材料和试剂
用料
384孔黑色板（Greiner-Bio，目录号：781091）
384孔LDV源板（Labcyte ，目录号：LP-0200）
384孔源板密封件（Fluidx ，目录号：41-1011）
5 ml血清移液管（Fisher Scientific，目录号：13-676-10H）
10 ml血清移液管（Fisher Scientific，目录号：13-676-10J）
25 ml血清移液管（Fisher Scientific，目录号：13-678-11）
10个微升移液管尖端（Fisher Scientific公司，目录号：02-707-441）
200个微升移液管尖端（Fisher Scientific公司，目录号：02-707-422）
1 ，000微升移液管尖端（Fisher Scientific公司，目录号：02-707-402）
15 ml F alcon管（Greiner-Bio，目录号：188271）
50 ml F alcon管（Greiner-Bio，目录号：227261）
T75烧瓶（Greiner-Bio，目录号：658175）
冷冻小瓶（Greiner-Bio，目录号：122261）

试剂种类

LUHMES细胞（ATCC ® CRL-2927 TM ）
GFP-LUHMES细胞（RRID：CVCL_B056，Ratcliffe等，2018）
表达GFP的慢病毒颗粒
先进的DMEM / F-12（Thermo Scientific，目录号：12634010）
纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：FC010）
聚L-鸟氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4957）
PBS片剂（Thermo Scientific，目录号：BR0014G）
胰蛋白酶10x（Lonza，货号：BE02-007E）
L-谷氨酰胺（Lonza，货号：BE-17-605E）
N-2补充剂（Gibco，目录号：11520536）
Pen-Strep（Lonza，货号：DE17-603E）
碱性FGF（Peprotec ，目录号：100-18B）
dCAMP （Sigma-Aldrich，目录号：D0627）
GDNF（Peprotech ，目录号：450-10）
四环素（Sigma-Aldrich，目录号：T7660）
Hoechst（Sigma，目录号：94403）
TMRM（Invitrogen，货号：T668）
无菌1x PBS（请参阅食谱）
无菌1x胰蛋白酶（请参阅食谱）
LUHMES基本媒体（请参阅食谱）
先进的DMEM / F-12
N-2补品
Pen-Strep
谷氨酰胺

LUHMES扩散介质（请参阅食谱）
LUHMES基础媒体
碱性FGF

LUHMES差异化媒体

四环素

营地
GDNF

设备

机械移液枪，用于血清移液器
机械移液器（P20，P200，P1000）
多通道机械移液器（P10，P200）
4°C冰箱
-20°C冷冻室
-80°C冷冻室
无菌组织培养罩
高压釜
组织培养离心机（MSE Harrier 15/80，目录号：MSB080.CX1.5）
源板离心机
CO 2培养箱（三洋，型号：MCO-19AIC）
Echo 550液体处理器（Labcyte ，目录号：Echo 550）
MultiPod控制器（Roylan Developments，目录号：SPOD0012）
StoragePod机柜（Roylan Developments，目录号：SPOD0010）
Opera Phenix高内涵放映系统（PerkinElmer）

软件

回声液体处理器软件（Labcyte ）
回声板重新格式化（Labcyte ）
和谐高内涵成像和分析软件（PerkinElmer）
哥伦布图像数据存储和分析系统（PerkinElmer）
Excel 2016（Microsoft）
GraphPad Prism 8.2（GraphPad）

程序

GFP-LUHMES细胞的生成

GFP-LUHMES细胞是通过在PGK启动子的控制下用表达GFP的慢病毒颗粒转导增殖LUHMES细胞而产生的（Ratcliffe等，2018）。

每个T75烧瓶以1.5 x 10 6的密度播种LUHMES细胞（p3-p5）。
用表达GFP的慢病毒颗粒转导24小时。MOI为8；为了进行转导，使用1：100的稀释液。先前通过FACS分选评估转导效率为98.5％。表达GFP的慢病毒颗粒是谢菲尔德大学的Eva Karyka和Mimoun Azzouz的礼物。
24小时后，在开始实验前，在LUHMES增殖培养基中保持72小时。

