材料和试剂
1. 10厘米培养皿（Thermo Fisher Scientific，康宁，目录号：BP94A01）
2. 6孔板（Corning，目录号：3516）
3. 12孔板（Corning，目录号：3513）
4.锡纸
5.显微镜载玻片SuperFrost Plus TM （Thermo Fisher Scientific，目录号：10149870）
6.盖玻片（例如24 x 50毫米）（Thermo Scientific Menzel x1000盖玻片24 x 50毫米＃1，目录号：15737592）
7.剥离-A-路® 22×40毫米×20毫米深的，矩形的嵌入模具（特德佩拉，目录号：27114）
8. Millicell细胞培养插入物，30 mm，亲水性PTFE，孔径0.4 µm（Merck，目录号：PICMORG50），可保存
9.小鼠（例如，C57 / Bl6N）
10. EdU （5-乙炔基-2-脱氧尿苷）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：A10044（50 mg），在500°L等分试样中于-20°C保存
11. Hibernate TM -A介质（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：A1247501），在4°C下保存最多4个月
12. B-27 TM补充剂（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：17504001），等分试样在-20°C下储存，除霜后在4°C下保存最多1个月
13.低熔点琼脂糖（Merck，Calbiochem ，目录号：2070-100GM）。PBS中的4％溶液可以在架子上保存长达6个月，并可以重复使用3-4x
14. Neurobasal TM -A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10888022），在4°C下保存最多4个月
15.消炎痛（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：I7378-5G），以100 mM的DMSO储备溶液形式在4°C下保存，最长4个月。
16.水飞蓟宾（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：51681-10MG），以100 mM的DMSO储备溶液在4°C下保存，最多4个月。
17.碘酸（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：I0330000），以100 mM的DMSO储备溶液在4°C下保存，最多4个月
18. BCH（R＆D系统，目录号：5027/50），在100°M的神经基础液A中于4°C储存，最长4个月。
19.甲醛37％（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：252549-500ML），存储在通风橱中
20.点进智达®的EdU Alexa氟® 647成像试剂盒（赛默飞世尔科技，分子探针，目录号：C10340），组分稀释并存储根据制造商的说明书
21.兔抗Ki67抗体（Abcam，目录号：ab16667），等分试样保存在-20°C
22.豚鼠抗Doublecortin（Dcx ）抗体（默克公司，Millipore，目录号：ab2253），等分试样保存在-20°C
23.小鼠抗NeuN抗体（Merck，Millipore，目录号：mab377），储存在4°C
24. Fluoromount -G ® （Southern Biotech公司，目录号：0100-01），在室温下保存
25.超级胶
26. Triton X-100（Merck，西格玛奥德里奇，目录号：X100-1L），在室温下保存
27.甘氨酸（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：G7126-1KG），在室温下保存
28. 10x PBS（Thermo Fisher Scientific，生命技术，目录号：70011-036 500ml），在室温下保存；用蒸馏水稀释
29. BSA （Merck，西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich），目录号：A7906-50G），储存在4°C下
30.山羊血清（Merck，西格玛奥德里奇，目录号：G6767-100ML），储存在-20°C下
31. Hoechst33258（Thermo Fisher Scientific，生命技术，目录号：62249 5ML），存储在4°C下
32. L-谷氨酰胺（Invitrogen，产品目录号：25030-024），等分试样保存在-20°C
33.青霉素/链霉素（10 ，000 U / ml的笔; 10 ，000微克/毫升链霉素;英杰公司，目录号：15140-122），储存在-20等份℃下
34. DMSO （Thermo Fisher Scientific，目录号：D12345 3ML），在室温下保存
35. 7 ml试管（Sarstedt ，Tube 7ml 47x20PC + Cap，目录号：71.9923.610），在室温下保存
36.解剖缓冲区（请参见食谱）
37.无血清切片培养基（请参见食谱）

