材料和试剂
微量离心管（Biosharp，生命科学，目录号：BS-15-M）
50ml离心管（BIOFIL ® ，目录号：CFT011500）
15ml离心管（BIOFIL ® ，目录号：CFT011150）
陪替氏培养皿（BIOFIL ® ，90毫米P ETRI皿）
离心过滤器（的Vivaspin ®睿频15 10000 MWCO PES）
层析柱（生工生物® ，目录号：F506609-0001）
HiTrap Q HP 5ml（GE Healthcare，目录号：17115401）
铝箔（METRO）
96孔微孔板（Sangon Biotech，目录号：F605033-0001）
多通道移液管尖端（BIOFIL ® ）
橡树脊PPCO离心管（Thermo Scientific TM Nalgene TM ，目录号3119-0010PK）
BL21（基因型：˚F - ，OMPT，HSDS（RBB-MB-），加仑，DCM（DE3））
编码具有重组GTP酶的质粒6× his标签（从TsingKe合成乙iological Ť童占梅）
2-巯基乙醇（BME）（甲mresco ® ，目录号：0482-250ML）
琼脂（Sangon B iotech，目录号：A505255-0250）
鸟苷5'-三磷酸三钠盐（GTP·Na3）（Sangon B iotech，目录号：A620250-0100）
鸟苷5'-二磷酸二钠盐（GDP·Na2）（Sangon B iotech，目录号：A600492-0100）
经典laemmli十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（Sangon B iotech，目录号：C631100-0200）
未染色的蛋白质标记物（Sangon B iotech，目录号：C600524-0020）
考马斯亮蓝R-250（Sangon B iotech，目录号：A100472-0025）
Ni-NTA Sefinose（TM）树脂（Sangon B iotech，目录号：C600033-0100）
Milli-Q水
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sangon B iotech，目录号：A610425-0025）
甘油（成都ķ e龙Ç hemical ř eagent ˚F actory）
甘氨酸（Sangon B iotech，目录号：A100167-0001）
MANT-GDP三乙铵盐溶液（Jena的Bioscience公司，目录号：NU-204S）（化学结构示于图S1）
Tris（Sangon B iotech，目录号：A100193-0005）
SDS（Beyotime，目录号：ST626）
浓HCl（成都ķ e龙Ç hemical ř eagent ˚F actory）
冰醋酸（成都科龙化学试剂厂）
乙醇（成都科龙化学试剂厂）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：V900477-500G）
氢氧化钠（成都科龙化学试剂厂）
氯化钠（NaCl）（Sangon B iotech，目录号：A610476-0001）
胰蛋白（（Sangon B iotech，目录号：A110859-0500）
酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
液氮
六水合氯化镁（MgCl 2 ·6H 2 O）
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）（成都科龙化学试剂厂）
IPTG（Sangon B iotech，目录号：A100487-0100）
异丙醇（成都科龙化学试剂厂）
氨苄西林（Sangon B iotech，目录号：A610028-0025）
LB汤（请参阅食谱）
含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板（请参阅食谱）
100 mg / ml氨苄西林（请参阅食谱）
1 M IPTG（请参阅食谱）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（请参阅食谱）
1 M HEPES-NaOH（pH 7.5）（请参阅食谱）
5 M NaCl（请参阅食谱）
100x PMSF（请参阅食谱）
50％甘油（请参阅食谱）
1 M MgCl 2 （请参阅食谱）
2 M咪唑-HCl（pH 7.5）（请参阅食谱）
0.5 M EDTA（pH 8）（参见配方）
10 M NaOH（请参阅食谱）
10倍运行缓冲区（请参阅食谱）
5倍加载缓冲区（请参阅食谱）
考马斯亮蓝染色溶液（请参阅食谱）
考马斯亮蓝脱色溶液（请参阅食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
库存缓冲区（请参见食谱）
Mant-GDP兑换缓冲区（请参阅食谱）

