材料和试剂
1. P ipette提示
2. 90毫米培养皿（Thermo Fisher Scientific ，目录号：101R20）
3. 1.5 ml和0.5 ml Eppendorf安全锁微量离心管
4. TLC硅胶60板（默克）
5.过滤纸
6.铅笔
7. 3-4周龄的拟南芥植物
8. 14 C-乙酸盐（美国放射性标记化学品，目录号：ARC 0101D-1 mCi ）
9.双蒸馏水（ddH 2 O）
10. MES（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
11. MS盐（半人马座，目录号：LSP03-50LT）
12.氯化钾（KCl ）（Sigma-Aldrich，目录号： P9333）
13.氯仿（Thermo Fisher Scientific，目录号：C607）
14.甲醇（VWR Chemicals ，目录号：BDH1135-4LG ）
15.乙酸（Macron，目录号：MK-8817-500）
16.丙酮（Macron，目录号：MK244310 ）
17.甲苯（VWR Chemicals ，目录号：BDH1151-4LG ）
18.己烷（VWR Chemicals，目录号：BDH1129-4LG ）
19.乙醚（Macron，目录号：MK085010 ）
20. （NH 4 ）2 SO 4 （Mallinckrodt Chemicals，目录号：3512-12）
21.氮气
22.闪烁液（Perk inElmer，目录号：6013199）
23. Tween - 20 （Sigma-Aldrich ，CAS号：9005-64-5）
24. H 3 PO 4 （Sigma-Aldrich ，CAS号：7664-38-2）
25.标签介质（请参见食谱）
26.脂质提取溶液（请参阅食谱）
27. KCl溶液（请参阅食谱）
28.显影溶剂1 （请参见配方）
29.显影溶剂2 （请参见配方）

设备

1.移液器
2.分析天平（Mettler Toledo，型号：AE100）
3.摇床（Bellco Biotechnology，型号：7644-10115 ）
4. Vortexer （ Denville Scientific，型号：S7030）
5.通风柜
6.氮气蒸发器（Thermo Fisher Scientific，型号：TS-18825）
7.烤箱（Thermo Fisher Scientific，型号：13-247-650G）
8.个人安全设备：实验室外套，丁腈手套和护目镜
9.软木钻
10. TLC显影槽
11.剪刀
12.测量仪（Ludlum Measurements，型号：Model 3）
13.放射自显影暗盒（FUJIFILM，型号：BAS 2040）
14.荧光屏（FUJIFILM，型号：BAS-SR-2040）
15.闪烁分析仪（PerkinElmer，型号：Tri-Carb 2900TR）
16.台风FLA 7000生物分子成像仪（GE Healthcare）
17. -80 °C和-20 °C冰箱
18. C离心机（Eppendorf ，型号：5425 ）
软件

ImageQuant5.2（GE Healthcare）

程序

放射性标记（脉冲）
倾10毫升标记mediu米到皮氏培养皿。切开完全展开的莲座丛叶，然后使用软木钻（直径约8毫米或更小，取决于来源叶片的大小）来准备叶盘。浮40-50叶盘与背轴面朝下的标记上在介质的Petri培养皿。
将培养皿放在转子上（50 rpm / s），向标签介质中添加0.1 mCi的14 C-乙酸盐以在室温下开始标签（22-25℃下）80μ的光强度下摩尔米-2小号-1 。
用放射性示踪剂（脉冲）孵育1小时后，除去标记培养基，然后向培养皿中加入15 ml ddH 2 O ，以洗涤旋转器上的叶盘3-4次，每次5分钟。
注意：如果需要，可以重复使用带有14 C-乙酸盐的标记介质。如果要重复使用，我们建议在-20 °C下迅速冷冻，并带有适当的标签和同位素储存。
称重1.5毫升Eppendorf安全锁微量离心管。转移叶盘（每个样品6-8个盘）以清除滤纸并将其吸干。将叶盘转移到称重的Eppendorf管中，然后再次称重。计算叶盘的新鲜重量（FW）。将其余的叶盘在无同位素的标记培养基中与脉冲描述的相同条件下孵育，然后用于追逐（步骤B）。
从1 h脉冲叶盘中提取脂质：
添加脂质的提取缓冲液与吸移管（700 μ升每100mg FW）到T他的Eppendorf管中与叶盘上面提到的，并通过涡旋混合30分钟。
在提取物中加入1 M KCl缓冲液（0.5体积的提取缓冲液），涡旋并在室温下以12,000 × g离心1分钟。脂质停留在较低的氯仿相中。将氯仿相转移到新的Eppendorf管中，并将其储存在-20 °C以便进一步使用。

