 H 5 Na 3 O 7 · 2H 2 O（Fisher Scientific，目录号：BP327-500）
吐温20（Fisher Scientific，目录号：BP337-500）
盐酸/ HCl（Fisher Scientific，目录号：A144-500）
一水磷酸二氢钠/ NaH 2 PO 4 · H 2 O（Millipore Sigma，目录号：SX0710-3）
磷酸氢二钠/ Na 2 HPO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：S7907-1KG）
氯化钠/ NaCl（Sigma - Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾/氯化钾（Sigma - Aldrich，目录号：P3911-500G）
海卫一X-100（Sigma - Aldrich，目录号：T9284-500ML）
叠氮化钠（Sigma - Aldrich，目录号：S2002-100G）
二甲基亚砜（Sigma - Aldrich，目录号：D8418-100ML）
山羊血清供体群（Sigma - Aldrich，目录号：G6767-500mL）
抗mCherry抗体（兔多克隆，Abcam，目录号：167453）
山羊抗兔IgG（H + L）高度交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 647（Invitrogen，目录号：A21245）
小鼠单克隆抗ZO1（ThermoFisher Scientific，ZO1-1A12，目录号：33-9100）
山羊抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 555（Invitrogen，目录号：A21422）
柠檬酸钠缓冲液（见配方）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）储备液（请参阅食谱）
PBS（请参阅食谱）
含0.5％Triton X-100的PBS（请参阅食谱）
10x PBS和1％叠氮化钠（请参阅食谱）
整个安装的IHC阻断缓冲液（请参见配方）
完整的IHC稀释缓冲液（请参见食谱）
整个安装的IHC清洗缓冲液（请参阅配方）

设备

VANNAS剪刀，STR（G）8厘米，（World Precision Instruments，型号：14003-G）
杜蒙特镊子＃5 INOX（世界精密仪器公司，型号：501985）
徕卡205FA立体显微镜（Leica Microsystems）
Fisher品牌等温搅拌炉（ThermoFisher Scientific，型号：SP88857200）
摇杆
1,500 ml烧杯（PYREX，型号：CE-BEAK1L）
LidLocks的离心管锁（VWR我国际电信联盟，型号：14229-941）
圆形微型离心机浮动泡沫架（VWR我国际电信联盟，型号：60-86-342）
汤匙刀，双斜角，弯角3.3刀片（Hilcovision，型号：625-0743061-06）
15 ml锥形管（FALCON，型号：352097）
移液器（Fisher Scientific，型号：13-711-7M）
带有LuerLok注射器的注射针1 ml 30G½ （BD，型号：305778）
蔡司AxioImage ZI荧光显微镜（Carl Zeiss MicroImaging LLC）
Fisherbrand Nutating搅拌机-固定速度（Fisher Scientific，型号：88-861-041）

小号oftware

图像
Adobe Photoshop CC 2019（Adobe系统）

程序

视网膜解剖和固定
1.在解剖视网膜之前，黑暗适应动物至少3小时。
注意：黑暗适应对于将神经视网膜与视网膜色素上皮分开至关重要。但是，在对突触成分进行染色时可以省略此步骤，因为黑暗适应会导致突触结构快速变化。
2.在红色照明的暗室中，将鱼浸入冰冷的水中并颈椎横断处死。
3.使用立体显微镜，微剪刀和镊子，小心地将微剪刀插入地球仪的背面，以可视化视神经（图1，箭头）。切开视神经，轻轻取下球体，然后将其放在纸巾上（图2）。

图1.摘除眼球

图2.解剖后的球体的前视图和后视图

注意：为了更好地分离神经视网膜和视网膜色素上皮，避免强光照射。昏暗的照明是可以接受的。

4.使用30 ģ ½注射针，在脉络膜裂使一个小孔腹侧（图3，红色圆圈）。

图3.带有腹孔的地球仪

注意：如果脉络膜裂隙不可见，请使用其他解剖标记来区分背腹轴。眼睛的背面有大量的黑色素/黑色色素和较少的虹膜/闪亮的银色色素，这些色素在腹侧富集（图2）。

5.使用微剪刀，将腹侧孔向视神经头延伸约5 mm，以进行定向。
6.用小剪刀在角膜和虹膜的交界处沿周向切口（图4左，红色虚线）。去除眼睛和晶状体的整个前段（图4）。

图4.去除前段

7.将眼罩放入PBS中，并通过在两层之间插入微型镊子，将神经视网膜与视网膜色素上皮轻轻分开。神经视网膜微弱的粉红色，与下面的视网膜色素上皮形成对比（图5）。

图5.晚于PBS眼罩的RAL视图

8.使用显微外科手术刀片，在鼻，颞和背象限处，从边缘向视网膜中心进行短暂的松弛切割（图6）。这些切口有助于在将玻璃片安装到玻璃片上时使视网膜变平。

图6。解剖的视网膜

9.将单个视网膜放入1.5 ml微量离心管中，该离心管中含有1 ml 4％多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和5％蔗糖，并在4 °C的转子上固定过夜（图7 ）。