设备

Milli-Q水（ELIX ®优势净水系统）
250 ml培养瓶（成都舜牛，目录号：sjsp24624）
2 L培养瓶（成都舜牛，货号：sjsp4637）
500毫升烧杯（成都舜牛，货号：sb56448）
培养摇床（上海只楚我nstrument有限公司，型号：ZQZY-80CH）
低速和高容量的冷冻离心机（无锡瑞江甲nalysis我nstrument有限公司，型号：RJ-LD-5000C）
冷冻离心机（SCILOGEX，型号：SNJK-D3024R）
1 L离心瓶（Thermo Scientific TM Nalgene TM PPCO，目录号：DS3132-0063）
台式pH计（奥豪斯® ，型号：STARTER 2100）
AKT纯色谱系统（GE Healthcare，型号：AKTA Pure）
-80 °C冰箱（Haier，型号：DW-86L626）
冷冻离心机（贝克曼库尔特，型号：Avanti J-26S XP，目录号：B14536）
荧光酶标仪（BioTek，型号：Synergy TM H1）
超声波仪（BioSafer，型号：650-92）
360°垂直旋转器（SCILOGEX，型号：MX-RL-E）
实验台（成都舜牛，货号：a13104）
电泳槽（Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN ®四，型号：1658000）
4 °C和-20 °C冰箱（Haier，型号：BCD-571WDPF）
旋涡混合器（晶科技和工业公司，ScilentShake ® ，型号：VM-01U，编号：3222046）
多通道电子移液器（Dragonmed toppette）
高压灭菌器（Zealway，型号：GR85DA）
精神浴（SCILOGEX，型号：HB120-S）
纳米光度计（IMPLEN，型号：IMN50 / N60）
Superdex TM 200增加10/300 GL预填充Tricorn TM色谱柱（GE Healthcare）

软件

Microsoft Excel（Microsoft）
GraphPad Prism 7软件（GraphPad软件）

程序

表达和重组冉的纯化在ë scherichia大肠杆菌
重组冉和其亩坦冉P180L瓦特ERE分别克隆到一个的pET-15b的表达载体，包含N-末端6×his标签融合和凝血酶消化位点。矢量地图包括所述插入的基因示于˚F igure S2。该FOLL由于用于冉和冉纯化协议P180L从先前报告改性（比巴克等人，2004）。对于Ras和RCC1的纯化，请参考这些研究（Pu和Dasso，1997； Burd等，2014）。
将编码6x his-Ran（或6x his-Ran P180L或6x his-tagged小GTPase的目标）的载体转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。扩增细菌中在2.5升培养瓶中液体肉汤培养基中。加入200μl1 M IPTG（异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷）诱导蛋白质表达，并于37 °C以220 rpm摇动烧瓶3 h。
收获细胞之前，将烧瓶放在冰上。将细胞转移到1 L离心瓶中。通过在4 °C下以4,700 × g离心15分钟来收集细菌。
丢弃的上清并用30ml预冷的裂解缓冲液重悬细胞沉淀。TRA nsfer再悬浮的细胞到50ml离心管中。
声处理细胞中的冰水浴10分钟（4秒上/ 6秒关闭以50％振幅）。离心机ë在39 ，000 ×克于4 ℃下在Beckman冷冻离心机30分钟。
用3 ml床体积的Ni-NTA树脂填充色谱柱。用10 ml洗涤缓冲液平衡色谱柱。重复平衡三遍。公司乌瓦特在4在层析柱中的树脂的澄清的裂解物℃在旋转15分钟。
用10毫升洗涤缓冲液洗涤树脂7-10次。
用7 ml洗脱缓冲液洗脱蛋白质。重复三遍。
浓缩ELU吃在3200 ×克在4℃下在一个冷冻离心机使用离心过滤器。转移浓缩ELU吃入1.5ml微量离心管和离心机Ë在21000 ×克5分钟。丢弃沉淀。
加载上清液（1毫升）到小号IZE exclu锡永层析柱（的Superdex 200我现象越来越）至交换缓冲液以储备缓冲。以0.5 ml /管的体积收集峰级分（通常从15.5 ml至17.5 ml ）。运行一个用5μl的SDS-PAGE凝胶的与2μl的混合峰级分样品的加样缓冲液以评估蛋白质的纯度。的SDS-PAGE凝胶的是节目的最终纯蛋白质是I所示Ñ图S3。
Concentrat Ë通过离心蛋白质在离心过滤器在3200 ×克在4℃ Ç直到最终的蛋白浓度是5〜10毫克/毫升时具有使用NanoDrop分光光度计测量。等分试样1毫克的每管蛋白。冷冻管在液氮和s在撕蛋白一个-80℃冷冻。