第一部分：GFP-LUHMES细胞维持方案

在无菌培养罩中去除和接种GFP-LUH MES细胞
根据以下食谱准备LUHMES增殖培养基和无菌1x PBS。
准备一个纤连蛋白聚-L-鸟氨酸涂层的T75烧瓶。
通过加入制备出10毫升纤连蛋白聚L-鸟氨酸涂布每T75瓶解的1微克/毫升纤连蛋白和50微克/ ml的聚-L-鸟氨酸到无菌蒸馏水中。
混合纤连蛋白聚-L-鸟氨酸涂层溶液，并使用10毫升血清移液器将10毫升转移至T75烧瓶中。
将烧瓶与纤连蛋白聚-L-鸟氨酸涂层溶液在37°C下孵育至少3小时或过夜。
使用10毫升血清移液管从烧瓶中除去纤连蛋白聚L-鸟氨酸涂层溶液。
使用10 ml血清移液器将5 ml无菌1x PBS转移到烧瓶中，并从一侧到另一侧轻轻倾斜烧瓶，使PBS遍及整个表面，从而清洗涂层表面。应当将PBS留在烧瓶中，直到将细胞种入烧瓶之前，以防止涂层干燥。烧瓶在使用前最多可以准备1小时。
将GFP-LUHMES细胞解冻并接种到LUHMES增殖培养基中。
从冰箱中取出准备好的LUHMES增殖介质，然后加热至室温。
从冷藏库中取出一个冷冻的GFP-LUHMES细胞小瓶。通常，我们建议重振1-10代的小瓶，以使存活的细胞可以经历多次分裂，然后在15代退休。
使用10毫升血清移液器将10毫升室温LUHMES增殖培养基添加到15毫升F alcon中。
转移〜500 μ升室温LUHMES扩散介质向GFP-LUHMES细胞小瓶使用P1000机械移液管慢慢通过抽吸和反复排出液体在尖端混合。
将GFP-LUHMES细胞小瓶中的溶液完全除霜后，将其转移至15 ml F alcon中的室温LUHMES增殖培养基中。
从带涂层的T75烧瓶中取出所有1x PBS，然后使用10 ml血清移液管将15 ml F alcon中的所有细胞溶液添加到T75烧瓶中。
前后倾斜烧瓶，然后左右倾斜2-3次，以使GFP-LUHMES细胞均匀分布在涂层表面上。
将烧瓶在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育。
在第二天，更换GFP-LUHMES细胞培养基以去除所有未完全附着的细胞。
使用10毫升血清移液器从T75烧瓶中取出所有培养基。
使用10毫升血清移液器将10毫升室温LUHMES增殖培养基添加到T75烧瓶中。
将烧瓶在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育。

每3-4天或在无菌培养柜中汇合率为80-90％时分裂GFP-LUHMES细胞
根据上述步骤（步骤A2），准备两个纤连蛋白聚L-鸟氨酸涂层T75烧瓶。
镨根据下面的食谱epare LUHMES扩散媒体和1x胰蛋白酶。如果已预先准备好，请从冰箱中取出，使其温度升至室温。
将GFP-LUHMES细胞分成两个装有LUHMES增殖培养基的烧瓶。一瓶用于维持种群，一瓶用于区分。
使用10 ml血清移液管从GFP-LUHMES细胞瓶中取出所有LUHMES增殖培养基，并将5 ml转移到15 ml F alcon中。
使用10 ml血清移液器将5 ml室温1x胰蛋白酶添加到GFP-LUHMES细胞烧瓶中。
在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育GFP-LUHMES细胞烧瓶5分钟。
用力敲打GFP-LUHMES细胞瓶的侧面2-3次，以将细胞移入溶液中。如果成功，细胞云应该在解决方案中可见。
将所有细胞溶液从GFP-LUHMES细胞瓶转移到含有5 ml用过的LUHMES增殖培养基的15 ml F alcon中。
在工作台上，将15 ml F alcon以400 xg离心4分钟。
使用10毫升血清移液器移出上清液并丢弃。
根据所需的分裂比例，将沉淀的GFP-LUHMES细胞重悬于适量的LUHMES增殖培养基中。我们建议完全融合的烧瓶的分流比为1:15，准备在3天后再次分流，尽管这可能需要根据细胞行为而稍作调整。
从包被的T75烧瓶中取出所有1x PBS，并使用10 ml血清移液管向每个烧瓶中加入10 ml LUHMES增殖培养基。
向两个T75烧瓶中的LUHMES增殖培养基中添加适量的重悬的GFP-LUHMES细胞溶液。

