材料和试剂

1. 0.22 µm真空过滤装置（例如Steritop快速释放装置，EMD Millipore，目录号：S2GPT05RE）
2. 0.45 µm真空过滤装置（例如Stericup -HV，EMD Millipore，目录号：SCHVU11RE）
3. ≥50ml注射器（如FISHERBRAND无菌注射器，热电飞世尔科技，产品目录号：15899152）
4. 0.45 µm针头过滤器（例如Millex -HP，EMD Millipore，目录号：SLHP033R）
5.微型NMR管（例如5mm Shigemi管套件，Shigemi ，目录号：BMS-005B）
6.胰蛋白（（Sigma - Aldrich，目录号：T9410）
7.酵母抽提物（Sigma - Aldrich，目录号：Y1625）
8. NaCl（Sigma - Aldrich，目录号：S7653）
9. Na 2 HPO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：S7907）
10. KH 2 PO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：P0662）
11. KCl（Sigma - Aldrich，目录号：P9333）
12. CaCl 2 ·2H 2 O （Sigma - Aldrich，目录号：C5080）
13. MgCl 2 ·6H 2 O （Sigma - Aldrich，目录号：M2670）
14. 15 NH 4 Cl（Sigma - Aldrich，目录号：299251）
15. D 2 O （Sigma - Aldrich，目录号：617385）
16. D-葡萄糖（Sigma - Aldrich，目录号：G7528）
17. MgSO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：M7506）
18.硫胺素（Sigma - Aldrich，目录号：T1270）
19.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG; Sigma - Aldrich，目录号：I6758）
20. LB-中号（Lennox）（请参阅食谱）
21. M9中号（请参阅食谱）
22.的Dulbeccos磷酸缓冲盐溶液与加入的盐（DPBSS）/ NMR样品缓冲液（见配方）

设备

振荡培养箱（如新不伦瑞克伊诺® 42的Eppendorf AG，目录号：M1335-0012 ）
500 ml带挡板的培养瓶（例如ROTILABO带挡板的培养瓶，Carl Roth，目录号：LY96.1）
5 ，000毫升带挡板培养瓶中（如ROTILABO挡板烧瓶，卡尔罗斯，目录号：PK29.1）
细胞密度仪（例如GE Healthcare Ultrospec ，Thermo Fisher Scientific，目录号：10704417）
高速离心机（如Avanti J系列，Beckman Coulter，目录号：B22989 ）
高速大容量的固定角转子（例如J-LITE JLA-16.250，Beckman Coulter公司，目录号：363934 ）配备有合适的离心瓶（如250毫升聚碳酸酯瓶，Beckman Coulter公司，目录号：356013 ）
配有合适的离心管（例如50 ml聚碳酸酯瓶，Beckman Coulter，目录号：357000 ）的高速小体积定角转子（例如JA-25.50，Beckman Coulter，目录号：363055 ）
真空泵，足够强的用于与真空过滤单元使用（极限真空〜0.01 MPA）
涡旋混合器（例如Vortex-Genie 2，Scientific Industries，目录号：SI-0246）
微量分光光度计（例如Nanodrop One，Thermo Fisher Scientific，ND-ONE-W）
SDS页的凝胶电泳系统（例如Mini-PROTEAN Tetra，Bio - R ad，目录号：1658004），包括电源，聚丙烯酰胺凝胶以及必要的缓冲液和染色液（有关详细信息，请参阅制造商规格）

软件

任何spreadsheed或科学绘图软件允许基本计算（Excel中，数字，LabPlot，产地等。）

程序

基因酷龙ING和改造
包含其先前的周质输出信号的目标蛋白的完整基因编码，应克隆到pET表达系统（例如pET21a）的合适质粒主链中。因此，诸如亲和标签之类的附加功能不是必需的，应将其省略。最终的质粒应转化为过量生产OMV的菌株，例如BL21（DE3）∆ ompA （Fantappiè等，2014）。这些步骤可以按照标准的分子生物学技术进行。详细的克隆和转换过程的描述不在此协议的范围内。