预实验，以测试MANT-GDP升oading效率（选择性）
该测定中Mant-GDP的上样效率可以根据GTPase的类型或突变而变化。如果已知GTPase具有较高的GDP绑定优先级，则可以跳过此步骤。
解冻1毫克的纯Ran。如果蛋白质被指控GDP不要紧（或GTP ）或没有。
在室温（室温）下，在1.5 ml离心管中以800μl的总体积孵育3 nmol的Ran，5μg的RCC1和3 nmol的mant-GDP。RanGEF RCC1有助于加速核苷酸交换并缩短达到平衡所需的时间。
加入20μl的交换缓冲液，交换缓冲液加25纳摩尔GTP，和交换缓冲液加25纳摩尔GDP ，在三个单独的孔中，在96孔板（即，每个缓冲区三个孔，共9个孔）。
等分试样孵育冉混合物从步骤2到9米的孔，在步骤3中制备（80 μ /孔）。在室温下孵育平板30分钟以达到平衡。
读取使用fluorescen荧光信号CE用Ex / Em比值酶标仪= 360纳米/ 440纳米。
分析数据。为了继续进行，必须有之间的差的间缓冲器和GTP样品，或在比标准偏差缓冲器和GDP样品，优选更高的20倍以上。
注：A L流相对于标准偏差的差异表明该蛋白质具有GDP相对低的亲和力。在这种情况下，MANT-GTP代替MANT-GDP应当用来测试负载效率在进行到之前的解离测定。还可以根据以前的协议（Kanie et al。，2018）预先用mant-GDP填充蛋白质，在进行以下步骤之前，最好将50％以上的蛋白用mant-GDP填充。

Mant-GDP解离分析
为了估算相对的GTP / GDP结合亲和力或“ GTP偏好”，我们设计了以下mant-GDP解离测定法，即先将野生型Ran（Ran WT ）或Ran P180L引入mant -GDP，然后再结合通过增加游离GTP或GDP的浓度来分离mant-GDP。可以绘制两条竞争对手离解响应曲线，从中可以确定IC50值，称为IC50 GDP和IC50 GTP 。偏压GTP ，其被定义为IC 50 GDP除以IC50 GTP ，然后计算为一个统一的测量的GTP偏好为一个小GTP酶的是描述如何偏压的GTP酶是病房GTP。
解冻1.0毫克的冉，0.1毫克的RCC1，100mM的GTP ，和100mM的GDP在冰上。
注意：应检查GTP是否可能受到GDP污染，尤其是在长期存放之后。含GTP的缓冲液应保存在冰上或在-80°C下保存。如果需要，使用阴离子交换Q柱进行纯化。GTP和GDP存量可以在交换缓冲液中以100 mM的浓度制备。
使用交换缓冲液将GDP或GTP稀释至1.25 mM。使8倍2.5 - 1.25毫GTP或GDP的两倍系列稀释液与所述交换缓冲液。最低浓度应为〜0.8μM。
注意：仅针对一种蛋白质生成Bias GTP时，应使用不同的系列稀释液（不同时制备）重复几次实验，以使报告的Bias GTP值不会反映稀释误差。甲吨至少60微升的溶液（对于3次重复）为每个GDP或GTP浓度是必需的。比较几种蛋白质时，应准备一系列稀释液，并将其用于所有蛋白质（即使存在稀释误差，该误差也会在相同程度上影响所有Bias GTP值）。我们建议每种浓度分别准备1毫升用于比较5种蛋白质。
混合264微克的冉，10微克的RCC1，和10nmol的MANT-GDP的与MANT-GDP交换缓冲液4毫升总体积。在室温下孵育20分钟。
笔记：
Mant-GTP应该用于d -GTP优先的小型GTPases。如果正确选择了mant-GDP或mant-GTP，理论上孵育相等摩尔比例的蛋白质和mant将产生至少50％的mant标记蛋白质。我们未发表的数据表明，只要标记效率远高于噪声水平，GDP，GTP或mant GDP / GTP负载蛋白的比例就不重要了（请参阅图B）。较高的mant-GDP或mant-GTP浓度确实会增加标记水平和观察到的信号。但是，背景噪声会更大（主要是由于移液错误所致），因此可能会降低信噪比。d UE未知原因，脱盐样品，以减少背景噪声有时不能改善信噪比。因此，我们不建议在此测定法中进行额外的脱盐步骤。
一种蛋白质的最小蛋白质混合物量为3.84 ml（14个浓度×3个重复，以及6个缓冲液样品，每个80 µl）。
加入100微升缓冲液交换到所有的外设进行人未使用的孔96的-孔板（如图所示1A ），以避免边缘效应小号。
注意：边孔的读数往往会略小。仅使用中心孔可以防止这些边缘效应，特别是在希望增加化验时间的情况下。