每两天更换一次GFP-LUHMES细胞上的增殖培养基（拆分后）
删除˚F爱尔康从冰箱里LUHMES扩散媒体的管温至室温。
将GFP-LUHMES细胞上的培养基更改为新鲜的增殖培养基。
使用10 ml血清移液管从GFP-LUHMES细胞瓶中取出所有LUHMES增殖培养基，并丢弃。
使用10毫升血清移液器将10毫升室温LUHMES增殖培养基添加到GFP-LUHMES细胞烧瓶中。
将烧瓶在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育。

第二部分：GFP-LUHMES细胞分化和重铺方案

开始分化GFP-LUHMES细胞（第1天）
GFP-LUHMES细胞分裂后等待2-3天，以使其增殖。
根据以下配方准备LUHMES分化培养基。每次使用前必须将其新鲜。
将GFP-LUHMES细胞上的增殖培养基更改为分化培养基。
使用10 ml血清移液管从GFP-LUHMES细胞瓶中取出所有LUHMES增殖培养基，并丢弃。
使用10毫升血清移液器将10毫升室温LUHMES分化培养基添加到GFP-LUHMES细胞烧瓶中。
将烧瓶在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育。

Replate区分GFP-LUHMES到384孔PLA TE （目录号：781091）（第3天）
准备纤连蛋白聚-L-鸟氨酸包被的384孔板。
制备15毫升纤连蛋白聚L-鸟氨酸涂布每384解-通过加入1孔板微克/毫升纤连蛋白和50微克/ ml的聚-L-鸟氨酸到无菌蒸馏水中。
混合纤连蛋白聚-L-鸟氨酸涂层溶液，并将15毫升转移到适合多通道移液的合适容器中（例如，但不限于上翘的移液箱盖，干净且无菌）。
使用P200多通道机械移液器将50μl纤连蛋白聚L-鸟氨酸涂层溶液转移至384孔板的每个孔中，除了最外面的两个列和行。
使用P200多通道机械移液器将40μl无菌1x PBS转移至每个空的最外面的孔中，以充当防火墙。
将烧瓶与纤连蛋白聚-L-鸟氨酸涂层溶液在37°C下孵育至少3小时或过夜。
使用P200多通道机械移液器从384孔板中除去纤连蛋白聚L-鸟氨酸涂层溶液。
使用P200多通道机械移液器将50μl无菌PBS转移至每个包被孔中，以清洗包被表面。
根据以下配方准备LUHMES分化培养基。
提起GFP-LUHMES细胞并将10,000个细胞/孔接种到包被的384孔板中。
使用10 ml血清移液管从分化的GFP-LUHMES细胞瓶中取出所有LUHMES分化培养基，并将5 ml转移到15 ml F alcon中。
使用10 ml血清移液管将5 ml室温1x胰蛋白酶添加到分化的GFP-LUHMES细胞烧瓶中。
在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育分化的GFP-LUHMES细胞烧瓶5分钟。
用力敲打分化的GFP-LUHMES细胞瓶的侧面2-3次以将细胞移入溶液中。
将所有细胞溶液从分化的GFP-LUHMES细胞烧瓶转移到含有5 ml用过的LUHMES分化培养基的15 ml F alcon中。
在工作台上，将15 ml F alcon以400 xg离心4分钟。
使用10毫升血清移液器移出上清液并丢弃。
将沉淀的GFP-LUHMES细胞重悬于5 ml的LUHMES分化培养基中，通过抽吸并用P1000机械移液器将GFP-LUHMES重悬10-15次，使其充分匀浆。
制备血球和转移10微升GFP-LUHMES再悬浮到计数网格。
计数GFP-LUHMES细胞的数量，并计算GFP-LUHMES重悬液中的细胞/ ml。
除去含有4 x 10 6个细胞的GFP-LUHMES重悬液，并转移至15 ml F alcon。这将是电镀悬浮液。
使用10毫升血清移液管，用LUHMES分化培养基将平板悬浮液加至最终体积12毫升。
使用P200多通道机械移液器从384孔板前半部分的包被孔中除去PBS。
通过用10 ml血清移液管吸移溶液10-15次，将镀液悬浮液彻底匀浆。
将一半的电镀悬浮液（6毫升）转移到适合多通道移液的合适容器中。
将30μl的平板悬浮液转移至384孔板的每个包被孔中。
使用P200多通道机械移液器从384孔板后半部分的包被孔中除去PBS。
通过用10 ml血清移液管吸出并排出溶液10-15次，将镀液悬浮液在15 ml F alcon中彻底重新均匀化。
将其余的电镀悬浮液转移到储槽中，并使用P200多通道机械移液器将每孔30μl的电镀悬浮液填充到剩余的涂覆孔中。
来回移动板数次，然后左右移动数次，以确保细胞均匀分布在孔底。
在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育384孔板。

