材料和试剂

I VT mRNA的产生
1.培养皿（格雷纳乙IO- ø NE，目录号：633161）
2.响尾蛇电镀珠（5毫米）（Zymo Research，目录号：S1001，在RT存放）
3. One Shot TM TOP10具有化学活性的大肠杆菌（Thermo Fisher，目录号：C404003，存储在-80 °C）
4.根据pVAX1上pVAX1.A120矢量（生命Ť echnologies，目录号：V26020，储存在-20℃）
5. XhoI （NEB，目录号：R0146L，存储在-20°C）
6. Kpn I （NEB，目录号：R0142L，存储在-20°C）
7. Nhe I （NEB，目录号：R0131L，存储在-20°C）
8. NEBuffer TM
9. 1 X CutSmart ®缓冲液（在-20设置有适当的酶，存储℃）
10. 1 x NEBuffer TM 1.1（提供了适当的酶，储存在-20 °C下）
11. 1 x NEBuffer TM 2.1（附带适当的酶）
12. T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202L，储存在-20°C）
13. 1 x T4 DNA连接酶反应缓冲液（附带适当的酶，保存在-20 °C下）
14. SOC介质（Thermo Fi sher，目录号：15544034），存储在室温下
15. MEGAscript TM T7转录试剂盒（Invitrogen，目录号：AM1334 ），在-20°C下保存
16. m27,3'-OGP3G（ARCA模拟瓶）-溶液（Jena Bioscience，目录号：NU-855L ），存储在-20°C
17.修饰的碱1，例如N1-甲基伪-UTP（Jena Bioscience，目录号：NU-890L ），储存在-20°C
18.改良的碱1，例如2-Thio-UTP（Jena Bioscience，目录号：NU-1151L ），储存在-20°C
19. MEGAclear TM试剂盒（Invitrogen，目录号：AM1908 ），在4°C下储存
20. TURBO TM DNA酶（Thermo Fisher，目录号：AM2239 ），在-20°C下储存
21. Agilent RNA 6000 Nano试剂盒（安捷伦，目录号：5067-1511 ），在4°C下存储试剂，在室温下放置芯片
22. Luria肉汤基地（Miller的LB肉汤基地）（Thermo Fisher，目录号：12795027 ），在RT处存储
23.选择琼脂（Thermo Fisher，目录号：30391023 ），存储在室温下
24.硫酸卡那霉素（Thermo Fisher，目录号：11815024 ），在RT存放
25. GeneJET PCR纯化试剂盒（赛默飞世尔，目录号：K0702 ），在室温下存放

血科尔ction和体外刺激
12孔板（Corning，目录号：3512）
包含真空管的EDTA（Sarstedt ，目录号：02.1066.001）
Precellys细菌/真菌RNA试剂盒（PeqLab ，目录号：12-7611-01，存放在RT）
Precellys组织匀浆CKMix –2 ml （Bertin Instruments，目录号：P000918-LYSK0-A ），存放在室温下
Resiquimod （R848）（Sigma-Aldrich，目录号：SML0196 ），储存在-20 °C
的TransIT ® -mRNA转染试剂盒（Mirus公司，目录号：2225 MIR ），储存在4 ℃下

ELISA法测定细胞因子
96孔板（ELISA试剂盒提供）
吸水纸
醋酸纤维微测试箔（Sarstedt ，目录号：82.1586）
捕获抗体（ELISA试剂盒提供）
生物素化检测抗体（随ELISA试剂盒提供）
洗涤缓冲液
DPBS，不含钙，不含镁（Thermo Fisher，目录号：14190094 ），在室温下存放
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich公司，目录号：P9416-50ML ），保存于室温
HRP共轭工作溶液（随ELISA试剂盒提供）
底物试剂（随ELISA试剂盒提供）
带有板的TNF - alpha人类未包被ELISA试剂盒（Thermo Fisher，目录号：88-7346-22 ），在4°C下储存
Invitrogen公司TM eBioscience公司TM铂-ELISA-Kit的用于人IFN-α（Fisher Scientific公司，目录号：15561697 ），储存在4℃下
带有板的IFN gamma人类未包被ELISA试剂盒（Thermo Fisher，目录号：88-7316-22 ），储存在4°C
IL-6人未镀膜ELISA试剂盒与板（热费舍尔，目录号：88-7066-22 ），存储在4℃下
IL-12 p70人无包被酶联免疫吸附测定试剂盒（带有板）（Thermo Fisher，目录号：88-7126-22 ），在4°C下储存
2 N HCl （停止溶液）（Carl Roth，目录号：T134.1 ），在室温下保存