图1. Ran和Ran突变体Ran P180L的Mant-GDP解离图。一。解离板的典型布局。每个未使用的孔中均装有100 µl交换缓冲液。缓冲液样品（粉红色）包含蛋白质，但不包含GDP或GTP。GDP或GTP的最终浓度显示在顶部。乙。冉WT分离从国内生产总值（红色）和GTP （蓝色）。误差棒代表一式三份的标准偏差。IC 50个值示于表1 Ç 。冉P180L解离谱。P180位于Ran的C末端自抑制尾巴上。

加入20μl的不同浓度GTP或GDP的或缓冲液以在中间48个孔（在图所示1A ）。每个浓度一式三份进行测试。有六个缓冲样品小号（图1A ，在粉红色）。
注意：为了获得更高的精确度，可使用一式四份的读数进行测定。
将80μl/孔的蛋白质混合物等分到48个孔中，以形成100μl的总体积（最终浓度：2μM冉核苷酸，0.04μMRCC1和7种浓度的GTP或GDP，范围从250μM至1.0μM）。
摇动板轻轻三次30秒的fluorescen CE酶标仪。将板在室温下孵育30分钟。
使用fluorescen读取荧光信号CE用Ex / Em比值酶标仪= 360纳米/ 440纳米。摇板和重复的读数。这样做三到五次。原始数据的示例在补充ê Xcel公司文件。