第三部分：GFP-LUHMES药物筛选方案（第二部分的时间表继续）

用鱼藤酮处理分化的GFP-LUHMES 384孔板（第5天）
根据以下配方准备LUHMES分化培养基。
在无菌培养罩中准备鱼藤酮处理过的培养基和媒介处理过的培养基。
为了避免细胞的干扰，我们避免移除媒体，而是补足每孔10微升鱼藤酮处理的介质给予40个的最终体积微升媒体每孔。因此，鱼藤酮处理过的培养基必须以所需最终浓度（4μM ）的四倍制备。
将4 ml LUHMES分化培养基转移至15 ml F alcon并贴上“鱼藤酮”标签。转移4毫升LUHMES分化培养基的另一15毫升˚F爱尔康和标签“车辆”。
准备在乙醇中的10 mM鱼藤酮。鱼藤酮粉应在通风橱中称量。
添加6.4微升10毫鱼藤酮向媒体在15毫升˚F爱尔康标记“鱼藤酮”使用P20移液管机械。孔中鱼藤酮的最终浓度为4μM 。
使用P20机械移液器将等体积的乙醇（6.4μl ）加入15 ml F标记为“ Vehicle”的F alcon 。
缓慢颠倒3-4次，混合15 ml F alcons。
将处理过的培养基转移到分化的GFP-L UHMES 384孔板中。我们建议的板地图如图URE 2A（即，“DMSO媒介物”孔用载体处理的媒体，而所有其他井用鱼藤酮处理的培养基处理处理过的）。
转移的“鱼藤酮”媒体内容˚F爱尔康和“车辆”媒体˚F爱尔康成多通道移液单独的存储器。相应地标记容器。
使用P10多通道机械移液器将10μl鱼藤酮处理过的培养基转移至384孔板的每个孔中，确保移液器吸头放置在孔中足够深，以确保喷射的液体与孔中的内容物混合。保留一些未处理的孔，以添加溶媒处理的介质，以稍后测量鱼藤酮的效果。我们建议按照以下步骤B3的说明，在每个仅DMSO的控制栏中包括对某些井进行车辆处理。使用P10多通道机械移液器将10μl媒介物处理的介质转移到384孔板的每个未处理孔中。
在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育384孔板。
在DMSO中准备化合物并编写协议以使用Echo 550 Liquid Handler和Opera Phenix高内涵筛选系统
在带有板密封的384孔离子源板上（目录号：LP-0200）在100％无水DMSO中准备化合物和文库。将其存放在StoragePod机柜中，并使用MultiPod控制器保持干燥的氮气氛围。
使用Echo Liquid Handler软件编写复合传输协议。源板应设置为“ 384LDV-DMSO”，目标板应设置为“ Griener_384PS_781096”，并选择自定义映射。
设置方案，以将适当体积的样品从源板的每个孔转移到目标板上的相应孔，以提供所需的最终药物浓度。我们建议将目标板分成四等分，并使用每四分之一的第一列进行仅DMSO处理作为阴性对照（图2）。然后可以将每个季度中每个经过化合物处理的井的参数值标准化为该季度中各个DMSO对照井的值。对于一个完整的剂量反应曲线，我们建议测试8个浓度对于每种化合物在每个半对数，即，3纳米，10纳米，30纳米，100纳米，300纳米，1 ，000 nM的，3 ，000纳米，10 ，000 nM 。我们还建议在每个平板上至少包含一种阳性对照化合物。我们使用了先前在室内发现的对线粒体和形态参数显示出有益影响的化合物。

