材料和试剂
缓冲区交换的材料（请参阅注释）
45 mm的固定夹（Carl Roth，货号：H277.1）
透析膜Spectra / Por 7 MWCO 10,000，45毫米（Carl Roth，目录号：E872.1）
玻璃吸管：5，10，20和25毫升（大号abdirect ，产品目录号：021.01.005，355.050.110，355.050.120，355.050.125）
移液器吸头（Sarstedt ，目录号：70.760.012、70.762、70.3020和Biozym ，目录号：VZ0001X）
1.5 ml反应管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
双蒸馏水（ddH 2 O）（Kerndl ，目录号：22501）
六水合氯化镁（MgCl 2 ）（卡尔·罗斯，目录号：2189.1）
四水合氯化锰（MnCl 2 ）（Carl Roth，目录号：T881.1）
氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：27810.295DB）
Tris-base（Carl Roth，货号：4855.2）
甘油（Carl Roth，目录号：3783.2）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）

用于蛋白质浓度测定的材料（请参阅注释）
1.5 ml反应管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
间隔板和短板（Bio-Rad，目录号：1653310和1653308）
移液器吸头（Sarstedt ，目录号：70.760.012、70.762、70.3020和Biozym ，目录号：VZ0001X）
Tris-base（Carl Roth，货号：4855.2）
甘氨酸（卡尔·罗斯，目录号：0079.4）
有色预染色的标记物（NEB，目录号：P7719S）
LMW标记（GE Healthcare，目录号：17-0446-01）
双蒸馏水（ddH 2 O）（Kerndl ，目录号：22501）
Rotiphorese （Carl Roth，目录号：3029.1）
过二硫酸铵（Carl Roth，目录号：9178.1）
TEMED（卡尔·罗斯，目录号：2367.3）
甘油（Carl Roth，目录号：3783.2）
月桂基硫酸钠（Carl Roth，目录号：4360.2）
溴酚蓝（Carl Roth，目录号：A512.1）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
2-丙醇（Carl Roth，目录号：6752.5）
醋酸（Carl Roth，目录号：6755.1）
考马斯蓝R 250（Carl Roth，货号：3862.2）

带有放射性标记核苷酸的酶促测定的薄层色谱法（TLC）
移液器吸头（Sarstedt ，目录号：70.760.012和Biozym ，目录号：VZ0001X）
移液器过滤嘴（Sarstedt ，目录号：70.1116.210）
1.5 ml反应管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
薄板（Macherey -Nagel，POLYGRAM CEL 300 PEI，目录号801053）
荧光成像板（Fujifilm，BAS-IP SR 2025）
保鲜膜（从杂货店获得的任何类型）
曝光盒（GE Healthcare，目录号：63-0035-44）
纯化的DISA从S. venezuelae或枯草芽孢杆菌（维特等人，2008; Latoscha 。等人，2020）
纯化非活动DISA变体（DISA D86A ）从S. venezuelae （Latoscha等人，2020）
纯化ATAC从S. venezuelae （Latoscha等人，2020）
9.25 MBq [α- 32 P] -ATP（Hartmann Analytik ，目录号：FP-207）
9.25活度[ 32 P] -c二AMP（哈特曼Analytik的，目录号：FP-C517;一个纯化的c-二AMP生成酶，例如，枯草芽孢杆菌DISA ，必须提供给公司为[ 32 P ] -c-di-AMP根据要求合成）
对于磷酸二酯酶竞争测定：
c-di-AMP（BioLog ，目录号：C 088）
c-di-GMP（BioLog ，目录号：C 057）
cAMP（Sigma-Aldrich，目录号：A6885）
六水合氯化镁（MgCl 2 ）（卡尔·罗斯，目录号：2189.1）
四水合氯化锰（MnCl 2 ）（Carl Roth，目录号：T881.1）
氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：27810.295DB）
Tris-base（Carl Roth，货号：4855.2）
盐酸（Carl Roth，目录号：4625.2）
甘油（Carl Roth，目录号：3783.2）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
双蒸馏水（ddH 2 O）（Kerndl ，目录号：22501）
0.5 M EDTA，pH 8（PanReac AppliChem，目录号：A4892）
硫酸铵（（NH 4 ）2 SO 4 ）（VWR，目录号：21333.296DB）
磷酸一氢钾（KH 2 PO 4 ）（卡尔·罗斯，目录号：P018.2）
DisA环化酶缓冲液（请参见食谱）
PDE反应缓冲液（请参阅配方）
TLC运行缓冲区（请参阅配方）

