材料和试剂

用料
移液器吸头（200μl ，1 ml）
细胞过滤器70 μ米（康宁，目录号：352350）
Nunclon Sphera 96孔板，U型底（Thermo Fisher Scientific，目录号：174929）
组织培养96孔板，聚苯乙烯（Greiner Bio-One，目录号：655180）
组织培养6孔板，聚苯乙烯（BD ，Falcon，目录号：08-772-1B）
血清吸管5米升（Fisher Scientific公司，目录号：13-678-11D）
血清吸管10米升（Fisher Scientific公司，目录号：13-678-11E）
15 m l聚丙烯锥形管（Thermo Scientific，目录号：339650）
50 m l聚丙烯锥形管（Thermo Scientific，目录号：339652）
的Nalgene过滤器（0.2 μ米PES膜）150米升物（Thermo Scientific，目录号：5650020）
的Nalgene过滤器（0.2 μ米PES膜）250米升物（Thermo Scientific，目录号：5680020）
微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）

试剂种类
1.从健康供体中产生的hiPSC （Chen等人，2013和2017）
2. Matrigel（Corning，目录号：354234）
3. PeproGrow胚胎干细胞（hESC ）培养基（Peprotech ，目录号：BM- hESC ）
4. Accutase （Millipore Sigma，目录号：SCR005）
5.磷酸盐缓冲盐水，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010049）
6. DMEM / F12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330032）
7. Stempro-34培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：10639011）
8. L-谷氨酰胺（200 mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
9. 1-硫代甘油（MTG）（Sigma-Aldrich，目录号：M6145）
10.抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4034）
11. MEM非必需氨基酸（NEAA 100x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140-050）
12.阻石剂Y-27632（Selleck Chemicals，目录号：S1049）
13.重组人BMP4（Peprotech ，目录号：120-05ET）
14.重组人VEGF（Peprotech ，目录号：100-20）
15.重组人TPO（Peprotech ，目录号：300-18）
16.重组人Flt3-配体（Peprotech ，目录号：300-19）
17.重组人IL-3（Peprotech ，目录号：200-03）
18.重组人MCSF（Peprotech ，目录号：300-25）
19.重组人类RANKL（Peprotech ，目录号：310-01）
20.重组人TGF- β1（Peprotech ，目录号：100-21C）
21.重组人SCF（Peprotech ，目录号：300-07）
22.碱性重组人FGF（Peprotech ，目录号：100-18B）
23.明胶0.1％溶液（EMD密理博，目录号：ES-006-B）
24.先进的DMEM介质（Thermo Fisher Scientific，目录号：12491023）
25. Alpha MEM培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：12571063）
26.胎牛血清（Gibco，目录号：10437020）
27. 1 α，25-二羟基维生素d 3 （Sigma Aldrich公司，目录号：D1530）
28. CD14抗体（FITC共轭；Biolegend ，目录号：325604）
29. CD43抗体（APC偶联，Miltenyi Biotec ，目录号：560198）
30. CD45抗体（APC共轭，Biolegend ，目录号：304012）
31. EDTA 0.5 M，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15575-038）
32. TRIzol （赛默飞世尔科技，目录号：10296028）
33.指示按ZOL RNA（ZYMO研究，目录号：R2052）
34. DNase I（Invitrogen，目录号：18068015）
35.上标II逆转录酶（Invitrogen，目录号：18064071）
36. SsoAdvanced通用SYBR Green Supermix （Bio-Rad，目录号：1725271）
37.戊二醛25％溶液（Alfa Aesar ，目录号：A17876）
38.酸性磷酸酶，白细胞（TRAP）试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：387A）
39.通过qPCR检测中胚层分化和破骨细胞成熟的引物（表1）
40.基质胶涂料溶液（请参见食谱）
41. hiPSC培养基（请参阅食谱）
42. EB中胚层分化培养基-1（请参阅食谱）
43. EB中胚层分化培养基2（请参阅食谱）
44.骨髓单核细胞膨胀培养基（见食谱）
45. FACS缓冲区（请参阅食谱）
46.破骨细胞分化培养基（参见食谱）
47. TRAP染色液（请参阅配方）
48.重组hBMP4（请参阅食谱）
49.重构其他细胞因子（见食谱）