图7.视网膜固定

10.第二天，在室温下用1 ml的5％蔗糖在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中冲洗视网膜3次，每次20分钟。

表位检索（可选）
注意：如果您的抗体识别膜相关蛋白，例如Zonula Occludens（图13; Nagashima等人，2020）和N-钙黏着蛋白（Nagashima等人，2017），则此步骤是必需的。
用热板准备沸水浴。
交换5％蔗糖的0.1 L磷酸盐缓冲液（pH为7.4）与500 μ钠升柠檬酸盐缓冲液。
将离心管浸入沸水浴中5至10分钟（图8 ）。
注意：在每个微量离心管上安装一个LidLock，并使用浮动架子。

图8.表位检索

从热板上移出烧杯，使其冷却5分钟。不要从烧杯中取出微量离心管。
5分钟后，从烧杯中取出微量离心管，并在转子上用1 ml PBS和0.5％Triton X -100冲洗视网膜10分钟。

免疫组织化学
取下离心管缓冲液和加入500微升全安装IHC封闭缓冲液。在室温下，在转子上用全载IHC封闭缓冲液孵育视网膜2小时。
用整装IHC稀释缓冲液将抗体稀释至最佳稀释度（如果未知，则从1：200开始）。使用前，请确保离心30 s。
注意：如果您需要双重或三次标记，请将所有一抗混合在一起。如果您的样品具有转基因，例如GFP或mCherry，我们建议使用抗GFP，抗dsRed或抗mCherry抗体来放大信号。抗GFP，抗dsRed或抗mCherry的最佳稀释度取决于转基因的类型，表达转基因的细胞类型和表达水平。如果未知最佳稀释度，建议从1：200开始。表位修复后的视网膜需要抗GFP，抗dsRed或抗樱桃。
在室温下将视网膜与一抗孵育过夜（不搅动）。
注意：添加至少100μl含有所需抗体的稀释缓冲液。
在室温下，用1 ml完整安装的IHC洗涤缓冲液冲洗视网膜20分钟，每次3次。
在黑暗中于室温下将视网膜与第二抗体孵育过夜。
注意：添加至少100μl稀释缓冲液，其中含有经过优化稀释的所需抗体（如果未知，请从1：200开始）。如果需要双重或三次标记，请将所有第二抗体混合在一起。如果可能，请避免使用绿色荧光偶联物，例如Alexa Fluor 488，因为绿色通道通常显示出较高的背景，尤其是在抗原回收后。
在室温下，用1 ml的全挂载IHC洗涤缓冲液冲洗视网膜20分钟，每次3次。

安装在载玻片上
使用移液器将视网膜移至载玻片上（图9 ）。

图9.载玻片上的Tran刺激视网膜

用K抹去多余的缓冲液（不要让视网膜完全干燥）。
使用镊子清理并对准光感受器的视网膜。较大的腹侧切口（请参阅步骤A8 ）用作定向视网膜的界标。在盖玻片上加入1至2滴Prolong Gold。将盖玻片轻轻放在视网膜上以进行固定（图10 ）。
注意：在黑暗中于室温下至少固化1周。

图10.中号在载玻片上ounting视网膜

图11.固定和免疫组织化学程序

d ATA分析

结果与讨论
使用上述协议（图11），我们成功地成像了标记为Müller胶质细胞（Tern （gfap ：egfp））的mi2002 （Bernardos和Raymond ，2006; Nagashima等人，2017和2020），Tg（mpeg1：mCherry）gl23标记的小胶质细胞（图12; Ellett等，2011：Silva等，2020），Tg（-5.5sws1：egfp）kj9-或Tg（trb2：tdTomato）标记的锥感光细胞（Nagashima等，2017; Nunley等等人，2019）和Tg（-3.7rho：egfp）kj2标记的棒状感光器（Raymond等人，2014）。

光学切片对于在厚样本中成像免疫荧光至关重要。共聚焦显微镜可以消除散焦信号，并有助于快速的三维重建。可替换地，我们建议落射荧光显微镜小号配备有结构化照明技术（Wu和缴费，2018）或计算结算系统小号，这在数学上消除了-的-焦模糊。

图12. TG（MPEG1：mCherry的）gl23 -labele d的小胶质细胞在斑马鱼视网膜

用兔多克隆抗mCherry（1：200）和Alexa Fluor 647山羊抗兔抗体（1：200）对转基因Tg（mpe g1：mCherry）gl23 （Ellett et al。，2011）进行免疫标记。使用Leica TCS SP5共焦显微镜（Leica Microsystems）捕获图像。使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）进行3D渲染。

图13.用（未）（左）和（（右））抗原回收的ZO-1免疫标记的斑马鱼视网膜的比较

完整的膜蛋白ZO1用小鼠单克隆抗ZO1（1：200）和Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG抗体（1：200）进行了免疫标记，而没有（左）或（右）抗原回收（图13）。用Zeiss AxioImage ZI Epif荧光显微镜捕获图像。为了创建Z-stack系列的最大投影，使用了Adobe Photoshop CC 2019（Adobe Systems）。