图2.测定GFP-LUHMES 384孔板药物筛选后的板图和示例图像。A.板图显示了对照孔和测试化合物孔的建议布置。除“ DMSO载剂”井外，所有井均用鱼藤酮处理。的颜色表示在浓度nM的每种化合物。BD。蓝色= DAPI，橙色= TMRM，绿色= GFP，比例尺s = 20μm 。使用Opera Phenix高内涵筛选系统从（B）车辆处理的DMSO对照井，（C）鱼藤酮处理的DMSO对照井和（D）鱼藤酮处理的阳性对照井（ 1 ，000纳米）。

在Harmony High-Content Imaging and Analysis Software上编写用于对LUHMES细胞进行成像的成像方案（详细信息如下）。使用DAPI，Alexa 488和Cy3通道分别捕获Hoechst信号，GFP信号和TMRM信号。使用测试图像以确保每个激光的适当曝光时间；这需要由用户设置，因为它取决于每个成像系统的激光功率的信号强度。使用40x水共焦物镜，将场数设置为10，将堆栈数设置为6。每个孔中的字段。

用化合物处理分化的GFP-LUHMES 384孔板（第6天）
卸压的StoragePod使用机柜多脚外壳并取出384孔源板。
以2500 xg的速度离心384孔源板2分钟，以除去板内容物中的所有气泡。
在每次独立印版拍摄之前，请校准并专注于Echo 550液体手柄r。
使用Echo 550液体处理机测量384孔ldv源板。确保每个孔中的体积足够高，以根据化合物转移规程将所需体积转移至目标板。请注意，384孔源头中每个孔的体积不应超过12μl 。确保每个孔中的水含量不超过30％（这是根据DMSO含量的测量得出的，水含量不应低于70％；如果是这种情况，则必须刷新该孔中的水含量）。
从384孔离子源板上取下密封垫，然后启动化合物转移方案。出现提示时，将384孔源板和目的板转移到机器中。
方案完成后，取出目的板并立即在37°C / 5％CO 2的培养箱中培养。
更换384孔离子源板上的密封，并使用Multipod Controller对StoragePod机柜减压。装回StoragePod机柜中的384孔源板。锁定和repressurise的StoragePod使用机箱多脚控制器。