实时RT-PCR
PAXgene 96血液RNA试剂盒（Qiagen ，目录号：762331），在RT存放
iScript TM cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，目录号：1708891 ），在-20 °C储存
Power SYBR Green PCR Master mix（Thermo Fisher，目录号：4367659 ），储存在-20 °C
红细胞裂解缓冲液（PAN Biotech，目录号：P10-90100 ），在室温下保存
底漆：
hTNF Alpha向前：5' - GGA GAA GGG TGA CCG ACT CA-3'
hTNFAlpha反向：5' - CTG CCC AGA CTC GGC AA-3'

hIFNAlpha正向：5' - GAC TCC ATC TTG GCT GTG A-3'
hIFNα反向：5' - TGA TTT CTG CTC TGA CAA CCT-3'

hIFNgamma前锋：5' - CCA ACG CAA AGC AAT ACA TGA-3'
hIFNgamma反向：5' - CCT TTT TCG CTT CCC TGT TTT A-3'

的hIL-12正向：5' - CAA GAA CTT GCA GCT GAA G-3'
的hIL-12的反向：5' - TGG GTC TAT TCC GTT GTG TC-3'

IL-6正向：5' - AGACAGCCACTCACCTCTTCAG - 3'
IL-6反向：5' - TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG - 3'

IRF7向前：5' - CCACGCTATACCATCTACCTGG - 3'
IRF7反向：5′ - GCTGCTATCCAGGGAAGACACA - 3′

IRF3前锋：5' - TCTGCCCTCAACCGCAAAGAAG - 3'
IRF3反向：5' - TACTGCCTCCACCATTGGTGTC - 3'

eIF 2A向前：5′ - CTGGACCTCATGCAGCTTTAGC m- 3′
起始因子2A反向：5' - CTCCATAGTAGGAAGCTCCTGTC - 3'

核糖核酸酶L正向：5' - AAGGCTGTTCAAGAACTACACTTG - 3'
核糖核酸酶L反向：5' - TGGATCTCCAGCCCACTTGATG - 3'

流式细胞仪分析
DBPS，无钙，无镁（Thermo Fisher，目录号：14190094 ），在RT储存
10％FBS；FBS Superior（Sigma-Aldrich，目录号：S0615 ），储存在-20 °C
红细胞裂解缓冲液（PAN Biotech，目录号：P10-90100 ），在室温下保存

设备

ThermoShaker Univortemp MT 100（通用劳工技术公司）
5430R离心机（埃彭多夫（Eppendorf），目录号：5427000015）
2100生物分析仪（Agilent，目录号：G2939BA）
2100生物分析仪笔记本电脑（Agilent Original Bundle PC，目录号：G2953CA）
细胞培养柜HeraSafe KS（Thermo Fisher，目录号：10110910）
CO 2培养箱HeraCell VIOS 160i（Thermo Fisher，目录号：15381075）
Precellys进化均质机（Bertin Technologies，目录号：P000062-PEVO0-A）
Ensight TM多模式读板器（Perkin Elmer，目录号：HH34000000）
流式细胞仪，BD LSRFortessa TM X20（BD Biosciences）
ViiA 7实时PCR系统（Thermo Fisher，目录号：4453545）

软件

2100生物分析仪专家（安捷伦）
Graphpad Prism v.6.0d软件（www.graphpad.com）
用于Ensight TM读板器（PerkinElmer）的Kaleido TM 2.0数据采集和分析软件
用于流式细胞分析的BD FACSDiva TM软件（BD Biosciences）
ViiA7软件v.1.2（适用于生命技术的生物系统）
NEBioCalculator v.1.12.0（New England Biolabs ）