菜谱

10 x麻醉/大肠储备液（10 mg / ml曲卡因甲磺酸盐）
将1.0克的Tricaine甲磺酸盐（MS-222）添加到100毫升的Mili-Q水中
使用1.0％碳酸氢钠溶液将pH调节至7.4
制作2毫升等分试样，并冷冻保存在-20 °C
麻醉/三卡因工作溶液
向100 ml斑马鱼系统水中添加2 ml麻醉/三氮烷储备溶液
1.0％碳酸氢钠溶液
将1克碳酸氢钠加到100毫升Mili-Q水中
40％低聚甲醛库存
将200 ml的Mili-Q水预热至50-60 °C
在预热的水中添加200克变形甲醛
充分搅拌并加入浓NaOH（NaOH颗粒）直至溶液澄清
体积带来高达500毫升（一pH值为djustment是不必要的）
制作2毫升等分试样并冷冻保存
含5％蔗糖的0.1 M磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛
在热水中/下融化2 ml 40％多聚甲醛
将1克蔗糖和2毫升10 x磷酸盐缓冲液加入16毫升Mili-Q水中
加入2 ml 40％多聚甲醛
储存在4 °C下，可保存2周
10x磷酸盐缓冲液库存（1.0 M，pH 7.4）
将13 g NaH 2 PO 4 · H 2 O和55.75 g Na 2 HPO 4溶解在350 ml Mili-Q水中
将pH调节至7.4，并用Mili-Q水调节至500 ml
高压灭菌器可长期保存
0.1 M磷酸盐缓冲液和5％蔗糖
将25克蔗糖溶于400毫升H 2 O
加入50毫升的10倍磷酸盐缓冲液
如果需要，将pH值调节至7.4
用Mili-Q水将容量调至500 ml
柠檬酸钠缓冲液（10 mM柠檬酸钠，0.05％T介于20之间，pH 6.0）
向100 ml的Mili-Q水中添加0.294 g的C 6 H 5 Na 3 O 7 · 2H 2 O
使用1 N HCl将pH调整至6.0
加入0.05 ml的Tween 20并充分混合
在室温下存放3个月，或在4 °C下存放更长的时间
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）
加入的NaH2.76克2 PO 4 · H ^ 2 O，11.36克的Na 2 HPO 4 87.6克NaCl，1.87克的KCl至850毫升米利-Q水
调节pH至7.4
调至1 L
每一种都必须溶解在溶液中，然后再添加下一种盐
PBS
将100毫升的10倍PBS储备液添加到900毫升的Mili-Q水中
调节pH至7.4
含0.5％Triton X-100的PBS
将0.5 ml的Triton X-100加入100 ml的PBS中
充分搅拌直到Triton X-100完全溶解
10x PBS和1％叠氮化钠
将0.5克叠氮化钠加入50毫升1x PBS中
全血IHC封闭缓冲液（10％正常山羊血清，1％Tween-20、1％Triton X-100、1％DMSO的0.1M PBS和0.1％叠氮化钠溶液）
向7.7 ml Mili-Q水中添加1.0 ml含1％叠氮化钠的10x PBS
使用一次性注射器，将0.1 ml的Tween-20和0.1 ml的Triton X-100加入含叠氮化钠（a）的PBS中
加100 μ升DMSO的
充分混合直至Tween-20和Triton X-100完全溶解
加入1毫升普通山羊血清
储存在4 °C下，可保存1周
完整的IHC稀释缓冲液（2 ％正常山羊血清，1％Tween-20、1％Triton X-100、1％DMSO的0.1M PBS和0.1％叠氮化钠溶液）
将1.0 ml含1％叠氮化钠的10x PBS加入8.65 ml Mili-Q水中
使用一次性注射器，将0.1 ml的Tween-20和0.1 ml的Triton X-100加入含叠氮化钠（a）的PBS中
加入100微升的DMSO中
充分混合直至Tween-20和Triton X-100完全溶解
加入50μl正常山羊血清
储存在4 °C下，可保存1周
完整的IHC洗涤缓冲液（含1％Tween-20、1％Triton X-100、1％DMSO的PBS）
将10毫升的10X PBS加到87毫升的Mili-Q水中
使用一次性注射器，将1 ml Tween-20和1 ml Triton X-100加入PBS
加入1毫升DMSO
充分搅拌直至Tween-20和Triton X-100完全溶解
储存在4 °C下，可保存1周

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NEI）-R01EY07060和P30EYO7003（PFH）的资助，以及纽约预防失明研究的无限制资助。ZIRC提供的鱼线和试剂由NIH-NCRR Grant P40 RR01支持。作者感谢Dilip Pawar维护斑马鱼和获取图像。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均由密歇根大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

参考文献

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