准备生长培养基和缓冲液
每个样品的要求是：5 ml LB培养基，1 L M9培养基，25 ml DPBSS，0.2 ml NMR样品缓冲液（有关配方，请参见配方）。增刊与用于菌株的选择适当的抗生素EMENT生长培养基/质粒用于表达。当使用pET表达系统时，使用氨苄西林至终浓度为100 µg ml -1或卡那霉素至终浓度为50 µg ml -1 。可以在H 2 O / D 2 O中制备抗生素（氨苄青霉素：100 mg ml -1 ；卡那霉素：50 mg ml -1 ）和IPTG（1 M）的储备溶液，该溶液对应于用于生长培养基的溶剂。

细菌生长
用单个菌落接种5 ml LB培养基。
在37°C下振摇10小时。
使用1 ml在LB培养基中生长的培养液在500 ml带挡板的培养瓶中接种100 ml M9 。
在37°C下摇动过夜（〜80 rpm，25 mm轨道）。
在5,000 ml带挡板的培养瓶中，将整个预培养物添加到900 ml M9中。
在37°C（〜80 rpm，25 mm轨道）上摇晃。
每30分钟检查一次光密度OD 600 。
当光密度达到OD 600 〜0.4添加IPTG至0.2mM的终浓度来诱导蛋白表达。
每隔30分钟继续监控OD 600的光密度。
当细菌生长停止（后〜3小时H中2 O / 5〜在dħ 2 O系介质，参见图1）通过以10除去细胞，000 ×g下在10℃下10分钟。
用0.45 µm真空过滤装置过滤上清液。过滤后的上清液可在4°C下保存长达24小时。

图1.依赖媒体的增长行为。基于H 2 O的（深蓝色）和基于D 2 O的（浅蓝色）M9基本培养基的示例性生长曲线。三角形标记着感应的时间，正方形标记着收获的时间。

OMV准备
通过在10°C下以38,400 xg离心2 h从过滤的上清液中收集OMV 。离心后，离心瓶应装有一个小的但清晰可见的发白，微浊的沉淀（图2A）。
立即丢弃上清液（OMV沉淀将很快开始悬浮）。
通过移液将OMV沉淀重悬于25 ml DPBSS中。
用0.45 µm注射器过滤器过滤OMV悬浮液。
通过在10°C下使用单个离心管以74,500 xg离心45分钟来收集OMV （图2B）。
立即丢弃上清液。
通过轻轻涡旋将OMV沉淀重悬于200 µl NMR样品缓冲液中。
保存2微升OMV悬浮液用于SU的b序贯分析和传输剩余的悬浮液，以微尺度NMR管中（图2C）。OMV悬浮液在我们手中可以在4°C的温度下稳定长达2周。

图2. OMV的制备。第一次（A）和第二次离心（B）后将OMV沉淀，然后重悬在5 mm Shigemi NMR管（C）中的NMR缓冲液中。

OMV分析
用18 µl DPBSS稀释2 µl最终的OMV悬浮液。
记录稀OMV悬浮液的UV-Vis光谱使用微量分光光度计（范围：220 - 360 nm），而导出的光谱数据用于进一步分析。
根据OMV的光散射作用校正输出光谱，并根据280 nm处的吸光度估算蛋白质浓度（请参见数据分析和图3A）。OMV制剂应包含> 15 mg / ml的总蛋白，以产生高质量的NMR光谱。
使用变性Laemmli样品缓冲液为SDS页面准备两个样品，每个样品缓冲液中总蛋白质约6 µg。
将其中一个样品在98°C下加热变性15分钟，将第二个样品保持在室温下。
通过SDS页面分析样品。富含蛋白质的OMV样品应产生两个突出的条带。一个对应于OMV膜中主要孔蛋白OmpF / OmpC的条带在热变性样品中以37 kDa的频率运行，并在未加热的样品中导致60至70 kDa之间的扭曲的梯状图案（图3B）。通常不会受到热修饰的第二条带应以所选的过表达蛋白的重量存在，表明成功富集了OMV（图3B）。

