材料和试剂

10 μ升XL Freload重装系统移液管尖端，低保持，无菌（Interpath服务，目录号：33410）
1.5 ml微量离心管，带刻度，防煮沸，无菌（无DN A酶和RN A酶）（SSI，由Interpath Services出售，目录号：MCT-175-C）
胰岛素注射器29 G，12.7厘米，0.5毫升超细（BD，目录号：BDM00183）
15 ml锥形离心管（BD Falcon TM ，目录号：BD352096）
胶带（通用医用胶带，例如Transpore外科胶带，或Nexcare医用胶带牢固固定，澳大利亚3M卫生保健）
组织KIMwipes （Kimberly-Clark，目录号：18821277）
的Superfrost幻灯片（Menzel的，由销售的赛默飞，目录号：MENSF21201 / 40NC）
3.5毫升柔性塑料巴斯德移液管（SAMCO ，所售赛默飞，目录号：BER225-1S [EA]
巴西猪笼草L3感染幼虫（iL3）（Camberis et al。，2003）
注意：Camberis等。（2003）提供了对巴西猪笼草的制备的详细审查。储存在26 °C 。
PBS（DPBS，不含钙，不含镁）（Gibco TM ，ThermoFisher Scientific出售，目录号：14190144）
青霉素/链霉素10,000 U / ml（Gibco TM ，ThermoFisher Scientific出售，目录号：15140122，在4 °C下储存）
庆大霉素溶液10 mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：G1272，储存在4 °C ）
Virkon 5克片剂（杜邦，目录号：500607）
抗生素清洗液（请参阅食谱）

设备

体视显微镜（Nikon，SMZ1000 ）
镊子（学生杜蒙＃5钳，精细小号cience Ť ools，通过DANIELS卫生检验销售的产品，目录号：91150-20）

程序

第一部分：经皮给药感染

皮肤准备
注意：此步骤不需要麻醉的小鼠，然而实验者可能希望利用麻醉之前所描述的皮肤制剂，以增加的容易性的程序，以及ensur Ë动物的最佳福利。
感染部位脱毛
感染前一天，准备通过脱毛注射的小鼠皮肤。为此，请握住鼠标的颈背。使用镊子，取出该毛发围绕所述感染部位，围绕〜1.5厘米2 （通常在腹部或背部，见V IDEO 1和˚F igure 1）。

视频1 。鼠标被脖子的颈背抓住，而用镊子将腹部皮肤上的毛发去除。该视频是根据澳大利亚墨尔本阿尔弗雷德校区动物保健委员会AEC委员会的指导在莫纳什大学制作的，授权号为E / 1846/2018 / M。

图1.脱毛和剥离胶带后获得的典型表面积（此处，感染后一天已切除皮肤以进行成像）。比例尺= 0.4厘米。

注意：请勿使用脱毛膏或剃刀，因为它们对幼虫有毒，并可能伤害皮肤，导致幼虫穿透力不足或改变宿主的免疫反应。我们发现寄生虫不会自然地渗透到耳朵的皮肤，而是更喜欢在身体较温暖的区域进入皮肤。
胶带剥离感染部位
在先前脱毛的皮肤区域上缠绕1.5 cm 2的胶带。将胶带从皮肤上拉出。在相同的皮肤区域，用新的胶带重复该应用程序和去除动作，总共十次。
注意：此步骤允许角质层破裂，以促进寄生虫进入。胶带剥离后，皮肤通常看起来有光泽。

幼虫准备
在感染当天，通过在15 ml管中用10 ml PBS清洗幼虫两次，为计划的实验准备足够的Nb幼虫（L3）。对于每次洗涤，在室温下通过重力使幼虫沉降到试管底部。这大约需要10-15分钟，幼虫应在试管底部形成小球。使用柔性塑料巴氏移液器小心除去上清液，弃去上清液并用10 ml新鲜PBS代替。
注意：每个应用程序使用100 Nb L3，每只鼠标总共3个应用程序（300 Nb L3）。洗涤Nb L3产生的废物在处理前需要用维康或漂白剂处理30分钟。
制备悬浮液的Nb的含有每10 100 L3 L3微升PBS中。通过使用立体显微镜对第一步中产生的幼虫进行定量，计算产生该悬浮液所需的稀释度。总是彻底通过将2的下降前几次颠倒试管计数之前蜗杆溶液混合μ升蜗杆溶液在载玻片上，或进入P etri-培养皿中，计数全部存在于液滴的幼虫。通过添加更多的PBS或通过从含管幼虫已通过重力沉降至底部（如在描述的去除PBS调整幼虫浓度小号TEP乙1）。
：注意一个应该执行最低的三项罪名，并平均以最佳估计幼虫浓度。