程序

IVT mRNA生产
基因c loning
PCR扩增开放阅读框的感兴趣（基因hCFTR从的pcDNA3 / ZFN / Cas9 / RFP）（50纳克）使用2X甲mpliTaq黄金主混合物（25微升）与各引物中加入（1微升的每个，1.0μM）的NheI （正向：5 ' -TTAGCTAGATGCAGAGGTCGCCTC-3 ' ）和KpnI位（反向：5 ' -GCGGGTACCTATCTTGCATCTCTTCT-3 ' ）的限制位点到每个端分别在8个不同的反应50μl的反应体积。
保持：95 °C 5分钟
40周期
变性95 °C 15 s
退火60 °C 30 s
扩展72 °C 5分钟（1分钟/ Kb）
最后延伸72°C 7分钟。
汇集八种不同的PCR反应物，并在琼脂糖凝胶电泳中验证扩增的理论大小，并按照生产商的说明使用GeneJET PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
通过以下步骤通过粘端连接将PCR产物克隆到含有pVAX （pVAX.A120）的polyA-120中。
执行双重d igest的离子两种PCR （5微克）产品和pVAX.A120 （10微克）用KPN我和的Nhe我（反应条件在50μl体积-1 0 X NE缓冲液TM 1.1 （5微升），10个单位KPN I和Nhe I ），然后在37°C下孵育过夜。V erify所述的消化pVAX.A120矢量在琼脂糖凝胶电泳和纯化都消化的PCR产物和消化的pVAX.A120载体主链使用GeneJET PCR Purification试剂盒按照制造商的说明。
为了获得最佳的结扎，消化的浓度pVAX.A120载体骨架和消化的PCR产物从感兴趣的基因中计算NEBiocalculator达到3：1的插入物：载体比。将计算量的插入片段和载体添加到20 µl连接混合物中，该混合物由20单位的T4 DNA连接酶和2 µl 10x DNA连接酶缓冲液组成。将连接复合物在22°C下孵育10分钟。
细胞转化
使用50 µl Top1 0大肠杆菌感受态细胞，在冰上融化。
冷却约10 µl的连接混合物。
将50 µl感受态细胞添加到4 µl连接混合物中，并轻轻混合。不要超过感受态细胞体积的10％，即，不超过5 µl的连接混合物。
将复合物在冰上孵育30分钟。
在42°C下热冲击45 s。
加入950 µl室温下储存的SOC介质。
将试管在37 °C下放置60分钟。以250 rpm的速度剧烈摇动。
在37°C下温热选择板（卡那霉素用于pVAX.A120）。
旋孵育SOC培养基在2 ，650 ×g离心10分钟。
小心丢弃900 µl，不要干扰沉淀并重悬。
传播100微升细胞和连接混合物在平板上。
在37 °C下孵育过夜。
mRNA产生
线性化的10微克pVAX.A120 containi纳克感兴趣的开放读框的基因使用的Xho我酶[ 10个单位（1微升）用1 0 X Cutsmart TM缓冲液（5微升）在50μl反应体积和我ncubate在37℃下过夜）。在琼脂糖凝胶电泳中验证具有所需基因的pVAX.A120载体的线性化，并按照制造商的说明使用GeneJET PCR Purification试剂盒对其进行纯化。
使用MEGAscript试剂盒（使用1 µg线性模板DNA和抗反向CAP类似物（ARCA; [ m7G（5'）G]），使用线性化产物产生mRNA 。反应体积为20 µl（1x）。对于ARCA的共转录上限，与其他核苷一样，GTP的协同作用降低至5 mM，而不是10 mM 。为了增加ARCA是第一基待转录的机会，6毫ARCA的被加入到反应中。
赵Ø本身未修改的mRNA生产基地（ATP，CTP，GTP和UTP）。
经化学修饰的核苷（例如：100％伪UTP，100％N1-甲基伪UTP，25％s2-硫代UTP / 5-甲基CTP和100 ％N1-甲基伪UTP / 100％5-甲基- CTP）用于生成化学修饰的mRNA。Ť能够1示出了一个例子，以生成这两个修饰和未修饰的mRNA。

表1. 1x未修饰或修饰的mRNA
试剂种类
体积（微升）
库存（mM ）
终浓度（mM ）
三磷酸腺苷
2
100
10
CTP /修改后的CTP
2
100
10
UTP /修改后的UTP
2
100
10
GTP
1个
100
5
阿卡
1.2
100
6
10倍反应缓冲
2

质粒DNA
XX .X

DEPC水
XX .X

酵素
5.8

总香精
20

轻弹试管以混合溶液，并用封口膜覆盖盖子。
在37°C下孵育2小时。
加1 μ升涡轮DNase和孵育在37 ℃下15分钟。
按照制造商的说明使用MEGAclear试剂盒清洁反应，并使用Nanaophotometer对其进行定量。
用MEGAclear试剂盒中提供的DEPC水按1：5的比例稀释特定量的纯化mRNA （ng ），以在1 µl中得到100 ng，并在95 °C下变性溶液2分钟。
加载100纳克（1微升）它在安捷伦2100生物分析仪检查大小（标识）和纯度。
将mRNA储存在-80 °C直至进一步使用。

细菌总RNA的制备
生长的大肠杆菌中50米细胞升培养物在37 ℃下为过夜以L B介质。
收集沉淀物通过纺丝在2 ，650 ×g离心15分钟。
均化用的细菌沉淀Precellys演进均化器在2 ，650 ×g下使用在提供0.5毫米玻璃珠管20秒Precellys细菌/真菌的RNA分离试剂盒。
分离吨从使用匀化沉淀otal RNA Precellys细菌/真菌的RNA分离试剂盒。
将细菌RNA储存在-80 °C，直至进一步使用。