图3.用分光光度法和SDS-page分析OMV 。A.在光散射校正之前（虚线）和在光散射校正之后（实线）的稀释的OMV悬浮液的示例性UV-Vis光谱。B.富含周质蛋白（深蓝色三角形）的OMV的示例性SDS页面凝胶。主孔OmpF / OmpC的标记是淡蓝色的空心三角形。

数据分析

基于在280 nm波长处的吸光度测量值对样品中蛋白质浓度进行分光光度估计是一种简单，快速且常规使用的方法。但是，OMV记录的UV-Vis光谱包含强光散射成分。为了估计OMV样品中的蛋白质浓度，需要纠正由于囊泡引起的光散射。可以使用以下方程式获得经光散射校正的UV-Vis光谱，该方程式最初用于估算病毒的核酸含量（Porterfield和Zlotnick，2010年）：

假设OMV中存在的蛋白质混合物为1 Abs = 1 mg ml -1 ，则可以从A 280的校正值估算OMV样品中的总蛋白质浓度。由于OMV中存在核酸（Brown等人，2015），这会严重影响280 nm处的吸光度，因此根据A 260 / A 280比值估算样品中核酸的量非常有用光散射校正光谱，可以使用以下经验方程式完成（Glasel，1995）：

通常，富含蛋白质的OMV包含≤3％的核酸。如果检测到核酸（[％N]> 0），则可以使用以下方程式（Layne，1957年）根据校正后的A 280和A 260值估算OMV样品中的总蛋白浓度：

笔记

典型地，富集的OMV的足够量可以从1升生长培养物体积使用的培养条件去获得小号以上cribed。然而，应该指出的是，与基于H 2 O的培养基相比，基于D 2 O的培养基中细菌的繁殖性较差，偶尔会导致不规则的生长行为和/或较低的产量。此外，应注意的是，在周质空间中蛋白质的过表达会导致细胞毒性（Schlegel等人，2013），这可能需要诱导水平与所使用的表达系统进行特异性匹配。

菜谱

LB-中号（Lennox）
10克/升胰蛋白p
5 g / L酵母提取物
5克/升氯化钠
溶于H 2 O并通过高压灭菌器灭菌
M9中号
6 g / L Na 2 HPO 4
3克/升KH 2 PO 4
1克/升15 NH 4 Cl
0.5克/升氯化钠
2克/升D-葡萄糖
1 ml / L CaCl 2 （0.1 M）溶液*
1 ml / L MgSO 4 （1 M）溶液*
0.1毫升/升硫胺素（10毫克/毫升）溶液*
将固体成分溶解在H 2 O / D 2 O中，添加盐/硫胺素溶液，并使用0.22 µm真空过滤装置过滤，进行灭菌。
*注：P repare储备溶液H中2 O / d 2分别为O，。
含盐的Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水（DPBSS）/ NMR样品缓冲液：
1.15 g / L Na 2 HPO 4
0.2克/升KH 2 PO 4
8克/升氯化钠
0.2克/升氯化钾
0.45 ml / L CaCl 2 （1 M）溶液
0.25 ml / L MgCl 2 （1 M）溶液
将固体成分溶解在H 2 O *中，添加盐溶液，并使用0.22 µm真空过滤装置进行过滤灭菌。
*注：˚F或NMR样品缓冲液，溶解H中2 O操作90％的最终体积，然后加入10％d 2 O.