表1 。qPCR引物序列，用于检测中胚层分化和破骨细胞生成的标记基因表达
基因
正向底漆
反向底漆
CDX2
5'- CCCTAGGAAGCCAAGTGAAAACC -3'
5'- CTCCTTGGCTCTGCGGTTCTG -3'
CD34
5′-AAATCCTCTTCCTCTGAGGCTGGA-3′
5'-AAGAGGCAGCTGGTGATAAGGGTT-3'
Brachyury（T）
5′-TGTCCCAGGTGGCTTACAGATGAA-3′
5′-GGTGTGCCAAAGTTGCCAATACAC-3′
手动1
5'- GAAAGCAAGCGGAAAAGGGAG -3'
5'- GGTGCGCCCTTTAATCCTCTT -3'
SCL
5'-AAGGGCACAGCATCTGTAGTCA-3'
5'-AAGTCTTCAGCAGAGGGTCACGTA-3'
CTSK
5'- CAGTGAAGAGGTGGTTCAGA -3'
5'- AGAGTCTTGGGGCTCTACCTT -3'
降钙素受体
5′-TCTCAGGAGTGAAAGCATTGCACATA-3′
5′-AATGCTATGACCGAATGCAGCAGTTA-3′
NFATc1
5'-AGAATTCGGCTTGCACAGG -3'
5'- CTCTGGTGGAGAAGCAGAGC -3'
陷阱（APC5）
5'-ACCTAGTTTGTTCTCTGATCGCCT-3'
5'-GGGATCTGTAATCTGACTCTGTCCTT-3'
高性能放射治疗
5'-ACTTGTCGCAGAAGCATC-3'
5'-GTGGGCGAACAGTGTAGAA-3'

设备

P ipettes
水浴
AirClean 600 PCR工作站（AirClean Systems，型号：AC648A）
体视显微镜（卡尔·蔡司，型号：Semi 508）
细胞培养培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 240i，目录号：51026332 ）
Eppendorf冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）
CFX96触摸实时PCR检测系统（Bio-Rad，目录号：1855196）
MACSQuant分析仪10（Miltenyi Biotech，目录号：130-096-343 ）
立式显微镜（卡尔·蔡司，型号：Axio Imager.D2m）
台式扫描电子显微镜（日立，型号：TM1000）

软件

CFX管理器软件（Bio-Rad，18450000）
FlowJo TM软件（BD Bioscience，https： //www.flowjo.com/ ）
GraphPad Prism（GraphPad，https : //www.graphpad.com/ ）
斐济ImageJ（NIH，image.nih.gov）
ZEN显微镜软件（Zeiss，https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen-lite.html）

程序

维持hiPSC文化
1.通过添加1准备基质胶包被的6孔板米升涂布的溶液（见ř ecipe表4 ）至每孔并离开在室温下将板在使用前1个小时。
2.保持的hiPSC在PeproGrow的hESC培养基（参见ř ecipe表5 ）和c焊割介质每隔一天。
3.每4-5天通过未分化的hiPSC 。
一种。吸旧培养基并加入2米升新鲜PeproGrow的hESC培养基到每个孔中。
b。刮未分化的hiPSC菌落到200个使用小片μ升的内立体显微镜下枪头爱尔PCR工作站。根据大小，hiPSC菌落可分为15-40个碎片。
C。从新制备的板中吸出Matrigel涂层溶液，并将提升的hiPSC片段转移到新的Matrigel涂层板中。

的中胚层分化的hiPSC衍生的胚状波管芯（EBS）（第1阶段）
1.检查的hiPSC的文化和确保人iPS细胞是未分化的。提起并取下分化的hiPSC ，如果有的话，使用200 μ升移液管尖端在PCR工作站在显微镜下。
2.预热37份等分的Accutase溶液 °C水浴10分钟。
3.吸出hiPSC培养基。洗涤的hiPSC用预热的PBS（2米升每孔）的两倍。向每个孔中加入1 ml的Accutase溶液，并将培养板在37 °C的培养箱中培养10分钟。
4.向每个孔中加入2 ml DMEM / F12培养基。移液管与细胞悬浮液10米升移液管轻轻地上下撞出的hiPSC 。将内容物转移到50 mL锥形管中。
5.在4 °C下以340 xg离心细胞7分钟。在EB基础培养基1中重悬细胞（请参见表6 ）。使用70过滤细胞μ米滤网。计数细胞。
6.板15,000个细胞至每孔中150 μ升EB中胚层分化培养基-1（见配方表6 ）上的Nunclon Sphera 96孔板。将板在5％CO 2和5％O 2培养箱中于37 °C放置2天。每个孔形成一个EB。
7.通过吸取出75更改半介质μ升EB mesode的RM分化培养基-1和加入75 μ升EB中胚层分化培养基-2（见配方表7 ）。
8.将板在5％CO 2和5％O 2培养箱中于37 °C再放置2天。
9.通过qPCR检查培养1、2、3和4天的EB中中胚层标记基因的表达水平，从而分析中胚层分化（图1）。

