材料和试剂
1. 15或50 ml离心管
2. 96孔微孔板（理想情况下为黑色壁，底部透明）
3. DMEM / F-12，无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：21041025），存储在2-8 °C
4. PBS片（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：18912014），在室温下保存（RT）
5. H 2 DCFDA（Thermo Fisher Scientific，生命技术公司，目录号：D399），将粉末存储在-20 °C下
6. Sulforhodamine B钠盐（SRB）（Sigma-Aldrich，目录号：S1402），将粉末储存在室温下
7. Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503），将粉末储存在室温下
8.三氯乙酸（TCA ）（Sigma-Aldrich，目录号：T4885-1KG），将粉末储存在室温下
9.乙酸（西格玛奥德里奇，目录号：A6283），在室温下储存液体
10.细胞外基质溶液（例如热交联的ECM和冷的10 µg / ml胶原I用于成纤维细胞，或1％的Matrigel或Geltrex的Engelbreth -Holm-Swarm（EHS）肉瘤用于iPSC，神经干细胞，在37℃孵育°C 30分钟）
11. 30％重量过氧化氢
12. 100％DMSO
13. MilliQ级水
14. DMSO中的10 mM H 2 DCFDA（s配方）
15.水中含有10％w / v TCA（s配方）
16. 0.004％w / v的SRB，在10％w / v的TCA（TCA-SRB）（小号EE食谱）
17.水中10 mM Trizma （s食谱）

设备
假设有典型的细胞培养设备（CO 2培养箱，离心机，生物安全柜，水浴，冰箱和/或冷藏室等）的可用性
BMG LABTECH POLARstar Omega读板仪或荧光板光谱仪，在荧光素通道，494/522 nm和565/586 nm处具有相似的荧光容量
多通道移液器（约10 µl和〜100 µl范围）和无菌试剂容器
塑料加湿盒
腐蚀性废物容器

软件
Microsoft Excel或其他电子表格处理软件

程序
细胞接种
如果所需的细胞类型需要，请用细胞外基质溶液覆盖96孔板。
用细胞计数装置分离和计数细胞。
在100 µl无酚红的完全培养基中以合适的密度接种过夜（通常为20,000-30,000个细胞/ cm 2 ）。
在室温下（〜24 °C）孵育0.5小时，以防止接种不均。
将板放置在CO 2培养箱中的加湿器室内。

染料加载和孵育
实验当天，在预热的基础培养基（DMEM / F12，无酚红）中制备20 µM H 2 DCFDA 。
将板倒空到废液容器中（如果细胞牢固粘附，则可以倒置或甩动，否则，请使用多通道小心除去培养基，然后再进行悬浮细胞离心）。
加入100微升20μMħ 2 DCFDA，每孔用多道移液器。
将板放回培养箱30分钟。
将空盘子放进废料桶。
加入不含酚红的培养基并进行处理，包括过氧化氢作为阳性对照（例如90 µl培养基，10 µl化合物）。
将板放回培养箱中的加湿室中，进行所需的处理时间（例如，培养1小时或24小时）。

取得
使用荧光板光谱仪，使用最接近激发494 nm /发射522 nm的适当滤光片组进行采集。
倒空板，并在冰箱或冷藏室中加入50 µl TCA-SRB（0.004％w / v SRB，在10％w / v TCA中）（2-8°C）15分钟。
将板倒空到合适的腐蚀性废液容器中，并用200 µl 1％乙酸洗涤。
空的地方，用100 µl 10 mM Trizma基础溶液替换，在环境温度下孵育5分钟，并在孵育后轻轻手动搅动板5 s以重新分配染料。
通过荧光板光谱仪使用最接近激发565 nm /发射586 nm的适当滤光片进行采集。

数据分析
将数据导出为电子表格格式。
从DCF和SRB数据中减去无细胞对照的平均值（至少重复两次）。
计算相对于未处理对照的SRB信号百分比。
计算相对于未处理对照的DCF信号百分比。
计算每孔DCF：SRB百分比的比率以将ROS生成读数标准化为每孔细胞蛋白。
统计分析包括独立的t检验，1或2方差分析（ANOVA）和针对多个组的事后多重比较检验（图4）。

图4.相对ROS生成的示例。将iPSC来源的星形胶质细胞用溶剂（0.2％DMSO），100 µM H 2 O 2或蛋白酶体抑制剂0.1 µM MG132处理24小时。在治疗条件下，通过细胞内DCF显微镜分析不能检测到MG132诱导的ROS。平均数独立重复的是带有SD误差条（N = 3）。单次方差分析，事后Holm - Sidak检验确定了显着差异。* p ＜0.05。

