材料和试剂
从全血中获取人PBMC
Leucosep管，50米升（格雷纳生物ø NE，目录号：227290）
2毫升Cryovial（Starstedt，目录号：72.694.006）
来自健康供体或患者的总外周血（〜25 ml）。通常，每1毫升血液中含有1 × 10 6个PBMC。
Ficoll-Paque TM Plus（GE H ealthcare，目录号：17-1440-03）
胎牛血清（FBS，Gibco，目录号：10270-106）
关键：使用前在56 °C加热灭活1小时。

20％二甲基亚砜（DMSO，Sigma - Aldrich，目录号：D2650-100ML）
注意：DMSO是有毒产品，应小心处理并丢弃。

含L-谷氨酰胺（Lonza，目录编号：BE12-702F）的RPMI 1640培养基，添加5％（vol / vol）胎牛血清（Gibco，目录编号：10270-106）（请参见食谱）
含80％FBS的冷冻培养基（Gibco，目录号：10270-106）（请参阅食谱）

小鼠器官的收集

10毫升注射器（布劳恩，目录号：4616103V）和25号× ⅝英寸针器（Braun，目录号：4657853）
雄性和雌性8-12周龄的C57BL / 6J小鼠（查尔斯河）
注意：所有动物实验均应遵守国家法律和机构规定。

PBS（Gibco，目录号：14190169）

小鼠器官的制备

100 µm尼龙滤网（Corning，目录号：352360）
2 ml注射器（BD Biosciences，目录号：307727）
Nunc细胞培养/培养皿（Thermo Scientific ，目录号：1533066）
RPMI 1640培养基，Glutamax TM补充剂（Gibco，目录号：61870036）包含2％（vol / vol）FBS（摩Cap座，目录号：FBS-12A）（请参阅食谱）
关键：使用前在56 °C加热灭活1小时。

单细胞悬浮/直接固定的体外刺激，用于离体（基础）测量

96孔板（U型，310微升/瓦特，格雷纳生物ö NE，目录号：650201）
eBioscience FoxP3 /转录因子染色试剂盒（Invitrogen，目录号：00-5523-00），其中包含：
固定和通透浓缩物
注意：本产品包含有毒和致突变性的多聚甲醛（PFA）。应小心处理，并作为危险废物丢弃。

冲淡
10 ×洗涤缓冲液（在去离子水中稀释10倍）
BCR信号传导和共受体参与的刺激，请参见表1 。
注意：叠氮化钠有剧毒，对环境具有危险。应小心处理，并作为危险废物丢弃。

表1.刺激人和鼠B细胞的BCR和共受体配体

刺激物

工作浓度

制造商

猫。没有。

人的

山羊F（ab'）2抗人IgM-UNLB

20微克/立方米升

南方生物技术

2022-01

重组人CD40L

2微克/立方米升

研发部

6245-CL / CF

重组人IL-4蛋白

250毫微克/米升

研发部

204-IL-CF

鼠

AffiniPure F（ab'）2片段山羊抗小鼠IgM

25 μ克/米升

杰克逊免疫研究

115-006-075

纯化的大鼠抗小鼠CD40（克隆3/23）

4 μ克/米升

BD生物科学

553787

脂多糖（LPS）E. Ç OLI 026：B6

400毫微克/米升

西格玛-奥德里奇

L8274

流式细胞仪程序

插入管（格雷纳生物ø NE，目录号：102280）和5米升圆底聚苯乙烯试管中（Corning，目录号：352052）
UltraComp eBeads TM补偿珠（Invitrogen，目录号：01-2222-42）
来自eBioscience FoxP3 /转录因子染色试剂盒（Invitrogen）的10 ×洗涤缓冲液（在去离子水中稀释10倍）
FcR阻断剂（Human TruStain FcX，Biolegend，目录号：422302）
表2（磷酸化蛋白特异性抗体）和表3（用于准确鉴定B细胞亚群的抗体）中列出了用于流式细胞术的抗体。对于小鼠的研究，另一个2.4G2抗体是利用d自己生产。
注意：叠氮化钠是剧毒的（如上所述）。

含有0.5％（vol / vol）牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich，目录号：A8327）和2 mM乙二胺四乙酸溶液（EDTA，Sigma-Aldrich，目录号：03690）的MACS缓冲液（参见配方）