测定并成像GFP-LUHMES 384孔板（第7天）
根据以下配方准备LUHMES分化培养基。
准备测定培养基。
在无菌蒸馏水中准备10 mM Hoechst。
准备80 μM TMRM在DMSO。
将4 ml LUHMES分化培养基转移到15 ml F alcon中。
20添加微升的X毫Hoechst的解决15毫升˚F爱尔康。
20添加微升的X毫TMRM解决15毫升˚F爱尔康。
通过缓慢颠倒F alcon 4-5次来混合15 ml F alcon（测定培养基）的内容物。
用检测培养基孵育GFP-LUHMES 384孔板1小时。
将测定介质转移到适合多通道移液的合适容器中。
使用P10多通道机械移液器将10μl分析介质转移到384孔板的每个孔中，确保移液器吸头放置在孔中足够深，以确保喷射的液体与孔中的内容物混合。
将GFP-LUHMES 384孔板在37°C / 5％CO 2培养箱中孵育1小时。
使用Opera Phenix高内涵筛选系统对GFP-LUHMES 384孔板成像。
将Opera Phenix上的TC O（温度和CO 2 ）设置设置为37°C和5％CO 2并将两者都设置为“ On”。出现提示时，打开连接的CO 2气瓶。使系统达到所需的温度和气体水平。
打开准备的成像协议。
加载GFP-LUHMES 384孔板。
冲洗水物镜。
运行测试并调整每个通道的曝光时间，以使强度在背景水平上显着。如果需要，请调整堆栈的高度，以使图像在单元的整个高度上都能很好地聚焦。
运行成像协议（图2）。

数据一nalysis

图像将使用哥伦布图像数据存储和分析系统进行批量分析。GFP信号将用于评估神经元形态参数，TMRM信号将用于评估线粒体功能和形态。

提供了一个简短的视频（视频1），以显示分析软件并提供协议部分的指南，并在下面提供详细说明。

视频1.使用哥伦布分析软件进行分析设置

成像协议完成后，将测量文件导出到方便的位置。确保选择了“ Measurements Inc.关联文件”，并记下导出路径。
将导出的文件导入到Columbus图像数据存储和分析系统。
选择“图像分析”选项卡，然后打开导入的文件。
使用以下构造块编写分析协议。通过单击蓝色加号添加新的构建基块。
输入图像。这是将图像加载到分析工具中的位置。选择“最大投影”进行堆叠处理，选择“基本”进行平面校正。取消选中“快速调谐”旁边的框。
找到核子。此第一个“查找核”构建基块用于辅助后续构建基块中的GFP神经突检测。Hoechst信号将在以后用于更准确地计数原子核。将通道设置为“ Alexa 488”（GFP）并使用方法A。将输出种群标记为“核仁（GFP神经突）”。
查找神经突。将通道设置为“ Alexa 488”（GFP），并确保将“人口”设置为“核（GFP神经突）”，将“区域”设置为“核”。将进行两项选择，如图像上方的标签所示。上面选择的核的位置，并标记为“核（GFP神经突）”（图3A），第二个检测图像中标记为“神经核节段”的任何神经突结构。单击黑色的向下箭头并调整值。每个检测参数，以便尽可能多地选择神经突，不要在“神经链片段”选择中关注背景检测，因为在以下构造块中将删除该背景检测，将输出总体标记为“神经链片段”。
选择人口。现在，我们将滤除上面“查找神经突”选择中检测到的背景碎片。将“人口”设置为“ Neurite细分”，将“方法”设置为“按属性过滤”。单击黑色的向下箭头，展开下拉菜单。选择“段长”，“神经节段面积”和“神经节段圆度”，并调整值，直到从选择中去除了大部分碎片，但“真实”神经突保持选中状态。我们使用的值> 12.5，> 0.7 ，分别> 0。将输出总体标记为“选定的神经链段”。
计算形态特性。选择人口“选择了Neurite段”并使用方法“标准”。展开下拉菜单，然后选中每个参数旁边的框。
计算形态学性质（2）。选择种群“ Nuclei（GFP神经突）”，区域“ Neurite树”和方法“标准”。展开下拉菜单，然后选中每个参数旁边的框。
查找图像区域。选择通道“ Cy3”，将“ ROI填充”设置为“无”，将方法设置为“通用阈值”。展开下拉菜单，然后将阈值更改为适当的水平，以选择大部分信号而不会产生过多背景。嘀“拆分成对象”，展开进一步下拉菜单和最小区域改变为适当的值，以除去背景（我们使用> 25微米2 ）。保持“填充孔”不变。将输出人口标记为“图像区域（Cy3）”。
查找图像区域（2）。重复步骤（g。），但使用“ Alexa 488”通道选择GFP神经突图像区域（图3B）。将输出种群标记为“图像区域（GFP神经突）”。
过滤图像。现在将分割线粒体。将通道“ Cy3”和方法设置为“ Texture SER”。展开下拉菜单，然后将“过滤器”设置为“ SER Ridge”，将“缩放”设置为1 px ，将“归一化”设置为“未归一化”。将输出图像标记为“ SER Ridge”。
计算图像。该步骤放大信号以改善分割。将方法设置为“按公式”，然后输入公式“ A * 1000”。将通道A设置为“ SER Ridge”，并将输出图像标记为“计算图像”。
查找景点。将“计算图像”通道和“ ROI填充”设置为“图像区域（GFP神经突）”。这样可以确保仅将GFP神经突选择中的线粒体进行分割。将方法设置为“ D”，并将输出人口标记为“线粒体”。
选择人口。将人口设置为“线粒体”，将方法设置为“按属性过滤”。选择参数“ Spot Area [px 2 ]”，选择“>”，然后输入一个最小值以清除选择中的任何碎片（我们使用8 px 2 ）（图3C）。将输出人口标记为“选择的线粒体”。
计算强度特性（2）。设置通道“ Cy3”，种群“图像区域（GFP神经突）”和区域“图像区域”。将“方法”设置为“标准”，然后展开下拉菜单以勾选“均值”。这将在GFP神经突选择中测量TMRM信号强度。
计算形态特性。设置人口“选择线粒体”和方法“标准”。展开下拉菜单，然后勾选“区域”和“圆度”。这将测量分段线粒体的形态学特性。将输出属性标记为“线粒体形态”。
计算纹理属性。设置通道“ Cy3”，人口“线粒体”，并使用方法“ SER功能”。这将测量线粒体分段的纹理属性。将输出属性标记为“线粒体纹理”。
找到核子（2）。设置通道“ DAPI”并使用方法“ C”。展开下拉菜单，然后适当调整“通用阈值”。调整的最小面积，以除去背景碎片（我们使用> 20微米2 ）（图3D）。将输出总体标记为“ Nuclei（DAPI）”。
定义结果。使用方法“输出列表”。对于每个人口，展开下拉菜单，然后从每个测量的参数中选择所需的输出类型。或者，使用“全部应用”为该总体中所有测得的参数选择输出类型。单击构建基块顶部的绿色箭头以应用更改，然后保存协议。