IEX活性测定
移液器吸头（Sarstedt ，目录号：70 .1130.600和70.760.502）
1.5 ml反应管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
Microcon-30kDa离心过滤器（Merck Millipore，目录号：MRCF0R030）
纯化ATAC从S. venezuelae （Latoscha等人，2020）
纯化TMPDE从T. maritima的（德雷克斯勒等人，2017）
c-di-AMP（BioLog ，目录号：C 088）
四水合氯化锰（MnCl 2 ）（Carl Roth，目录号：T881.3）
氯化钠（Merck Millipore，目录号：1.06404.5000）
Tris-base（Carl Roth，货号：4855.2）
25％盐酸（VWR，目录号：20257.296）
10x AtaC反应缓冲液（请参阅食谱）
IEX运行缓冲区A（请参阅配方）
IEX运行缓冲区B（请参见配方）

设备
缓冲区交换设备（请参阅注释）
5,000毫升量筒（Carl Roth，目录号：0780.1）
电磁棒（Carl Roth，目录号：C267.1）
移液辅助宏（Carl Roth，目录号：X478.1）
微量移液器（P20，P200，P1000）
磁力搅拌器（Heidolph ，型号：MR 2000）
离心机（Eppendorf，型号：5427 R，货号：5409000010）
4°C室

您选择的蛋白质浓度测定设备（请参阅注释）
Mini-PROTEAN Tetra Cell（Bio-Rad，货号：1658000EDU）
加热块（Labnet International，型号：AccuBlock TM数字干浴锅，目录号：D1302-230V）
离心机（Eppendorf，型号：5427 R，货号：5409000010）
电源（Bio-Rad，目录号：1645050）
带有CCD摄像机的成像仪（GE Healthcare，型号：ImageQuant LAS 4000）
微量移液器（P2，P10，P20）

放射性标记核苷酸酶促测定的薄层色谱
1.微量移液器（P2，P10，P20）
2.加热块（Labnet International，型号：AccuBlock TM数字干浴锅，目录号：D1302-230V）
3.离心机（Eppendorf，型号：5427 R，目录号：5409000010）
4.污染监测仪（Berthold，型号：LB 122）
5.生物分子成像仪（GE Healthcare，型号：Typhoon FLA 7000，目录号：28-9558-09）
6.图像擦除器（分子动力学，型号：410A）
7.丙烯酸台式Beta辐射防护屏（ThermoFisher Scientific，目录号：6700-2418）
8. TLC室（Fisher Scientific，目录号：06-815-187）
9.通风柜

IEX测定
微量移液器（P2，P20，P200，P1000）
NanoDrop分光光度计
Thermomixer（Eppendorf，目录号：5382000015）
离心机（埃彭多夫（Eppendorf），目录号：5401000010）
Äkta （Cytiva，前GE Healthcare）
Resource-Q或Mono-Q（Cytiva ，目录号：17117701或17516601）

软件

ImageQuantTL （可选）（GE Healthcarre ）
Typhoon FLA 7000控制软件（GE Healthcare）
PhotoShop CS6（Adobe）
独角兽（Cytiva，前GE Healthcare）

程序
放射性标记的ATP与TLC联用的二腺苷酸环化酶测定
直到步骤A6，在冰上工作。
将纯化蛋白的缓冲液交换为DisA环化酶缓冲液（例如，通过透析，请参见“注释”）。
确定蛋白质的摩尔浓度（请参阅注释）。
反应的建立：
计算在20 µl中达到5 µM浓度所需的DisA体积。
将所需量的DisA移液到1.5 ml反应管中（即，如果DisA储备液的浓度为50 µM，则需要取2 µl）。
用DisA环化酶缓冲液填充总体积为19.5 µl 。
从现在开始，在防辐射罩后面工作并使用过滤嘴（请参阅“注释”）。
向反应中添加0.5 µl [ 32 P] -ATP（最终浓度：20 µl中约83 nM ）。
使用19.5 µl DisA环化酶缓冲液和0.5 µl [ 32 P] -ATP作为ATP迁移的对照。
在加热块中于30°C孵育反应60分钟。
吸取5 µl 0.5 M EDTA，pH 8到1.5 ml反应管中（每个反应一个管）。
将每个反应5微升添加到装有EDTA的试管中，以终止二腺苷酸环化酶反应。
将步骤A10的混合物点在薄板（TL）板的纤维素侧上（每个点应距TL板的底部和侧面边缘以及其他斑点约1.5 cm；请参见注释）。
让斑点在室温（RT）下完全干燥。
用TLC运行缓冲液（缓冲液应约1厘米深）填充TLC腔室。
将TL板放置在TLC室中，使有斑点的样品靠近缓冲液，而不接触缓冲液。
孵育TLC，直到液体前沿距TL板的上边缘约1 cm（这可能需要约2.5 h）。
从室中取出TL板，并在室温下干燥（过夜或在通风橱中至少45分钟）。
将已擦除的成像板（IP）放入曝光盒中。
将TL板完全包裹在保鲜膜中（请参见注释），并将纤维素面朝下放在IP顶部以进行曝光。
所述ë xposure时间可以根据最佳信噪比而变化，但约30分钟的曝光将在大多数情况下是足够的。
从暗盒中取出TL板，并使用污染监测仪检查暗盒和IP是否存在放射性污染（请参阅“注释”）。
如果没有污染，请使用650 nm激光和IP过滤器扫描Typhoon FLA 7000中的IP。