设备

P ipettes
刷
Sp atula（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM Nickel Chattaway锅铲，目录号：11583462）
手术刀（一次性手术刀，Swann Morton 11号，保健储蓄，目录号：SKU0503）
组织培养罩
水浴
镊子（精细科学工具，Dumont＃5镊子标准碳素，目录号：11251-10）
剪刀（精细科学工具，精细剪刀，夏普，目录号：14060-10）
摇杆
Ç onfocal显微镜（莱卡SP8 ）
减震器（Leica VT1000 S ）

软件

图像（NIH，https：//imagej.nih.gov/ij/）

程序

切片的准备
对于的EdU标签跟踪研究中，注入一个6-8 -周龄C57 / Bl6N小鼠IP用100μl的EdU （10毫克/毫升）。为了增加标记细胞的数量，我们在死前4小时和2小时注射了EdU两次。
在1x PBS中准备4％低熔点琼脂糖，并将其置于37°C的水浴中直至使用。
通过将动物暴露于浓度升高的CO 2中来牺牲动物。
快速隔离大脑，然后将其转移至在7毫升冰试管中的2毫升无血清解剖缓冲液（Kim等人，2013）中。让大脑平衡至少5分钟。
准备用于切片（图URE 1A）：脑转移到10cm培养皿（图1B），除去小脑和脑干用手术刀（图1C）和切割沿脑（中线图1D）。根据Kleine Borgmann等提供的说明。（2013）的切割面（在地方半球图1E），并删除从背外侧到腹内侧大脑皮层切削的一小部分在约70°（角度图小号1F，1 G）。将半球翻转到这些新切割的表面上，然后将其放入冰上的嵌入模具中。轻轻地用4％低熔点琼脂糖填充模具，并等待其固化（图1H）。使用手术刀修剪琼脂糖块，并使用超级胶水将其粘贴到玻璃纤维组织平台上（图1I）。半球可以单独或平行地嵌入，粘贴和切割。我们通过以平行于横向的方式切割它们，从而获得了最佳的结果，即沿横向到中间的方向（即，面对着纤毛虫的横向部分被首先切割）。
将平台转移到装有冷冻解剖缓冲液的玻璃纤维组织容器中。为了保持低温，请用冰盖住容器（如果可能），或在不使用时将其存放在冰上。
使用高频（7-8级）和低速（1-2级）切割300 µm厚的切片。
小心地将含有海马体的切片转移到一个10 cm培养皿中，该培养皿中装有刷子和刮刀，在冰上含有4-5 ml的解剖缓冲液（图1J）。请注意一个实例，该实例具有保留的脑细胞结构（图1K）和切片不正确的切片（图1L）的良好切面。我们没有修剪这些切片，因为在修剪它们之间的长期生存能力方面没有发现任何明显的区别，因此它们仅包含海马和内嗅皮层或培养整个切片。

图1.解剖程序。（A）大脑切片的示意图。BL面板显示了关键步骤的照片，如下所示。放置脑在P ETRI培养皿（B）。切除小脑和脑干（C）后，沿中线（D）将大脑一分为二。将半球放置在新的切割表面（E）上，并以70°（F）的角度沿背外侧到腹侧的方向切掉大脑皮质的一小部分。翻转到最新的切割表面（G）上，嵌入4％低熔点琼脂糖（H）中，将块体粘贴到组织平台（I）上，并使用振动刀将半球切开。收集切片在10cm P ETRI菜（J）。适用于培养的切得很好的切片（K）和切得不好的切片（L）的代表性图片。

切片文化
在牺牲动物之前，将所需量的Millicell插入物放入6孔板孔中。
准备储备溶液。将吲哚美辛溶解在DMSO中以获得100 mM储备液。将药物溶于DMSO或介质中。
每孔含1 ml无血清培养基（Kim et al。，2013），其中包含吲哚美辛和抑制剂（或溶剂对照）。在组织培养罩中工作。在标准细胞培养箱中于37°C和5％CO 2平衡一到两个小时。
使用标准200 µl移液器从孔中向插入物中添加一小滴培养基（约50 µl），以利于切片的转移。用刷子和刮刀将冷冻解剖介质中的玻璃纤维切片转移到Millicell插入物上，使它们位于空气/液体界面。在37°C和5％CO 2下培养每个插入2-3个切片。
第二天，用1 ml移液器完全除去含有抑制剂或溶剂对照的培养基。将插入物放在孔中，并用移液器尖端或镊子小心地将其一侧抬起，以除去残留的介质。立即用1 ml小心吸管的新鲜培养基（含抑制剂）替换，以使插入物上的部分再次位于气/液界面。每隔一天重复一次。

