材料和试剂

玻璃巴斯德移液器（Deltalab ，目录号：702）
5 ml敞口聚丙烯管（Beckman Coulter，目录号：326819）
（可选）13 ml开顶聚丙烯试管（Beckman Coulter，目录号：331372）
（可选）液氮
米拉布（Merck Milipore ，目录号：475855-1R ）
海沙（Merck，货号：1.07712.1000）
蔗糖（Carlo Erba试剂，目录号：365157）
NaH 2 PO 4 。H 2 O （默克，目录号：1.06346.0500）
NaCl（VWR化学品，目录号：27810.364）
NaOH（AppliChem，目录号：131687.1211）
Tween-20（Sigma Aldrich，目录号：P1379-500ml）
PMSF（Sigma Aldrich，目录号：93482-50ml-F）
完整的TM蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，目录号：11697498001）
BODIPY 493/503 （Thermo Fisher，货号：D3922）
尼罗河红（Thermo Fisher，产品目录号：N1142）
DMSO（默克（Merck），目录号：1.02952.1000）
甲醇（Sigma Aldrich，目录号：32213-2.5LM）
（可选）35 S :: CLO3：GFP转基因拟南芥植物
基础缓冲液（600毫升）（请参阅食谱）
蔗糖缓冲液（每种100毫升）（请参阅食谱）
1.2 M蔗糖缓冲液
0.8 M蔗糖缓冲液
0.4 M蔗糖缓冲液
补充的基本缓冲液（300毫升）（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲液（100毫升）（请参阅食谱）
库存（请参阅食谱）
1毫克/毫升BODIPY 495/503
1 mg / ml尼罗红
50毫米PMSF

设备

P1000移液器
漏斗
研钵和研杵
剪刀
超速离心机（贝克曼库尔特，型号Optima L-100 XP）
转子SW55 Ti （Beckman Coulter，目录号：342194）
（可选）转子SW41 Ti （贝克曼库尔特，目录号：331362）
荧光显微镜（徕卡，TCS-SP8型）
pH计（哈希，型号SensION TM pH 3，目录号：LPV2000.98.0002）
（可选）流式细胞仪（Beckman Coulter，型号Galios TM ）
（可选）标准SDS-PAGE和Western blot设备
程序

缓冲液制备（有关详细配方，请参阅协议末尾）
在提取日之前，准备以下基本缓冲液并保持在4°C（可能保持数周）：
碱缓冲液：10mM的NaH 2 PO 4 ，150mM的氯化钠，pH值7.5。使用前高压灭菌并保持在4°C（在提取的当天会添加其他成分）。
蔗糖缓冲液：将蔗糖溶解在基本缓冲液中，制成浓度分别为1.2 M，0.8 M和0.4 M的三种蔗糖缓冲液。进行过滤灭菌或高压灭菌，并保持在4 °C。
注意：高压灭菌蔗糖溶液时要小心，因为它们容易焦糖化。在最高121°C下高压灭菌不超过15分钟。
磷酸盐缓冲液：10 mM NaH 2 PO 4 ，pH 7.5。准备并高压灭菌。
尼罗河红和BODIPY 493/503股票。保持在-20°C。
在提取之日，完成缓冲液的准备工作如下：
补充基本缓冲液，含0.2％（v / v）Tween-20、2 mM PMSF和2 x蛋白酶抑制剂混合物。
混合等体积的补充基础缓冲液和每种蔗糖缓冲液（1.2 M，0.8 M和0.4 M），分别制备提取缓冲液，漂浮缓冲液1和漂浮缓冲液2。

最后，最终的缓冲区组成将是：
-提取缓冲液：0.6 M蔗糖，10 mM NaH 2 PO 4 ，pH 7.5、150 mM NaCl，0.1％（v / v）Tween- 20、1 mM PMSF，1x蛋白酶抑制剂混合物。
-漂浮缓冲液1：0.4 M蔗糖，10 mM NaH 2 PO 4 ，pH 7.5、150 mM NaCl，0.1％（v / v）Tween- 20、1 mM PMSF，1x蛋白酶抑制剂混合物。
-浮动缓冲液2：0.2 M蔗糖，10 mM NaH 2 PO 4 ，pH 7.5、150 mM NaCl，0.1％（v / v）Tween- 20、1 mM PMSF，1x蛋白酶抑制剂混合物。