图3.使用哥伦布图像数据存储和分析系统选择分析协议。A.使用Alexa 488通道进行“查找神经突”选择，请参阅数据分析协议的步骤4c。B.使用Alexa 488通道进行“查找图像区域”选择，请参阅步骤4h。C.使用分段的线粒体通道“选择种群”，请参阅步骤4l。缩进的图像显示了各个选择的特写。D.使用DAPI通道进行“查找核”选择，请参阅步骤4q。所有比例尺= 20μm 。

选择“批次分析”选项卡，然后从左侧面板中选择要分析的数据文件夹。然后，选择上面编写的分析协议。单击绿色箭头开始分析。
分析完成后，结果将显示在左侧面板中的相应数据文件夹中。选择浏览选项卡。通过单击旁边的加号打开相应的数据文件夹，然后选择“结果”文件以将其打开。在右下方的面板中，“摘要”选项卡将显示该分析的数据。单击与“结果”文件的名称相对应的相邻标签，以完整查看原始数据。使用蓝色的“下载”链接下载文件。
在Excel 2016中打开下载的文件。整理数据，以便按顺序对每种浓度下每种化合物以及对照孔的参数值进行排序。
使用每个参数的单独数据表，将每个化合物的数据输入到GraphPad Prism 8.2中。确保每种化合物按列组织，每种浓度按行组织。包括阳性对照化合物的数据。
统计一nalysis