血液立方厘米ollection和离体刺激
第一天
收集p eripheral血液从健康成年VO lunteers或患者在含EDTA vacutainer管（所有的血液必须被立即使用）。
加入2毫升血液中的阱12的-孔平板中。
将15 µg含或不含TransIT转染复合物的IVT-mRNA或总细菌RNA / R848（作为阳性对照）添加到2 ml血液中，并轻轻混合。
在含5％CO 2的加湿培养箱中，将血液在3 7°C下孵育6至24小时。
6小时后，收集1 ml血液，并在4 °C下以425 x g的转速旋转10分钟。
收集凝固的分离的血浆b 100d中。将PBMC从血液的剩余部分后红细胞裂解，随后通过离心分离500 ×g下为10分钟，在4 °下进行。
将血浆储存在-20 °C。将PBMC加工成RNA分离物以进行qPCR分析。

第二天
24个小时后，收取1米升剩余的血液，并在425旋转它×g的10分钟。
从凝固的血液中收集分离的血浆。
储存在-20 ℃。

通过ELISA的细胞因子的测量（的TNF-α，INF- α ，INF-γ，IL-6和IL-12p70）
在冰上融化血浆。
使用50 µl收集的血浆，并在用于ELISA试剂盒的适当稀释剂中稀释。
将稀释的血浆加载到预涂的96孔板上。
加载通过连续稀释（1：2稀释）制得的适当标准液。
在37 °C下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。
添加b iotinylated d etection抗体（p repared以下为特异性ELISA指令）。
用洗涤缓冲液（适合特定的ELISA，并包含在试剂盒中）将板洗涤5次。否则，洗涤缓冲液由PBS和0.05％Tween-20组成。确保每次清洗后所有孔都被清洗缓冲液覆盖并浸泡1分钟。
倒出洗涤缓冲液，并用吸收纸干燥孔。
添加HRPÇ （onjugate工作溶液p repared为特异性ELISA以下指令）到每个孔中并温育30分钟，在37℃。
用洗涤缓冲液（适合特定的ELISA）将板洗涤7次。确保每次洗涤都将所有孔盖上洗涤缓冲液并浸泡1分钟。
倒出洗涤缓冲液，并用吸收纸干燥孔。
向每个孔中添加90μl底物试剂。盖上新的平板封口机。在黑暗中于37°C孵育15分钟。
加入50 µl终止液，并使用酶标仪在特定波长（通常为450 nm）下确定每个孔的光密度。
细胞因子水平通过评估插值从标准曲线使用未知值的Michaelis -曼氏模型GRAPHPAD 。棱镜v 6 0.0软件（www.graphpad.com）。

实时RT-PCR
收集总RNA
用于RT-PCR收集和刺激b 100d中如上所述。
代替在6小时和24小时后收集血浆，使用血液收集总RNA。
使用PAXgene Blood RNA试剂盒从血液中收集总RNA 。
检查总RNA的浓度和纯度（RNA完整性数-RIN分数应高于5 ）。
注意：对于qPCR应用，RIN得分高于5（部分降解的RNA ）的效果中等。但是，对于RNA- seq应用，需要RIN得分高于7（纯RNA）。
储存RNA -80 °C。
cDNA合成
使用iScript TM cDNA试剂盒，使用200 ng总RNA进行cDNA合成。
灌注：25°C 7分钟。
逆转录：45℃持续20分钟。
RT失活：95°C 2分钟。
稀释cDNA 1:20。
储存在-20 °C。
基于SYBR-Green的定量实时PCR
在5 µl反应体积中，将5 µl稀释的cDNA与2x Power-SYBR绿色PCR主混合物（7.5 µl ）和正向和反向引物（各1 µl，1.0 µM）一起使用。
在ViiA7中使用以下程序。
我nitial变性10分钟，在95℃。
在95°C下进行15 s的40个循环，在6 0°C下进行2分钟（退火和延伸）。
收集并分析熔解曲线和Ct值。

流式细胞术分析的DsRed的转染b 100d中的样品
为了评估是否的TransIT络合的DsRed mRNA的转染全血中的任何细胞，刺激b 100d中如上所述。
6小时和24小时后，不要采集血浆或总RNA，而应使用全血进行流式细胞术。
加入2ml添加ë rythro cyte裂解缓冲液至2ml全血拌匀。
在室温下孵育10分钟（不要超过孵育时间）。
将试管以500 xg旋转5分钟。
倒出上清液。
用1 ml PBS洗涤细胞。
将其以500 xg的转速旋转5分钟，然后除去PBS，然后将沉淀重悬于FACS缓冲液（PBS中的10％F B S）中。
使用适当的激光和红色通道（DsRed为558 ex / 583 em ）测量DsRed的表达。
检测DsRed阳性细胞的门控策略如图1所示。