固定
通过除去培养基来固定切片，并将PBS中的1 ml 3.7％甲醛加入孔中，并在切片顶部小心地再添加1 ml。在环境温度下固定1小时。
在PBS中将切片洗净3x 20分钟。
将固定的切片存储在4°C的PBS中或进行免疫组织化学。
注意：在固定过程中，切片可能会从膜上脱落。这不会影响后续步骤。

免疫他的组织化学
使用镊子，剪刀或手术刀从塑料环上切下Millicell插入膜。
对于EdU检测，将来自同一动物和条件的所有切片（在膜上或自由漂浮的）转移到12孔板孔中，并在含有0.1％Triton X100 / 0.1 M甘氨酸的PBS中透化。在含有3％BSA的PBS中封闭切片2小时。孵育SLIC用300微升ES点进智达反应鸡尾酒根据制造商的说明（赛默飞世尔科技制备点进智达®的EdU Alexa氟® 647成像套件，章的EdU检测在上3小时摇臂室温）。为此和所有后续步骤，请保护该板免受光照（例如，用锡箔覆盖）。
在4°C下在含有0.5％Triton X100的PBS中的10％正常山羊血清中封闭切片过夜。
在封闭缓冲液中制备一抗（每孔400 µl）。在摇床上将切片于4°C孵育48小时。在我们的实验中，我们使用兔抗Ki67（1：250）来观察增殖细胞，使用小鼠抗NeuN （1：300）作为神经元的标记，并使用豚鼠抗Dcx （1：300）标记神经母细胞和不成熟的神经元
在PBS中将切片洗涤3x 1小时。
将切片与第二抗体（在封闭缓冲液中1：500）在摇杆上于4° C过夜孵育。
除去二抗，每孔加入400 µl Hoechst33258（在水中； 5 µg / ml）并孵育30分钟。
在PBS中将切片洗涤3x 1小时。
使用镊子将膜（切片朝上）转移到显微镜载玻片上，或者在切片脱落的情况下，使用刷子和刮刀a。
将切片放在幻灯片的中心。在切片上加入200 µl Fluoromount -G ，然后轻轻盖上盖玻片（例如24 x 50 mm）。注意不要挤压切片，因为它们非常厚。在4°C下干燥。

影像学
使用共聚焦显微镜对图像进行切片。我们使用Leica SP8共聚焦显微镜和20倍物镜，并在300微米厚的切片中间对30-50微米厚的叠层成像。

数据分析

对于数据分析，请使用免费的软件ImageJ / Fiji。从拍摄的z堆栈起每10 µm在一张图片中枚举SGZ中的标记阳性细胞（Ki67，Dcx ，EdU和NeuN ），并将这些数字标准化为SGZ的长度（使用ImageJ的分段线工具测量）以进行量化（图2）。对于核标记（Ki67，EdU和NeuN ），确定Hoechst33258染色有清晰的覆盖层。从同一动物获得并在相同条件下培养的所有切片的平均结果。在我们的研究中，我们量化的EdU掺入不同的细胞群体，在不同的时间点和日EN决定通过配对双尾斯图统计学意义凹痕的牛逼-测试用片每时间点和条件4-6的动物。根据分析的重点，可能需要单向或双向方差分析，例如，对同一参数（例如增殖能力）进行纵向分析。要查看我们的结果，请参见Mayerl等。（2020年）。