笔记
至少包括2个技术重复品，空孔控制和阳性控制孔。
通常，每个板需要约12 ml的20 µM H 2 DCFDA，6 ml的0.004％SRB + 10％TCA，22 ml的1％乙酸和12 ml的10 mM Trizma碱。
阳性对照的H 2 O 2浓度应通过细胞毒性试验确定，该试验不会导致总细胞死亡（理想情况下> 50％），我们发现100 µM适用于成纤维细胞和人iPSC诱导的星形胶质细胞培养但会随细胞类型和分析持续时间而变化。
如果添加的测试物质在DCF通道中有大量的荧光贡献，则必须使用无细胞对照的平行板。否则，为方便起见，可使用单列无细胞孔。
可以通过显微镜确定避免播种后0.5 h的时间，以确保种子在播种后能粘附。
建议的加湿器室允许使用所有孔，而无需担心长达几天的蒸发，只需将微孔板堆放在一个塑料容器上，该塑料容器的平台要高出一定量的水（例如空的移液器吸头盒）（Walzl等）等人，2012）。如果不使用加湿器腔室，也可以进行二氧化碳和氧气交换的封口膜是减少蒸发的经济有效的方法。用储水器代替边井是一种常见技术，但对于较长的孵育时间不一定有效，并且会损失约37.5％的可分析井空间。
可以通过使用安装在96孔板下方的金属块来避免热梯度，但是这对于可伸缩性可能很麻烦。微孔板可以在环境温度下装载H 2 DCFDA而不是预热的介质，以进行大规模处理。过夜温育可减轻从培养板从环境温度到温育器过渡过程中出现的不均匀加热的持续时间。
冷的TCA可用PBS中的4％多聚甲醛（PFA）代替，这是进行免疫细胞化学实验的实验室更常使用的方法，但是PFA固定和SRB染色不能结合使用，因为SRB仅在温和的酸性条件下有效结合至碱性蛋白质氨基酸残基（Skehan等人，1990）。
对于平板的批处理，可将15分钟的TCA-SRB步骤替换为一整夜的持续时间，以减少孔间差异。
先前描述SRB方案的出版物通常涉及3-5个乙酸洗涤步骤。我们发现小体积染色后再进行一次大体积洗涤，结果差异极小。
可以通过与低浓度的H 2 DCFDA（≤1 µM）一起孵育来代替H 2 DCFDA的负载，而无需清洗步骤，但是必须考虑取决于细胞类型的探针的细胞毒性。
该协议适用于贴壁细胞。为了更有效地固定松散粘附的细胞或悬浮细胞，可以使用高达50％w / v的TCA （Kim等，1996）。
尽管比较费力，但在平板光谱仪形式中，与核酸凹槽/插入探针相比，在凋亡条件下，SRB分析对每个细胞的人工信号增加的敏感性较小。核酸结合染料（例如Hoechst 33342）会导致高估存活细胞的数量（图5）。

图5.凋亡细胞群人工核染色板光谱评分的例子。将iPSC来源的星形胶质细胞用溶剂（0.2％DMSO）或100 µM H 2 O 2处理24小时。使用SD误差线表示技术重复的平均值。与DNA浓缩的凋亡小体相比，用对照（a）的Hoechst 33342（10 µM）进行的代表性核染色，每个细胞提供更高的信号，导致高估了活细胞的数量（b）（比例尺= 30 µm）。

用于归一化至细胞数目或融合时，单个细胞的显微镜评分可以faciliated通过之前的SRB蜂窝掩模，或复染后solublisation由非重叠的染料，例如，具有核得分沿Hoescht按33342，DAPI或SYTOX绿。SRB提供的细胞膜和总细胞蛋白数据允许总细胞蛋白，细胞数量和细胞核之间的相关性，这可能是适用的毒性和遗传毒性研究，并在适用时提供了替代的归一化方法（图6）。高效的显微镜数据采集和分析需要使用自动显微镜平台和可用软件。

图6.示例SRB细胞质和核掩模。固定iPSC来源的星形胶质细胞并按照TCA-SRB（a）所述进行染色，然后在H 2 O中用10 µM LCS1染料染色（b）。用相衬图像（c）覆盖（比例尺= 100 µm）。

菜谱
10毫米H 2 DCFDA
每1毫升DMSO 27.6毫克

储存在-20°C并在准备后的3个月内使用

每1毫升足以进行约450 x 96孔微孔板检测

10％三氯乙酸
每100 ml MilliQ级水溶解10 g TCA

10％TCA中的0.004％w / v SRB
每100 ml 10％TCA溶解4 mg SRB

10 mM Trizma碱（121.14 g / mol ）
溶解121.14毫克的Trizma每100ml的MilliQ级水

致谢
这项研究由慈善捐赠和伊拉瓦拉健康与医学研究所（IHMRI）的一笔资助提供资金。LO得到澳大利亚国家痴呆症研究领导力研究金（APP1135720）的支持，由美国国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）支持。H 2 DCFDA测定法基于先前列出的与氧化应激相关的出版物中的方法（Han等，2009）。SRB方案基于先前建立的细胞毒性方案的发现（Skehan等，1990）。感谢Reece Gately博士的有益讨论。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

参考文献
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