数据分析

将原始数据导出到Microsoft Excel电子表格。
生成标准偏差和平均为的代表licate读数。检查数据不一致。将平均值用于以下计算。
计算每个GDP或GTP浓度的标准偏差和平均值，一式三份。检查是否有明显的异常值。请参阅补充Ë Xcel公司文件进行计算。
Ť他背景（最小读数）应该是highes吨GDP的浓度读数如果蛋白质显示一个更高的优先级为GDP，和反之亦然。减去背景，这是在步骤3中计算出的，从每一个的平均的平均值从步骤2 。
规格化通过将每个所述将来自步骤4的数据的的减去值由平均值减去交换的缓冲液样品读数，其中没有MANT-GDP解离。
通过将100％减去每个标准化值，将数据转换为从mant-GDP分离的蛋白质的百分比。
注意：未转换数据的y轴可能会标记为“ mant-GDP绑定的百分比”。但是，这可能是模棱两可的/误导性的，因为初始mant-GDP绑定的百分比在图中始终为100％，但是初始样本始终包含绑定的GDP或GTP的一部分。数据转换后，用“ mant-GDP离解百分比”标记y轴不再引起解释问题。该转换不会更改所计算的偏置GTP值。
适合转换使用四个数据-参数回归在GraphPad软件。切记使用浓度值的对数刻度进行数据绘图。显示每个数据点的标准偏差。绘制的数据的一个例子示于图小号1个1B和1C 。
记录GTP和GDP的IC50值和置信区间。计算偏置GTP由值（表1）除以IC50 GDP由IC50 GTP 。
注意：应注意，蛋白质的IC50 GTP或IC50 GDP值不能直接比较，因为初始的mant-GDP收费水平是可变的。对于一种蛋白质，GDP和GTP在它们的IC50浓度是同等有效的在dissociat荷兰国际集团结合MANT-GDP的50％下在相同的条件小号。因此，每个IC50 GDP / IC50 GTP比（简称为偏置GTP ）代表的蛋白质的偏好为与GDP相比GTP。甲偏置GTP的一种手段，该蛋白是无比率吨偏置朝向GDP或GTP。较大的偏置GTP数量越多施力的蛋白质是病房GTP。还应当指出的是，偏置GTP值可能不是GTP / GDP亲和力的真实比率，而是近似的真实比率。偏差GTP值不能用于计算实际亲和力比率，因为GDP / GTP / mant-GDP电荷蛋白的起始比率未知。如前所述，可能很难获得真实的亲和度。偏差GTP值更容易获得，并且更容易获得，但是当用于比较GTPases或其突变体时，可重复且合适。将所得到的冉偏置GTP值通常是与先前报告的GDP / GTP亲和力比一致的小号（Ť能够1）（Klebe等人，1995）。

表1.不同Ran突变体对GDP / GTP的结合偏好（Bias GTP ）。Bias G T P的值越大，表明该蛋白质更优选结合GTP。与Ran WT相比，Ran突变体P180L更倾向于结合GTP。
蛋白
竞争者
IC50（µM）
95％知己。间隔（µM）
偏置G T P （IC50 G D P / IC50 G T P ）
冉WT
国内生产总值
9.9
8.2至12.0
0.1 1
（0.1-0.14）a
GTP
87.8
78.4至98.3
冉P180L
国内生产总值
11.3
10.3至12.4
0. 57
GTP
19.9
17.7至22.5
a这是Klebe等人的估计值。（1995）。