图2.结果量化。沿SGZ标记单个或双重阳性细胞（箭头）。SGZ的长度是使用ImageJ的分段线工具（虚线）测量的。计算了整个长度上阳性细胞数的商。（比例尺= 100 µm）

笔记

请注意，过度暴露于CO 2会杀死动物，同时会降低脑组织pH值并增加组织硬度（Holtzmann等人，2016）。与标准的安乐死方法（例如颈椎脱位或断头术）相比，这种硬度变化是否会改变切片过程的质量尚未得到调查，可以单独确定。
从颅骨中提取大脑时，请注意不要切入大脑组织。较小的表面切割不会影响手术，但较大的切口会导致切割问题，并最终导致切片破裂和不合适。如果发生后者，请不要继续。同样，在准备脑半球切片时，请注意不要用镊子刺穿组织，而要刺穿组织。最好使用钝的刮刀固定组织，以便用手术刀切割。当以70°角移出一小部分皮质时，您应该能够在移出的部分中看到一小条白质条带（请参见图1G）。在少数情况下，大脑半球可能不是根据需要和片可能被损坏（用于比较见图切URES 1K和1 L）。问题可能包括裂开，断裂的部分，海马-皮质连接的切断以及切片上明显的厚度不均等。如果琼脂糖凝固时渗透到半球下方，则后者是常见的。结果，如果施加来自刀片的压力，则脑组织将不会被胶粘到玻璃纤维组织平台上，并且能够自由移动。如果在切割过程中出现问题，我们的经验是，排除故障的可能性非常有限。我们建议对另一只动物重复此过程，而不要使用损坏的切片。
需要考虑的主要问题之一是切片的厚度-与新生儿切片不同-在整个培养期间并未明显变平。因此，切片产生明显的背景荧光强度，这对于某些抗体来说是一个问题。在我们手中，公认的高特异性抗体可以可靠地发挥作用，而其他特异性较低的抗体则不会产生可用于定量的染色或根本不起作用。此外，我们通常在安装后的第二天成像。延迟编成像，然而，可能会导致在可能干出部封固剂形成充满空气的间隙。因此，为了在成像密封盖玻片之前（例如用指甲油）成像之前更长的存储时间是一个可行的选择，尽管我们从未进一步探讨过这种可能性。
我们从未调查过第一步阻断步骤（PBS中3％BSA）是否足够，是否可以跳过使用10％山羊血清的第二步阻断步骤。这可能取决于所用抗体的性能。
此外，协议条件针对成体干细胞和神经元（因此使用休眠A，神经基底A和消炎痛）进行了优化，而它们在保持神经胶质细胞存活方面可能效率较低。因此，除非培养条件得到进一步优化，否则我们不建议将此方案用于神经胶质细胞的分析。

菜谱

以下缓冲配方基于Kim等。（2013）：

解剖缓冲液（100毫升）
96毫升冬眠A
2毫升B-27 TM补品（50x）
1毫升200 mM L-谷氨酰胺

1毫升青霉素/链霉素

无血清切片培养基（100毫升）
96毫升神经基底A

2毫升B-27 TM补品（50x）
1毫升200 mM L-谷氨酰胺

1毫升青霉素/链霉素

80微升100 mM消炎痛

致谢

这项工作得到了DFG向SM的拨款（MA7212 / 2-1），Wellcome信托高级研究人员奖（104783 / Z / 14 / Z）和BBSRC（BB / L00402X / 1）对CffC的资助。。我们感谢SCRM动物设施工作人员（卢克·麦克菲，克里斯·威尔逊，洛林·麦克尼尔，约翰·阿格纽和杰米·凯利）和SCRM影像设施工作人员（贝特兰·韦尔奈）。该方案首先发表在我们的原始研究论文“海马神经发生需要细胞自主甲状腺激素信号转导”中（干细胞报告）（Mayerl等，2020）。

利益争夺

作者宣称不存在利益冲突。

伦理

所有研究均根据项目许可证PPL 70/8748执行，有效期为2015年12月6日至2020年12月5日，符合英国内政部法规和爱丁堡大学的当地指南。

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