统计分析将取决于实验设置。但是，应控制某些重要的板反应，以确保测定的鲁棒性和可重复性。

创建另一个数据表，并在整个板上绘制核数（DAPI）。这应保持一致，以最大程度地减少印版漂移影响。
创建另一个数据表，并针对每个参数针对DMSO鱼藤酮控制井绘制DMSO车辆控制井的值（图4A）。一个显著差异应被视为对每个参数。
计算Z'和SW分数，以确保测定的鲁棒性。公式为：

在此协议中，“最大值”是指DMSO车辆控制井中的值，而“最小值”是指DMSO鱼藤酮控制井中的值。图4B中给出了该测定中各种参数的Z′得分的示例数据。通常，在表型筛选分析中可以使用高于0.5的Z'评分和高于2的SW评分。

通常，将进行采用Dunnet事后测试的单向ANOVA，以比较单一浓度药物对溶媒处理井的作用。或者，如果进行了浓度响应板图分析，通常使用对数（激动剂）对响应（三个参数）的数据进行非线性回归（曲线拟合）分析。所有分析均在GraphPad Prism 8.2中进行。

图4.显示鱼藤酮效应的实例数据，来自GFP-LUHMES 384孔板药物筛选的Z'得分。一。通过比较DMSO媒介物处理过的孔与DMSO鱼藤酮处理过的孔的值，显示了三个示例参数的鱼藤酮效应。在这两种情况下，鱼藤酮处理过的孔的平均参数值与媒介物处理过的孔均显着不同（*** = P < 0.0001）。B.在四个分开的板上的几个参数的Z'得分，每个得分相隔三周。参数“ Neurite圆度”表示通过比较单元格面积与单元格周长来度量单元格形状；与球形细胞的分数最高为1相比，具有广泛神经突的健康神经元的分数非常低，接近0。

笔记

一旦到达第15代，GFP-LUHMES细胞应被淘汰，并以年轻的种群代替。
冷冻GFP-LUHMES储备液时，建议拆分一个完全融合的T75烧瓶，将沉淀重悬于5 ml LUHMES增殖培养基中，加入10％DMSO和20％FBS，然后在5个冷冻小管之间均分。
在血球计数器上计数GFP-LUHMES细胞时，仅应计数圆形的明亮球体。
当将已分化的GFP-LUHMES细胞转移至384孔板时，应迅速采取行动，并在两次转移之间使用多通道移液器将细胞悬液重新匀浆。这是为了确保每个孔中铺板的细胞数量在整个板上尽可能一致。
分析软件可以输出其他一些参数，包括细胞数量和带有神经突的细胞数量，这些参数对于评估细胞活力，跨板漂移和条件以及分析天数之间的变异性非常有用。
菜谱

无菌1x PBS
在适合高压灭菌的烧瓶中将5片PBS片加入500毫升蒸馏水中
混合直至片剂溶解并高压灭菌
室温保存
无菌1x胰蛋白酶
向适合高压灭菌的烧瓶中加入500毫升蒸馏水
将烧瓶高压灭菌并转移到无菌培养罩中
在通风橱中，将45 ml无菌蒸馏水加到50 ml F alcon中的5 ml胰蛋白酶10x中
颠倒2-3次进行混合
储存在4°C
LUHMES基础媒体
储存在4°C

500毫升Advanced DMEM / F-12
5毫升N-2补品
5毫升Pen-Strep
5毫升L-谷氨酰胺

LUHMES扩散媒体
在4°C下存放一周

50毫升LUHMES基本培养基
40 ng / ml碱性FGF

LUHMES差异化媒体
每次使用都准备新鲜

20 ml LUHMES基础培养基
1微克/毫升四环素

1毫米dCAMP
2 ng / ml GDNF

致谢

这项工作由HM（F-1301）的帕金森英国高级研究金和HM（I-1904）的帕金森英国虚拟生物技术项目资助。LF得到医学科学院（SBF002 \ 1142）和医学研究理事会（MRC，拨款1812144）的支持。IV由墨西哥Consejo Nacional de Ciencia y Technologia （CONACyT ）支持。

GFP-LUHMES细胞的产生是基于Ratcliffe等人先前建立的方案。，2018。

竞争我nterests

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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