致谢

我们感谢G. Grandi （特伦托大学）提供了大肠杆菌BL21（DE）ΔompA菌株。JT获得了EMBO长期奖学金（ALTF 413-2018）的支持。BMB非常感激瑞典研究委员会（Vetenskapsrådet起始拨款2016-04721）和Knut och Alice Wallenberg基金会通过Wallenberg学院奖学金（2016.0163）以及瑞典哥德堡大学Wallenberg分子和转化医学中心提供的资金。
该协议最初在Thoma和Burmann （2020）中进行了描述。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考文献

黄铜，JM，希金斯，CF，Foley，M.，Rugman，PA，伯明翰，J。和Garland，PB（1986）。蛋白质在大肠杆菌周围质的横向扩散。Ĵ细菌学165（3）：787-795。
Brown，L.，Wolf，JM，Prados -Rosales，R.和Casadevall ，A.（2015）。穿过壁：革兰氏阳性细菌，分枝杆菌和真菌中的细胞外囊泡。Nat Rev Microbiol 13（10）：620-630。
Chutkan ，H.，Macdonald，I.，Manning，A.和Kuehn，MJ（2013）。细菌外膜囊泡的定量和定性制剂。方法分子生物学966：259-272。
Fantappi è ，L.，德桑蒂斯，M.，Chiarot ，E.，CARBONI ，F.，笨死，G.，Jousson ，O.，Margarit的，I。和格兰迪，G。（2014）。经工程改造的大肠杆菌OMV在其管腔中携带异源抗原诱导的抗体介导的免疫。J Extracell囊泡3。
Glasel ，JA（1995）。通过260nm / 280nm吸光度比监控核酸纯度的有效性。生物技术18（1）：62-63。
Layne，E。（1957）。分光光度法和浊度法测量蛋白质。在：Colowick ，PS和Kaplan，NO （编）。酶学方法。纽约，学术出版社，447-454。
Meuskens ，I.，Michalik ，M.，Chauhan，N.，Linke ，D.和Leo，JC（2017）。用于改善外膜蛋白表达的新菌株集合。前细胞感染微生物7：464。
奥利弗，DB（1996）。周质。在：大肠杆菌和沙门氏菌，第。26.可在以下网址获得：papers3：// publication / uuid / D3FF17F1-8B39-4CD7-B786-D17CA6614412。
Porterfield，JZ和Zlotnick ，A。（2010）。一种简单而通用的方法，通过紫外线吸收来确定病毒的蛋白质和核酸含量。病毒学407（2）：281-288。
Schlegel，S.，Rujas，E.，Ytterberg，AJ，Zubarev，RA，Luirink，J.和de Gier，JW（2013）。通过调节基因表达水平来优化大肠杆菌周质中的异源蛋白质生产。微生物细胞事实12：24 。
Schwechheimer ，C.和Kuehn，MJ（2015）。革兰氏阴性细菌的外膜囊泡：生物发生和功能。Nat Rev Microbiol 13（10）：605-619。
Schwechheimer ，C.，Kulp ，A. and Kuehn，MJ（2014）。通过包膜结构和含量调节细菌外膜囊泡的产生。BMC Microbiol 14：324。
托马，J.，Manioglu ，S.，Kalbermatter ，D.，包西蒙，PD，Fotiadis，D.和M ü缪勒，DJ（2018）。富含蛋白质的外膜囊泡作为外膜蛋白研究的天然平台。公共生物学1：23 。
Thoma，J.和Burmann，BM（2020）。外膜囊泡中细菌包膜蛋白的高分辨率原位NMR光谱分析。生物化学59（17）：1656-1660。
特恩布尔，L.，Toyofuku ，M.，Hynen ，AL，黑泽，M.，Pessi ，G.，配第，NK，Osvath ，SR，Carcamo-奥亚尔塞，G.，Gloag ，ES，希莫尼，R.，Omasits ， U.，Ito，S.，Yap，X.，Monahan，LG，Cavaliere，R.，Ahrens，CH，Charles，IG，Nomura，N.，Eberl ，L. and Whitchurch ，CB（2016）。爆炸性细胞裂解是细菌膜囊泡和生物膜生物合成的机制。Nat Commun 7：11220。