放射性标记的c-di-AMP与TLC联用测定磷酸二酯酶
直到步骤B7，在冰上工作。
将纯化的AtaC缓冲液交换为PDE反应缓冲液（例如，通过透析，请参见注释）。
确定AtaC的摩尔浓度（请参见注释）。
如果要与未标记的核苷酸竞争，请继续执行步骤B5，而没有竞争则继续进行步骤B6。
建立竞争反应：
计算在20 µl中达到100 nM浓度所需的AtaC体积。
将所需体积的AtaC移液到1.5 ml反应管中（即，如果AtaC储备液的浓度为1 µM，则需要取2 µl）。
用PDE反应缓冲液填充总体积为17.5 µl。
在ddH 2 O中设置每个未标记核苷酸（c-di-AMP，c-di-GMP，cAMP）的1 mM溶液。
在步骤B5c中，每个反应添加2 µl每个核苷酸。
用2 µl ddH 2 O设置反应作为竞争的阴性对照。
继续执行步骤B7。
无需竞争即可建立反应：
计算在20 µl中达到100 nM浓度所需的AtaC体积。
将所需体积的AtaC移液到1.5 ml反应管中（即，如果AtaC储备液的浓度为1 µM，则需要取2 µl）。
用PDE反应缓冲液填充总体积为19.5 µl。
继续执行步骤B7。
从现在开始，在防辐射罩后面工作并使用过滤嘴（请参阅“注释”）。
在PDE反应缓冲液中稀释[ 32 P] -c-di-AMP 1:20并向反应中添加0.5 µl（最终浓度：20 µl中约2 nM ）。
使用19.5 µl PDE反应缓冲液和0.5 µl 1:20稀释的[ 32 P] -c-di-AMP稀释液作为c-di-AMP迁移的对照。
在加热块中于30°C孵育反应60分钟。
要停止酶促反应，请在95°C下孵育5分钟。
以最大速度离心反应3分钟。
在薄层（TL）板的纤维素侧上点每个反应的5 µl上清液（每个点应距TL板的底部和侧面边缘及其他点约1.5 cm）。
让斑点在室温（RT）下完全干燥。
用TLC运行缓冲液（缓冲液应高约1厘米）填充TLC腔室。
将TL板放置在TLC室中，使有斑点的样品靠近缓冲液，而不接触缓冲液。
孵育TLC，直到液体前沿距TL板的上边缘约1 cm（这可能需要约2.5 h）。
从室中取出TL板，并在室温下干燥（过夜或在通风橱中至少45分钟）。
将已擦除的成像板（IP）放入曝光盒中。
将TL板完全包裹在保鲜膜中（请参见注释），并将纤维素面朝下放在IP顶部以进行曝光。
电子xposure时间可以根据最佳信噪比而变化，但〜60分钟的曝光将在大多数情况下是足够的。
从暗盒中取出TL板，并使用污染监测仪检查暗盒和IP是否存在放射性污染。
如果没有污染，请使用650 nm激光和IP过滤器扫描Typhoon FLA 7000中的IP。