图1 。中胚层标志物基因的表达水平hCDX2 ，hCD34 ，HSCL ，HT ，hHand ，EB中为1，2，3培养时，d 4天（D1，D2，D3和D4）。*与第1天的样本相比，单向ANOVA的* P < 0.05。数据是相对定量和Pr esented为平均值±SEM。

EB释放的骨髓单核细胞数量增加（第2阶段）
1.通过在6孔板的每个孔中加入1 ml 0.1％明胶溶液来制备明胶包被的板，并在使用前在室温下放置1 h。
2.收集的EB从Nunclon Sphera通过使用抽吸出与的EB培养基中96孔板1米升移液管尖端和这些的EB转移到50米升锥形管。
3.让EB在重力作用下沉下3-5分钟。
4.用玻璃巴氏吸管吸出培养基CA REFU LLY而不在底部除去的EB。
5.根据EB的数量，将EB悬浮在骨髓单核细胞膨胀培养基中（请参见配方表8 ）。在6孔板的一个孔中用40 ml的骨髓单核细胞扩增培养基接种40-50 EB 。例如：从一个完整的96孔板中收集的EB可以重悬在8 ml培养基中，并铺在明胶包被的6孔板的2个孔中。
6.将板置于5％CO 2和5％O 2培养箱中的37 °C下。
7. EB附着在板上。一些细胞从EB释放。漂浮的非粘附细胞是骨髓单核细胞群。
8.后4天用相同培养基，但增加变化膨胀介质hMCSF从50纳克/浓度米升至100毫微克/米升。
9.继续培养13天（培养基在第4、8、12和16天变化）。
10.收集第10、13、17、21天从EB释放的浮细胞，并用抗CD14（1:20），CD43（1:50）和CD45（1:50）的一抗在FACS缓冲液中染色（参见食谱表9 ）在冰上放置30分钟。避光。表2显示了FACS分析数据。

表2 。流式细胞术分析第二阶段第10、13、17和21天收集的细胞中CD14，CD43和CD45的表达

CD14 + （％）
CD43 + （％）
CD45 + （％）
第十天
37.78±15.36
41.80±26.94
64.76±19.83
第十三天
59.13±24.56
76.28±14.56
75.01±15.96
第17天
79.53±18.02
83.18±11.03
86.76±6.74
第21天
84.77±5.05
59.50±13.38
72.18±11.09
呈现的数据：平均值±SD。从3条hiPSC线收集的数据。每行有3-4个技术重复。
促进破骨细胞成熟（阶段3）
1.收集漂浮的细胞（第2阶段17天），以15微米升或50米升锥形管中。通常，从在明胶包被的6孔板的一孔中生长的EB可以预期得到0.2-0.45百万个细胞。
2.在4 °C下以340 xg离心细胞7分钟。计数细胞。
3.在96孔板中和骨片上以每孔1 0,000个细胞的密度铺板细胞。
4.在破骨细胞分化培养基中培养破骨细胞祖细胞（参见配方表10 ）。每2-3天更换培养基。
5.在破骨细胞分化培养基中于7-10天形成多核成熟破骨细胞（图2A）。
6.修复的hiPSC -OCs在对TRAP染色10-12天（图2B-2C）。
一种。除去培养基。用PBS轻轻清洗一次。
b。修复细胞在2.5％戊二醛（150 μ升每孔）在室温下10分钟。
C。准备TRAP染色溶液（请参见配方表11 ）。
d。加入100 μ升的TRAP溶液在各孔的96孔板中。
e。将培养板在37 °C下孵育45分钟至1小时。
F。删除TRAP解决方案。用蒸馏水冲洗板。
G。拍摄图像之前先将其干燥。
7.在第14天将TRAP染色的细胞固定在骨屑上。用TM1000台式扫描电子显微镜拍摄吸收凹坑的图像（图2D）。
8.通过qPCR检查破骨细胞标记基因的表达水平，确认破骨细胞的分化状态（表3）。

图2 。hiPSC -OC文化。一。在OC分化培养基中培养第10天时，hiPSC -OC培养的亮场。比例尺= 100 μ米; 乙。一孔96孔板的TRAP染色。紫色大细胞是TRAP阳性多核破骨细胞；Ç 。TRAP-阳性多核细胞的高倍放大。比例尺= 100 μ米; d 。骨屑上的吸收凹坑（以黄色星号表示）。大黑点是TRAP阳性破骨细胞。比例尺= 200 μ米。