图1.全血细胞的门控策略。在红细胞裂解缓冲液处理和分离白细胞后，对细胞进行流式细胞术分析。上图中详细说明了门控策略。简要地说，单重态是根据它们在FSC / SSC图中的位置进行选通的。根据FSC / SSC图中的大小和粒度，对活细胞中的淋巴细胞和单核细胞进行门控。从RFP通道的细胞池中选出DsRed阳性细胞。

每秒钟以100个细胞的流速计算最少50,000个d门d细胞。

RNA免疫遗传测定方案使用R848（Resiquimod ）TLR7 / 8激动剂作为阳性对照，模仿RNA内体进入后的内体TLR7 / 8激活。仅血液样品将用作背景对照，而经TransIT处理的样品将作为适当的阴性对照。

数据分析

细胞因子水平通过从标准曲线使用内插未知值评估的Michaelis -曼氏模型GRAPHPAD 。棱镜v 6 0.0软件（www.graphpad.com）。应用Mann-Whitney U秩和检验或Kruskal - Wallis检验（单向方差分析）分析适当位置IVT-mRNA修饰之间或之中的细胞因子水平差异。使用ViiA7软件v1.2，将每个样品中每个靶基因的相对定量（相对于未刺激的全血）的技术重复量用于检测IVT mRNA的特异性免疫反应。在同一实验设置中，几种细胞因子表达的相似性通过使用Graphpad Prism v.6.0d（www.graphpad.com）进行测试的非参数Spearm an's rank系数，通过不同细胞因子水平之间的相关分析来测试。流式细胞仪数据使用BD FACSDiva TM软件进行分析。有关详细数据，请参阅原始文章（Haque等，2020 ）。

致谢

这项工作得到了ERC起始拨款（授予MSDK，编号637752）和HMZ私人基金会（授予MSDK）的支持。JSA由UKT- fortüne赠款（向JSA，编号2485-0-0）提供财务支持。MM由UKT- fortüne赠款（向MM，编号2412-0-0）提供支持。资助机构在研究设计，数据收集和分析，决定出版或撰写手稿中没有任何作用。我们感谢威利压和所述在细胞和基因治疗权限提交日的协议进展杂志Ë原文ö ˚FRNA免疫原性测定在生物-P rotocol （哈克等人，2020 ）。我们感谢所有自愿献血者的研究。

利益争夺

MSDK持有授权给生物制药公司，RNA修饰专利Ethris有限公司（EP2459231B1），并且被列为有关核酸专利申请主要发明编码修饰的mRNA。MSDK，AH，和JSA按住络合递送化学修饰的mRNA的欧洲专利到纳米颗粒用于所述治疗精神疾病的肺部疾病（EP3398963A1）。

伦理

从健康志愿者和两名成人囊性纤维化患者中采集人血样本。所有参与者均已获得书面知情同意。从德国图宾根儿童大学医院的机构审查委员会获得道德批准（编号：349 / 2013BO2和829 / 2016BO2）。

参考文献

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Haque，AA，Weinmann，P.，Biswas，S.，Handgretinger，R.，Mezger，M.，Kormann，MSD和Antony，JS（2020）。RNA ImmunoGenic分析：检测体外转录的mRNA的免疫原性的简单方法。甲DV Ç ELL ģ烯Ť她的3（2）：E79。
Kariko ，K.，Muramatsu ，H.，Ludwig，J。和Weissman ，D。（2011）。生成用于治疗的最佳mRNA：HPLC纯化消除了免疫激活，并改善了核苷修饰的蛋白质编码mRNA的翻译。Nucleic Acids Res 39（21）：e142。
美国的Sahin，K。Karikó和Ö.Türeci。（2014）。基于mRNA的疗法-开发新型药物。Nat Rev Drug Discov 13（10）：759-780。
Vaidyanathan ，S.，Azizian ，KT，Haque ，AKMA，Henderson，JM，Hendel ，A.，Shore，S.，Antony，JS，Hogrefe ，RI，Kormann ，MSD，Porteus ，MH和McCaffrey，AP（2018）。尿苷消耗和化学修饰无需使用HPLC纯化即可增加Cas9 mRNA活性并降低免疫原性。摩尔疗法核酸12：530-542。