IEX AtaC活性测定
设置100 µl反应，其中包含100 nM蛋白，62.5 µM-2,000 µM底物（例如c-di-AMP）和1x反应缓冲液。仅包含蛋白质或底物的对照反应是排除非特异性结果所必需的。
将反应液在37°C下孵育1小时。
通过将完整的反应混合物转移到Microcon-30kDa离心过滤器中并以14,000 xg旋转10分钟来终止反应。该超滤步骤将蛋白质与其在滤液中获得的反应产物分离。
如果过滤器中仍然有液体，请重复步骤C3 。
加入100 µl运行缓冲液A并重复步骤C3，以洗涤过滤器。
用运行缓冲液A充满滤液至500 µl。
在运行缓冲液A中平衡离子交换柱（1 ml Resource-Q或Mono-Q）。
从步骤6注入样品，并使用从运行缓冲液A到B的线性梯度（即0-40％B，20 CV）。如果无法使用260 nm，则将检测波长设置为260 nm或280 nm。

数据分析

薄层色谱法
在台风FLA 7000中扫描的图像有时需要调整对比度。如有必要，请在PhotoShop中打开扫描的文件，然后通过“图像”→“调整”→“色阶”修改整个图片的斑点强度，直至达到最佳对比度。由TLC分离的示例性DAC和PDE分析如图2所示。

图2.二腺苷酸环化酶（A）的薄层色谱（TLC）和c-di-AMP磷酸二酯酶测定（B）。A. Diadenylate环化酶（DAC）测定与提纯的5μM S. venezuelae野生型DISA （DISA斯文，泳道2和3）和非活动DISA斯文突变体变体（DISA D86A 83温育，泳道4和5）nM的[ 32 P] -ATP在30°C。后30个分钟和60分钟取样并通过灭活用等体积的0.5M EDTA混合，pH为8的灭活反应物点样于薄层（TL）和板通过TLC分离。干燥后，将TL板暴露于成像板上30分钟，然后使用Typhoon FLA 7000对其进行扫描。枯草芽孢杆菌DisA （DisA Bsu ，泳道6）用作DAC反应的阳性对照。泳道1显示[ 32 P] -ATP在没有酶的情况下的迁移。将所有样品在相同的TL板上分离，并将图片裁剪到相关通道。与无活性的DisA D86A相比，DisA Sven从[ 32 P] -ATP中合成了[ 32 P] -c-di-AMP，这是通过形成具有[ 32 P] -c-di相似大小的产物表明的-AMP产生由DISA BSU ，这是一个特征DAC。的磷酸二酯酶B.测定S. venezuelae ATAC与未标记的核苷酸（泳道3至5）的竞争。100 nM的纯化的蛋白质的瓦特为补充有100μM的未标记的c-二-AMP，C二-GMP和cAMP（或的DDH 2与2孵育前O作为控制，泳道2）nM的[ 32 P] -c二AMP在30°C下。60分钟后，取样并加热灭活。通过离心去除沉淀的蛋白质，并将灭活反应的上清液点在TL板上，并通过TLC分离。干燥后，将TL板暴露在成像板上60分钟，然后使用Typhoon FLA 7000对其进行扫描。泳道1显示[ 32 P] -c-di-AMP在没有酶的情况下的迁移。AtaC使用[ 32 P] -pApA作为中间裂解产物，将[ 32 P] -c-di-AMP裂解为[ 32 P] -AMP （泳道2）。该反应是特异性的，因为未标记的c-di-AMP显着抑制，因此胜过[ 32 P] -c-di-AMP转换（泳道3），而c-di-GMP和cAMP没有作用（泳道4和5）。

IEX测定
IEX测定也可以用于定量c-di-AMP的水解转换。在这种情况下，相应的核苷酸峰的峰积分必须使用进行ÄKTA软件麒麟（Cytiva前GE医疗集团）或任何其他数学分析软件。从底物和产物的峰面积之比，可以计算水解的底物或形成的产物的百分比。图3显示了c-di-AMP，5'-pApA和AMP标准品的示例IEX分离。图4显示的c-二-AMP和5'-PAPA的c二AMP PDE测定法使用的IEX分离后的干扰峰ATAC和从由反应中除去5'- PAPA的TMPDE 。

图3.包含200 µM c-di-AMP，5'-pApA或AMP的100 µl溶液的离子交换色谱（IEX）标准

图4. c-di-AMP磷酸二酯酶测定的离子交换色谱（IEX）。含有1μMA.将100μl反应S. venezuelae ATAC + 400μMC-二AMP温育1个小时，在37℃通过超滤停止并通过IEX分离。B.在与TmPDE的偶联测定中的相似反应，以分离c-di-AMP和5'-pApA的峰。含有1μMA 100μL反应S. venezuelae ATAC + 4 00μMC-二AMP温育1个小时，在37℃下通过超滤停止，随后b y中的另外100 nM的TMPDE将其温育之后停止，通过超滤进行在37°C下放置1 h，然后通过IEX分离。