表3 。的破骨细胞的标记基因表达水平的定量PCR数据中的hiPSC -osteoclasts

hTRAP
hNFATc1
组织蛋白酶K（CTSK）
降钙素R
OC祖细胞
0.95±0.09
1.10±0.09
1.05±0.08
1.60±1.22
成熟的OC
7.09±1.90 *
7.66±1.99 *
22.82±3.25 *
39.22±10.08 *
呈现的数据：平均值±SD。从3条hiPSC线收集的数据。每行有3个技术重复。*根据学生的t检验，P < 0.05 。OC祖细胞17天收集的漂浮细胞级2的和没有破骨细胞分化培养基中培养1个α ，25-二羟基维生素d 3 ，hTGF β -1，hRANKL 。

数据分析

1.使用CFX Manager软件分析qPCR数据。显着性差异由学生的t检验或单向方差分析确定，然后由Tukey使用GraphPad Prism软件进行事后检验。
2.使用FlowJo软件分析流式细胞仪数据。

笔记

干细胞的分化效率可以根据EB的大小而变化（Moon等，2014； Ng等，2015）。实现形成均匀尺寸的EB的步骤是很重要的洽的效率的hiPSC -OCs分化。
我们根据流式细胞仪数据确定CD14，CD43和CD45的表达水平，将第2阶段的持续时间确定为17天，这些水平在这17天中表达最高，与其他时间点相比变化很小。
的非特异性/自发分化的hiPSC可以由内的非均匀形貌被识别的hiPSC菌落。分化通常始于大的hiPSC集落的中心，在明场显微镜下显示为暗场。
同基因的hiPSC有除了已引入遗传变异型的相同的遗传背景。因此，当研究人员旨在确定特定疾病突变的影响时，等基因hiPSC是最佳的对照。

菜谱

基质胶涂覆搜索解决方案Ñ （表4 ）
一种。解冻冷冻的Matrigel在冰箱中过夜，并等分基质胶在冰冷的微量离心管（60 μ升用于一个6孔板）
b。在冰上解冻基质胶等分试样，然后将基质胶转移到冰冷的DMEM / F12培养基中。对于一个6孔板中，添加60 μ升的Matrigel至6米升DMEM / F12培养基

表4 。基质胶涂料溶液
组成
体积（一个6孔板）
基质胶
60 μ升
DMEM / F12培养基
600万升

hiPSC培养基（表5 ）
在打开前用冻干的Peprotech生长因子离心管形瓶，并用无菌水复溶。使用500 μ升水各500米升PeproGrow的hESC基础培养基试剂盒
无菌地将重建的生长因子添加到基础培养基中，并通过旋流或移液将其充分混合。储存在2-8 °C并在2周内使用

表5 。hiPSC培养基
组成
卷
PeproGrow hESC培养基
500百万升
Peprotech生长因子
500 μ升

EB中胚层分化培养基mediu m-1 （表6 ）
制备100 m l EB中胚层分化培养基，如表6所示
除菌EB基础培养基（包括的StemPro-34，L-谷氨酰胺，MTG）由通过0.2过滤μ米PES膜过滤器，并保持在2-8 ℃下长达1个月
使用前在EB基础培养基中添加hBMP4，hVEGF ，Y-27632和抗坏血酸

表6 。E B中胚层分化培养基-1
组成
卷
最终浓度
Stempro-34基础培养基
99百万升

L-谷氨酰胺（200毫米）
1升
2毫米
MTG（1150万）
3.5 μ升
0.4毫米
hBMP4（100毫微克/ μ升）
25 μ升
25纳克/立方米升
hVEGF的（100毫微克/ μ升）
50 μ升
50纳克/立方米升
阻石剂Y-27632（10 mM）
100 μ升
10 μ中号
抗坏血酸（25 mg / ml ）
200 μ升
50 μ克/米升

EB中胚层分化培养基2 （表7 ）
制备100 m l EB中胚层分化培养基，如表7所示
除菌EB基础培养基（包括的StemPro-34，L-谷氨酰胺，MTG）由通过0.2过滤μ米PES膜过滤器，并保持在2-8 ℃下长达1个月
在使用前，在EB基础培养基中添加2x浓度的hBMP4，hVEGF ，Y-27632和抗坏血酸