脂质液滴提取（图1）
在冰上预冷研钵和杵。
提示：可以添加少量液氮以加速冷却，但不可在研磨前立即冷却，以免组织冻结。为了提高LD的产量和质量，重要的是，在研磨过程中，组织必须保持冷却而不冻结。
收集组织（2.5克完全展开的叶子）。用一个剪刀，剪叶切成小块（约0.5〜1厘米），并放置在冰冷的砂浆。
注意：LDs的回收将取决于实验条件。这里提出的起始量（2.5 g）足以在LD诱导条件下，例如衰老和病原体感染下叶片（Fernández-Santos等，2020）。如果此数量不足以解决问题，请使用转子SW41-Ti和13 ml试管将每个样品的最大量放大至6.5 g。
加入5克海砂（磨料）和5毫升预冷的提取缓冲液。研磨2-3分钟，直到形成均匀的混合物。研磨时将研钵放在冰上。
将匀浆通过放置在漏斗上的3层Miracloth ，然后将滤液收集在预冷的10 ml管中（您必须挤压混合物以提取液体）。这将产生2-3毫升的滤液。
使用P1000移液器将2.5 ml滤液放入超速离心管中。最重要的是，轻轻放置2 ml浮动缓冲液1，注意不要混合两相。
提示：使用管壁小心地添加浮动缓冲液。这将限制相混合。
完成此步骤后，您应该看到绿色的底部相，中间的薄层（其中两个相都混合在一起）和透明的顶部相。
在100,000 x g和4°C（如果与SW55Ti转子一起工作，则为32,000 rpm）下离心1.5 h，以最大的加速度进行制动。在此步骤中，密度较小的LDs将从萃取相中浮出并通过漂浮缓冲液1，以乳状带的形式积聚在试管顶部（漂浮级分1，FF1）。
通过用P1000移液器或玻璃巴斯德移液器（约0.5-1 ml，最大1.5 ml）抽吸，非常小心地收集FF1，并将其放入新的超速离心管中。
注意：避免使用巴斯德塑料移液器，因为LD会粘在墙上，很难收集。
可选：要监控提取，还应从底部相（底部馏分1，BF1）中收集等分试样。
如果要处理多个样品，请通过添加浮动缓冲液1平衡FF1馏分的体积。在其上方，按照与步骤B5相同的预防措施，轻轻放置浮动缓冲液2 。由于装入试管的总体积必须为4.5 ml，所以浮动缓冲液2的添加体积将等于4.5 ml – Vol FF1 。
注意：此处使用的超速离心管中的液体量应约为4.5 ml。较高的体积（接近5 ml）可能导致样品溢出，而较低的体积（例如，小于4 ml）则可能在高g力下导致试管塌陷。
像步骤B6一样离心，并像步骤B7一样从漂浮的乳白色带中收集LD （漂浮级分2，FF2）。FF2已经可以用作LD分数（图2A）。
可选：要监控提取，还应收集等分的底部相（底部馏分2，BF2）。
如果您需要更浓缩的LD，请将收集的FF2放入1.5 ml试管中，并在10,000 x g和4°C的台式离心机中离心1.5 h 。离心后，LD将再次积累在顶层。用玻璃移液器从管的底部移走尽可能多的缓冲液，直到仅剩下上部乳状部分。激光二极管可以被浓缩至体积小至50-100微升（图URE 2B）。
可选：将去除的缓冲液放入新的1.5 ml试管中，并重复上一步以提高回收率。

图1.协议概述。收集叶子，切成小块，然后立即放入预冷的研钵中。加入研磨剂和萃取缓冲液后，研磨样品，然后通过3层Miracloth过滤。将滤液放入5 ml离心管中，覆盖浮动缓冲液1并离心得到的梯度液。LD将累积在电子管的顶部。将此LD馏分（FF1）放在新试管中，并使用浮动缓冲液2重复该过程。如果需要，可通过台式离心机离心浓缩得到的LD馏分（FF2）。

LD质量检查
可以通过以下几种方法评估最终LD制备物（或中间馏分）的质量。最简单的是，以OBSERV E中在荧光显微镜下染色的LD。您也可以选择通过流式细胞仪分析估算LD制剂的收率，纯度和均一性。如果您有针对LD蛋白的抗体，也可以使用Western blot来建立您的方案。