笔记
关于TLC分析的一般评论
需要进行缓冲液交换，以将蛋白质洗脱液中的洗脱缓冲液替换为适当的反应缓冲液（DisA环化酶缓冲液或PDE反应缓冲液），并且可以通过多种方法进行：例如尺寸排阻色谱法，超滤或透析。在我们的实验室中，我们使用透析，但是与其他缓冲液交换方法相比，它没有优点或缺点。您可以选择最适合您的方法。
确定蛋白浓度的确切方法对于进行TLC测定并不重要，可以通过许多方法实现：例如，在280 nm处进行光度测量，Bradford测定或1D SDS凝胶密度测定。在我们的实验室中，我们通常使用后者，但是与其他方法相比，它没有优点或缺点。随意使用任何方便的方法。
具有放射性标记核苷酸的酶促测定只能由训练有素的具有足够防护设备的人员进行。
强烈建议使用过滤嘴，以避免微量移液器被放射性物质污染。
给定的酶浓度针对纯化的DisA （S。委内瑞拉和枯草芽孢杆菌）和纯化的AtaC （S。委内瑞拉）进行了优化。来自其他细菌的酶可能需要不同的浓度。如果您使用的是新蛋白质，请先测试1至5 µM纯化蛋白质的酶促活性，然后通过滴定确定最佳蛋白质浓度。
步骤A11的程序部分：一次点样整个10 µl混合物可能会导致干燥之前混合单个点。为避免这种情况，您可以点样3 µl + 3 µl + 4 µl，并在每个点样体积之间干燥点样。
TL板可以在室温下保存至少3天，而不会显着降低信号质量，并且可以多次用于曝光的已擦除成像板。如果您正在处理放射性低于材料部分中规定的底物，则可能需要延长成像板的曝光时间。
TL板使用保鲜膜可降低成像板和暗盒受到放射性污染的风险。您可以在成像板上放置一层保鲜膜，以进一步降低风险。
成像板可以通过暴露在光源下进行擦除（例如，使用图像擦除器，Molecular Dynamics，型号：410A持续10分钟），然后重复使用。因此，从纸盒中取出TL板后，请避免在扫描前将成像板长时间暴露在环境光下。

关于IEX分析的一般评论
c-di-AMP在IEX色谱柱上形成长的非对称峰，因此可以与其他峰重叠（另请参见注释3）。因此，如果有RP-HPLC系统，则首选使用该方法。
需要Äkta系统的基础知识。
如果C二-AMP的转换必须由峰积分，峰从5'爸爸覆盖和c-二AMP具有量化加以考虑。在这种情况下，第二酶，它只能劣化5'-PAPA但不是C二叔AMP（例如，TMPDE [德雷克斯勒等人，2017]），具有超滤之后加入。加入TmPDE至终浓度为100 nM，并在37°C下孵育1 h。从第3步开始重复过程C节。
上的IEX柱核苷酸的精确洗脱点是盐，PH值，温度非常敏感，并且还与AKTA系统。为了进行最佳比较，应使用相同的缓冲液和相同的Äkta系统进行测定。

菜谱

DisA环化酶反应缓冲液，由Christen等人修改。（2005年）
25 mM Tris-HCl pH = 8

250毫米氯化钠

10毫米MgCl 2

5 mMβ-巯基乙醇

10％甘油

PDE反应缓冲液，由Huynh等人修改。（2015年）
20 mM Tris-HCl pH = 7.5

50毫米氯化钠

1毫米MnCl 2

TLC运行缓冲区，由Christen等人修改。（2005年）
饱和（NH 4 ）2 SO 4和1.5 M KH 2 PO 4 pH = 3.6（以1：1.5 v / v的比例混合）

10x AtaC反应缓冲液
500 mM Tris pH = 7.5
1,000毫米氯化钠
1毫米MnCl 2
IEX运行缓冲区A
50 mM Tris pH = 9

IEX运行缓冲区B
50 mM Tris pH = 9
1,000毫米氯化钠

致谢
Witte实验室的研究由DFG Grant GRK1721和DFG Priority Program SPP 1879（格兰特WI 3717 / 3-1）资助。研究在Tschowri实验室由DFG资助艾美奖诺特计划（批准TS 325 / 1-1）和DFG优先项目计划1879年SPP（拨款TS 325 / 2-1和TS 325 / 2-2）

利益争夺
作者宣称没有利益冲突。

参考文献
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