追
如前所述，在不同时间点（我们使用1天，2天，3天）收获叶盘并提取脂质。

液体闪烁计数
分装10μl脂质提取物至0.5 ml Eppendorf管中，在通风橱中干燥。加入20微升己烷溶解脂质，然后添加200微升闪烁液，并通过混合涡旋。
通过使用Tri-carb（Perkin-Elmer）的液体闪烁计数来确定与总脂质相关的放射性。

薄层色谱（TLC）和荧光粉成像
TLC板的制备：将20 cm × 20 cm硅胶60（Merck）TLC板浸入0.15 M（NH 4 ）2 SO 4溶液中30 s，风干至少2天。
实验当天，将TLC板在120°C的烤箱中烘烤3小时。
用铅笔在板上划一条直线（距板边缘1厘米）。慢慢地发现60-80 μ升脂质提取物的上使用100线微升下的N缓慢流移液管2在通风橱中。保持脂质斑点的直径小于1厘米。
极性脂质分离
当脂质斑点在通风橱中完全干燥后，将50 ml的显影溶剂1加入可密封的TLC显影槽中，并将TLC板放入样品槽中，并使样品端朝下。密封水箱，让溶剂上升到平板的一半。
取出盘子，在通风橱中完全干燥。从储罐中清除显影溶剂1，然后使该储罐在通风橱中完全干燥。
neu的二尖瓣脂质分离：
P我们50米升将显影溶剂2倒入槽中，将TLC板放回槽中，样品端朝下。
当显影溶剂2的前端距离印版顶部1厘米时，取出印版并在通风橱中完全干燥。
注意：这里我们使用两相薄层色谱分离极性脂质和中性脂质。然而，极性脂质和中性脂质可以是小号使用由两个单独的TLC板eparated展开溶剂1和显影溶剂2，分别。
荧光粉成像
用Saran包装纸包裹TLC板。将其朝上放置在放射自显影胶片盒中，二氧化硅面朝上，用磷光屏盖住它，然后关闭胶片盒。
放置盒在-80 ℃下冷冻1-2天取出的荧光屏之前捕获的荧光成像用台风FLA 7000成像仪（GE Healthcare）。
通过ImageQuant软件量化与各个波段相关的相对放射性。

d ATA分析

Typ hoon FLA 7000成像仪捕获的荧光粉成像如图1A所示。与相关联的标签monogalactosyldiacylglycerol （MGDG）和三酰基甘油（在不同的时间点TAG）示于Figu重新小号1B分别和1C。与单个脂质带相关的相对放射性通过ImageQuant软件进行定量。通过液体闪烁计数确定标记1 h和追踪3 d后与总脂肪酸相关的放射性。的脂肪酸合成和降解速率列于网络连接古尔小号1分别d和1E。

图1.通过脉冲追踪14 C-乙酸酯标记进行合成和降解的分析。一。脂质的磷光体成像。公元前。在放射过程中3 MGDG和TAG相关的变化- d追逐。d 。不同品系叶片中14 C-乙酸酯掺入总脂肪酸的比率。Ë 。与14 C-醋酸盐孵育1小时后的3 d追踪中，放射性标记丢失。数据是三个独立实验的平均值± SD 。TAG：三酰基甘油；MGDG：单半乳糖基二酰基甘油；PG：磷脂酰甘油；DGDG：二半乳糖基二酰基甘油；PE：磷脂酰乙醇胺；PI / SL：磷脂酰肌醇/磺基喹喔基二酰基甘油；PC：磷脂酰胆碱。

菜谱

标记介质
20 mM MES，pH 5.5
ø MS盐的NE-第十强度
0.01％吐温20
脂质提取液
甲醇/氯仿/甲酸= 2/1 / 0.1
氯化钾溶液
1 M氯化钾
0.2 MH 3 PO 4
显影溶剂1
丙酮/甲苯/ H 2 O = 91/30/8
显影溶剂2
己烷/二乙醚/乙酸= 70/30/1

致谢

我们感谢美国能源部科学办公室，基础能源科学办公室（DE-SC0012704）的财政支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

艾伦（Allen，DK），贝茨（Bates），PD和Tjellstrom，H.（2015）。通过同位素标记和通量分析跟踪植物脂质生产的代谢脉搏：过去，现在和将来。Prog Lipid Res 58：97-120。
范建勋，于良和徐成（2019）。自噬在拟南芥脂质代谢中的双重作用。植物细胞31（7）：1598-1613。
Yu，L.，Fan J.，Yan C.和Xu C.（2018）。淀粉缺乏症可增强叶片的脂质生物合成和周转率。植物生理学178（1）：118-129。