选项卡乐7 。EB中胚层分化培养基2
组成
卷
最终浓度
Stempro-34基础培养基
99百万升

L-谷氨酰胺（200毫米）
1升
2毫米
MTG（1150万）
3.5 μ升
0.4毫米
hBMP4（100毫微克/ μ升）
50 μ升
50纳克/立方米升
hVEGF的（100毫微克/ μ升）
100 μ升
100毫微克/米升
hTPO （100毫微克/ μ升）
100 μ升
100毫微克/米升
hFLT3 -配体（100毫微克/ μ升）
100 μ升
100毫微克/米升
HSCF （100毫微克/ μ升）
100 μ升
100毫微克/米升
hFGF基本（40毫微克/ μ升）
100 μ升
40纳克/立方米升
抗坏血酸（25 mg / ml ）
400 μ升
100 μ克/米升

骨髓单核细胞膨胀培养基（表8 ）
如表8所示准备100 m l的骨髓单核细胞膨胀培养基
消毒骨髓膨胀介质（包括高级DMEM，FBS，L-谷氨酰胺，β -巯基乙醇通过一个0.2滤波）μ米PES膜过滤器，并保持在2-8 ℃下长达1个月
仅在使用前无菌添加hIL-3和hM -CSF。增加HM 50至100毫微克/ -CSF浓度米升从第4天更换培养基开始

TABL ê 8 。骨髓单核细胞膨胀培养基
组成
卷
最终浓度
先进的DMEM培养基
88.5百万升

胎牛血清
10百万升
10％
L-谷氨酰胺（200毫米）
0.5升
1毫米
NEAA（100倍）
1升
1倍
 -巯基乙醇
50 μ升
0.1毫米
的hIL-3（100毫微克/ μ升）
25 μ升
25纳克/立方米升
HM -CSF（100毫微克/ μ升）
50或100 μ升
50或100 ng / ml

FACS缓冲区（表9 ）
如表9所示准备500 ml的FACS缓冲液
储存于2-8 °C长达6个月

表9 。FACS缓冲区
组成
卷
最终浓度
PBS
488百万升

胎牛血清
10百万升
2％
EDTA（50万）
2升
2毫米

破骨细胞分化培养基（表10 ）
一种。制备100 ml破骨细胞分化培养基，如表10所示
b。除菌破骨细胞不同点吨离子基础培养基（包括α-MEM，FBS）由通过0.2过滤μ米PES膜过滤器，并保持在2-8 ℃下长达1个月
C。补充维生素d，hTGF β ，hMCSF和hRANKL无菌只使用前

表10 。破骨细胞分化培养基
组成
卷
最终浓度
阿尔法MEM
90百万升

胎牛血清
10百万升
10％
1个α ，25-二羟基维生素d 3
2 x 10 -4百万
2个10 -7 M
hTGF β -1（20毫微克/ μ升）
25 μ升
5纳克/立方米升
hMCSF （100毫微克/ μ升）
30 μ升
30纳克/立方米升
hRANKL （100毫微克/ μ升）
50 μ升
50纳克/立方米升

TRAP染色液（表1 1 ）
酸性磷酸酶白细胞（TRAP）试剂盒中包含所有试剂
预混快速石榴石GBC和硝酸钠
2分钟后添加其余试剂

表1 1 。T RAP染色液
组成
卷
蒸馏水
11.25米升
快速石榴石GBC
125 μ升
硝酸钠
125 μ升
Napthol AS-BI磷酸溶液
125 μ升
醋酸溶液
500 μ升
酒石酸盐溶液
250 μ升

重组hBMP4
打开之前将小瓶离心
重新构建在5mM盐酸，pH为3.0至0.1-1.0毫克/升的浓度米升
不要涡旋
在含有0.1％BSA作为载体蛋白的缓冲液中进一步稀释，并以等分试样的方式储存在-80 °C
重构其他细胞因子
Ç Ë ntrifuge小瓶在打开之前
重新构建在水中以0.1-1.0毫克/升的浓度米升
不要涡旋
在含有0.1％BSA作为载体蛋白的缓冲液中进一步稀释，并以等分试样的方式储存在-80 °C

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助（K99 / R00 DE021442和R01 DE025664）。我们使用M-CSF和IL-3修改了已发表的方案用于骨髓分化（Panicker等，2012 ; Jeon等，2016 ）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所述的hiPSC从外周血行如所描述的前一个产生（陈等人，2013 ;陈等人，2017 ）。这项工作符合康涅狄格州卫生大学机构审查委员会的指导原则（IRB协议09-199）。

参考文献

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