局部应用和感染
通过使用一块湿纸巾来润湿皮肤的治疗部位。
注意：此步骤不需要麻醉的小鼠，然而实验者可能希望利用麻醉之前所描述的皮肤制剂，以增加的容易性的程序，以及确保最佳的动物福利。
取出组织并应用10 μ升幼虫溶液到皮肤，然后均匀地使用手动弯曲10传播溶液μ升尖端创建的液体的薄层（见V IDEO 2）。

视频2 。所报道的制备的小鼠的皮肤V IDEO 1和使用湿一块纸巾的加湿。然后幼虫溶液用移液管10 μ升尖端。手动弯曲尖端，并滴入幼虫并均匀地散布在皮肤上。

每15分钟重复3次。
注意小号：
È nsure每个应用之间的幼虫悬浮液彻底混合，以避免幼虫沉降。
牛逼O检查感染的功效，小鼠可以牺牲一两天，感染后和肺评估蠕虫负担（请参阅bioprotocol Camberis等人。，2016）。或者，可以在感染后进行实时成像（见图2）。

图2 。使用本文所述方法并用立体显微镜成像的荧光标记幼虫的典型图像。幼虫的荧光标记方法可在Bouchery等人获得。，2017年。

第二部分：皮内注射感染

感染部位脱毛
感染前一天，准备通过脱毛注射的小鼠皮肤。为此，请握住鼠标的颈背。使用镊子，在约1.5 cm 2 （通常在腹部或背部）周围的感染部位去除头发。

幼虫准备
在感染当天，通过在15 ml管中用10 ml PBS清洗幼虫两次，为计划的实验准备足够的Nb幼虫（L3）。对于每次洗涤，在室温下通过重力使幼虫沉降到试管底部，这大约需要10-15分钟，幼虫应在试管底部形成沉淀。使用柔性塑料巴氏移液器小心除去上清液，弃去上清液并用10 ml新鲜PBS代替。
注意：250 Nb L3 in 10μ升PBS是每次注射使用。
使用1 ml移液器将L3沉淀转移到1.7 ml微量离心管中，让幼虫在重力作用下在管底部形成沉淀约15分钟，然后丢弃所有剩余的PBS。
注：牛逼，他平时幼虫藏匿在其表面的细菌。为了避免感染期间的细菌污染，可以在抗生素溶液中洗涤幼虫。要执行此洗净，加入含有青霉素/链霉素1 500微升PBS中，000 μ克/米升（Gibco公司），庆大霉素1.6 μ克/米升（Sigma）的到沉淀幼虫。在室温下孵育30分钟，然后在无菌PBS中冲洗。该步骤也可用于经皮感染。但是，在渗透到皮肤后，我们观察到的细菌污染较少，这可能是由于细菌在进入皮肤期间自然从寄生虫表面“清除”了细菌。
制备含有250的悬浮液的Nb每10 L3微升使用立体显微镜PBS通过定量。总是彻底通过将2前几次颠倒试管计数之前蜗杆溶液混合μ升蜗杆溶液滴在载玻片上，或进入P ETRI-培养皿中，计数全部存在于液滴的幼虫。通过添加更多的PBS或从装有通过重力沉降到底部的幼虫的试管中除去PBS来调整幼虫的浓度。
：注意一个应该执行最低的三项罪名，并平均以最佳估计幼虫浓度。
在感染每只小鼠之前，将蠕虫溶液彻底混合。绘制10 μ升幼虫溶液中的胰岛素注射器。皮内注射。
注：牛逼O检查感染的功效，小鼠可以牺牲一两天后感染和肺评估蠕虫负担（请参阅bioprotocol Camberis等人。，2016）。不注射超过10 μ升的溶液，因为这会损伤皮肤结构。

菜谱

抗生素清洗液
100毫升PBS
5 ml青霉素/链霉素
1.5毫升庆大霉素溶液
可以预先制作，并在4°C下最多保存一个月

致谢

该协议源自Bouchery等人。，2020，细胞ħ OST和中号icrobes 。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

所有的动物实验都得到批准的服务德拉consommation等国家商务vétérinaires （1066个埃帕兰日，沃州，瑞士广州）与授权号VD 3001，或由阿尔弗雷德校园AEC委员会，澳大利亚墨尔本与授权号E / 1846 / 2018 /月

参考文献

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