菜谱

LB汤（1升）
将10 g NaCl，10 g胰蛋白tone和5 g酵母提取物溶于900 ml Milli-Q水中，并用Milli-Q水稀释至1 L
用高压灭菌器灭菌并保存在室温下
含100μg/ ml氨苄青霉素（1 L）的LB琼脂平板
将10 g NaCl，10 g胰蛋白,、 10 g琼脂和5 g酵母提取物溶于900 ml Milli-Q水中，并用Milli-Q水稀释至1 L
用高压灭菌器灭菌并冷却至50 °C
加入1毫升100毫克/毫升氨苄青霉素，并充分混合
倒入板中并储存在4 °C
100 mg / ml氨苄青霉素（10 ml）
将1 g氨苄西林溶于8 ml Milli-Q水中，并用Milli-Q水稀释至10 ml
用0.22μm注射器过滤器灭菌
将1毫升液体分配到1.5毫升离心管中并储存在-20 °C
1 M IPTG（10毫升）
将2.383 g IPTG溶于8 ml Milli-Q水中，并用Milli-Q水稀释至10 ml
用0.22μm注射器过滤器灭菌
将1毫升液体分配到1.5毫升离心管中并储存在-20 °C
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（1升）
将121.14 g Tris溶于800 ml Milli-Q水中
用浓盐酸调节pH值至7.5，并用Milli-Q水调节至1 L
过滤消毒
1 M HEPES-NaOH（pH 7.5）（1升）
将238.30克HEPES碱溶于800毫升Milli-Q水中
用10 M NaOH将pH调节至7.5，并用Milli-Q水调节至1 L
过滤器通过0.2μm一次性瓶顶过滤器灭菌
储存在4°C
5 M氯化钠（1升）
将292.2 g NaCl溶于700 ml Milli-Q水中，并用Milli-Q水稀释至1 L
通过过滤器灭菌并在室温下储存
50％甘油（1升）
混合500毫升甘油和500毫升Milli-Q水
2 M咪唑（pH 7.5）（50毫升）
将6.808克咪唑溶于40毫升Milli-Q水中
将pH调节至7.5，并用Milli-Q水调节至50 ml
通过过滤器灭菌并在室温下储存
1 M MgCl 2 （100毫升）
将20.33 g MgCl 2 · 6H 2 O溶于80 ml Milli-Q水中，并用Milli-Q水稀释至100 ml
通过过滤器灭菌并在室温下储存
0.5 M EDTA（pH 8）（50毫升）
将9.306 g EDTA ·2 H 2 O溶解在40 ml Milli-Q水中
用NaOH将pH调节至8.0，并用Milli-Q水稀释至50 ml
通过过滤器灭菌并在室温下储存
10 M NaOH（50毫升）
在连续搅拌的同时，向40 ml Milli-Q水中缓慢添加20 g氢氧化钠
将Milli-Q水稀释至50毫升
100x PMSF（50毫升）
将0.87克溶解于40毫升异丙醇中，并用异丙醇稀释至50毫升
将1毫升液体分配到1.5毫升离心管中并储存在-20°C
10x运行缓冲液（1 L ）
将30.2 g Tris碱，144.0 g甘氨酸和10.0 g SDS溶于1 L Milli-Q水中
缓冲液的pH应为8.3，无需调节pH
储存在室温下，使用前稀释至1倍
5倍加载缓冲液（10毫升）
溶解25 mg溴百里酚蓝，1 g SDS，2 ml 2 M Tris-HCl pH 6.8、5 ml甘油和0.5 ml BME，并用Milli-Q水稀释至10 ml
将1毫升液体分配到1.5毫升离心管中并储存在-20 °C
考马斯亮蓝染色液（1 L）
在一个1 L的玻璃瓶中，加入1 g考马斯亮蓝R250、400 ml乙醇并混合溶解
加入100毫升冰醋酸的500毫升Milli-Q水，并混合WEL升
存放在RT
考马斯亮蓝脱色溶液（1 L）
混合300毫升乙醇，100毫升乙酸和600毫升Milli-Q水
存放在RT
裂解缓冲液（50毫升）
体积最终浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.5）2.5 ml 50毫米
5 M氯化钠4 ml 400 mM
1 M氯化镁2 100μl2 mM
50％甘油10毫升10％（v / v）
2M咪唑（pH 7.5）250μl10 mM
100x PMSF 500微升1x
Milli-Q水32.65毫升
洗涤缓冲液（500毫升）
体积最终浓度
5 M氯化钠40 ml 400 mM
1 M氯化镁2 1毫升2毫米
50％甘油100毫升10％（v / v）
2 M咪唑（pH 7.5）2.5 ml 10 mM
Milli-Q水356.5毫升
洗脱缓冲液（50毫升）
体积最终浓度
5 M氯化钠3 ml 300 mM
1 M氯化镁2 100μl2 mM
50％甘油10毫升10％
2M咪唑（pH 7.5）7.5 ml 300 mM
Milli-Q水29.4毫升
库存缓冲液（100毫升）
体积最终浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.5）2 ml 20毫米
5 M氯化钠2 ml 100 mM
1 M氯化镁2 200μl2 mM
50％甘油20毫升10％
Milli-Q水75.8毫升
芒-GDP交换缓冲液（50 ml）
体积最终浓度
1 M HEPES-NaOH（pH 7.5）2 ml 40毫米
5 M氯化钠2 ml 200 mM
的1M的MgCl 2加入250μl的5mM
Milli-Q水45.75毫升

参考文献

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