通过显微镜
提取的LDs可以用脂质特异性染料如BODIPY 493/503或尼罗红染色。BODIPY 493/503更敏感和更特异性（Gocze和Freeman，1994）。在这两种情况下，请按照下列步骤操作：
准备工作的染料溶液：稀释染料股1 ，000次，以1微克/ ml，在磷酸盐缓冲液。
轻轻混合等体积的（例如，5微升最终LD馏分）和工作染料溶液。在黑暗中孵育15分钟，然后在荧光显微镜下观察。对于BODIPY 493/503 ，请使用488 nm激发激光线，并收集500至540 nm光谱范围内的发射信号。对于尼罗红，用550 nm激光激发并收集562至621 nm之间的发射。（或者，如果无法在显微镜中设置此确切参数，请对BODIPY 493/503使用典型的GFP设置，对尼罗红使用RFP设置）。将荧光图像与明亮的图像进行比较。应该可以看到圆形，0.5-2微米结构重叠在两个图片[图2C-2D和Horn等人。（2013）] 。
通过流式细胞仪
作为显微镜的补充，可以在流式细胞仪中分析BODIPY 493/503染色的和未染色的LD，以评估最终LD制备中的产量，纯度和可能的不同种群。
准备工作染料溶液：将BODIPY 493/503储备液在磷酸盐缓冲液中稀释10次（至100μg / ml）。
稀5微升195最终LD馏分微升磷酸盐缓冲液，并添加1微升的100微克/毫升BODIPY 503分之493 。轻轻混合并在黑暗中染色15分钟。同时，准备未染色的对照。
在Galios TM流式细胞仪上分析染色和未染色的样品。激发激光：20 mW时为488 nm 。发射滤光片：525-540 nm带通。如果获得了高质量的准备，则LD应该在Size vs中显示为单个簇。复杂度图。在荧光直方图中，当比较染色样品和未染色样品时，BODIPY 493/503应该产生大多数颗粒的荧光位移（Fernández-Santos等，2020）。荧光通道中已记录事件（粒子）的数量可用于估计LD产量（以每毫克新鲜组织的LDs为单位）。
通过W¯¯西部时代印迹
要设置您的方案，拥有一个带有标记的LD标记蛋白的转基因品系非常有用，可以通过Western blot（或针对LD蛋白的抗体本身）进行检测。这样，您可以监控不同馏分中的LD富集（或消耗）并相应地调整方案条件。例如，图2E显示了从35 S :: CLO3：GFP植物的衰老叶片中提取的LD ，用抗GFP抗体通过Western blot分析。

图2 。从衰老植物的叶子中提取脂质滴（LD）。A.第二次超速离心后的蔗糖梯度图像，顶部有浮点2（FF2）。B.从野生型衰老植物的最终LD制备。C.来自（B）的脂质滴，用BODIPY 493/503染色。D.来自35个S :: CLO3：GFP植物的LD 。尼罗河红染色的脂质显示在核心（红色），而CLO 3：GFP位于LDs表面（绿色）。E.通过抗GFP抗体的western印迹对（D）中分离的LD的方案追踪；BF：底部部分，FF：浮动部分。标度b ar ＝2μm 。

笔记

一般评论：
在所有步骤协议必须进行的冷。在我们手中，所用的Tween-20浓度（0.1％）使产量提高了10倍，并导致了LD蛋白的鉴定，随后通过显微镜证实了该蛋白（Fernández-Santos等，2020）。但是，可以根据您的目标和实验设计来调整此浓度（合理的范围是0.02到0.2％）。添加Tween-20可提高LD产量并减少污染物残留，但也可能分离弱结合的LD蛋白。

菜谱

注意：请注意，下面的缓冲液量足以处理50个2.5 g的样品。如果您打算处理较少的样品，建议相应地缩小体积。
基础缓冲液（600毫升）
的10mM的NaH 2 PO 4 ，150mM的氯化钠，pH值7.5
NaH 2 PO 4 。H 2 O：0.83克
氯化钠：5.27克
加水至接近600毫升
用1 M NaOH将pH调节至7.5
加水至600毫升
蔗糖缓冲液（各100毫升）
1.2 M蔗糖缓冲液
将41 g蔗糖溶解在50 ml基本缓冲液中。溶解后，用基本缓冲液将体积调节至100 ml。
0.8 M蔗糖缓冲液
将27.4 g蔗糖溶解在50 ml基本缓冲液中。溶解后，用基本缓冲液将体积调节至100 ml。
0.4 M蔗糖缓冲液
将13.7 g蔗糖溶解在50 ml基本缓冲液中。溶解后，用基本缓冲液将体积调节至100 ml。
补充的基本缓冲液（300毫升）
提取当天：将六片cOmplete TM蛋白酶抑制剂鸡尾酒溶于300 ml基础缓冲液中。添加12毫升的50mM PMSF和600微升吐温20。
提示：Tween-20是粘性液体，难以移液。为确保添加正确的体积，请在装载前用剪刀剪切P1000移液器吸头的末端。这将扩大移液器孔。卸载后，将移液器吸头在溶液中冲洗几次，因为Tween-20可能会粘在墙上。
磷酸盐缓冲液（100毫升）
10 mM NaH 2 PO 4 ，pH 7.5
溶解0.138 g NaH 2 PO 4 。90 ml水中的H 2 O
用0.1 M NaOH将pH调节至7.5，并补足至100 ml
股票
1毫克/毫升BODIPY 495/503
溶解0.5毫克500微升DMSO中。用铝纸包裹试管，并储存在-20°C下。
1 mg / ml尼罗红
溶解0.5mg的尼罗红在500微升甲醇中。用铝纸包裹试管，并储存在-20°C下。
50毫米PMSF
将0.174 g PMSF溶于20 ml异丙醇中，并在4°C下撕裂。

致谢

这项工作得到了西班牙经济与竞争力部/ FEDER的研究资助BIO2015-68130-R和科学，创新与大学部的RTI2018-097 102-B-100的支持。该协议源自我们的研究论文（Fernández-Santos等，2020）。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

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