表2.用于分析人和小鼠B细胞的磷酸化特异性抗体以及刺激时机和抗体稀释的方向

抗体

共轭

克隆

制造商

猫。没有。

检测人

单克隆抗体稀释人

检测鼠标

mAb稀释鼠

pAKT（S473）

--

D9E

细胞信号技术

4060升

30-60分钟

100倍

180分钟

100倍

pAKT（T308）

--

D25E6

细胞信号技术

13038升

30-60分钟

50倍

180分钟

100倍

pBTK / pITK（Y223 / Y180）

Alexa Fluor 647

N35-86

蓝光

564846

5分钟

3000倍

5分钟

3000倍

pCD79a（Y182）

Alexa Fluor 647

D1B9

细胞信号技术

29742S

1分钟

50倍

5分钟

50倍

pERK1 / 2（T202 / Y204）

聚乙烯

20A

蓝光

561991

5分钟

8倍

5分钟

8倍

pPI3K p85（Y458 ）

--

E3UI1H

细胞信号技术

17366S

1分钟

100倍

3分钟

200倍

PPLC γ 2（Y759）

Alexa Fluor 647

K86-689.37

蓝光

558498

5分钟

8倍

5分钟

8倍

pS6（S240 / 244）

--

D68F8

细胞信号技术

5364

30-60分钟

200倍

180分钟

200倍

pSHP-1（Y564）

--

D11G5

细胞信号技术

8849S

1分钟

100倍

3分钟

500倍

pSLP-65（Y84）

聚乙烯

J117-1278

蓝光

558442

2分钟

8倍

5分钟

8倍

pSrc（Y418 / Y424）

--

EP503Y

Abcam

Ab40660

1-3分钟

200倍

5分钟

500倍

pSrc（Y507）

--

5B6

Abwiz Bio

2461S

1-3分钟

500倍

5分钟

1500倍

pSYK（348）

聚乙烯

I120-722

蓝光

558529

2分钟

8倍

5分钟

8倍

表3.用于精确控制B细胞亚群的抗体

抗体

共轭

克隆

制造商

猫。没有。

单克隆抗体稀释

人的

CD3

Alexa Fluor 700

UCHT1

英杰

56-0038-42

200倍

CD19

FITC

HIB19

BD生物科学

555412

15倍

CD27

BV421

M-T271

BD生物科学

562513

10倍

CD38

BV785

HIT2

生物传奇

303530

15倍

抗体

BV605

IA6-2

BD生物科学

563313

400倍

鼠

B220

AF700

RA3-6B2

英杰

56-0452-82

200倍

CD21 / CD35

FITC

eBio4E3

英杰

11-0212-85

100倍

CD23

生物素

B3B4

BD生物科学

553137

400倍

CD3

BV421

145-2C11

BD生物科学

562600

400倍

抗体

BV711

11-26c.2a

BD生物科学

564275

2000倍

免疫球蛋白

PE-Cy7

II / 41

BD生物科学

25-5790-82

400倍

人与鼠

固定染料

eFluor 506

呐

英杰

65-0866-14

200倍

链霉亲和素

APC-eFluor 780

呐

英杰

47-4317-82

200倍

链霉亲和素

BV786

呐

BD生物科学

563858

200倍

版权所有©20 21作者；保留所有权利。独家被许可人生物协议有限责任公司。1个

说明：logonew
设备

标准实验室材料或设备，例如移液器，试管和吸头
适用于牺牲小鼠和采集器官的工具，包括：剪刀，镊子和70％的乙醇
研钵和研杵
秒表或计时器
水浴培养箱和/或CO 2培养箱
具有TX-1000旋斗转子（Thermo Scientific，目录号：75003017）的Multifuge x 3R冷冻离心机（Thermo Scientific，目录号：75004515）。
LSR II流式细胞仪（BD Biosciences，目录号：BD LSR-II），配有红色，蓝色和紫色激光
流量柜
4℃ ˚F脊
-80 °C冷冻室

软件

通过FACSDiva TM软件（BD Biosciences）获取数据
FlowJo软件（BD Biosciences）来分析数据

程序

样品采集
从全血中获取人PBMC（时间：60分钟）

Ñ OTE ：步骤PS 1〜6中使用流柜的无菌环境中进行。

向Leucosep管中加入15 ml的Ficoll，然后在室温（RT）下以1,000 × g的转速旋转1分钟。
每个Leucosep管轻柔地加入最多25 ml全血。
严重：确保Ficoll处于试管中的过滤器下方，并且血液不会与Ficoll混合。

在室温下，以1,000 × g的速度旋转含有全血和Ficoll的Leucosep管，持续10分钟。关键：将减速度设置得尽可能低，以保持PBMC层的Ficoll梯度分离完好无损。
将外周血单核细胞（PBMC），Ficoll和血浆的全部溶液转移到装有15 ml RPMI 1640的5％FBS的50 ml管中。
关键：过滤器下方的红细胞部分应保留在Leucosep管中。

在4下以500 × g的转速旋转50 ml试管7分钟 ℃。然后，除去上清液，并重悬于1-5 ml的冷（4 °C）RPMI-2％FBS中。
可选：对新鲜的PBMC（非冷冻样品）进行磷流处理时，请继续执行步骤9 。

使用标准程序（手动或自动）对细胞进行计数，并通过将冷冻培养基以1：1的比例添加到保存细胞的体积中，每个小瓶不超过50 × 10 6个活细胞。将0.5ml冷冻培养基的0.5毫升含培养基的20 × 10 6 - 50 × 10 6细胞。将细胞转移到适合冷冻的2 ml冷冻管中，并以每分钟1 °C的速度立即冷冻小瓶。
关键：由于DMSO对细胞有害，因此在摇动试管的同时，将冷冻培养基缓慢加入5％FPI的RMPI细胞中。
暂停点：细胞可以在-80 °C下保持数周，或在液氮中保持数年。注意：DMSO是有毒产品，应小心处理并丢弃。

使用37 °C水浴将含有冷冻PBMC的样品瓶解冻。达到液相后，立即将细胞转移到15 ml试管中，然后缓慢加入10 ml冷（4 °C）RPMI-5％FBS，同时轻轻摇动试管。
关键：解冻过程中达到液相时应立即发生这种转移，因为DMSO对细胞有害。

在4 °C下以400 × g旋转7分钟。然后，除去上清液，然后将沉淀重悬于1 ml的冷（4 °C）RPMI 2％FBS中。
计数细胞，和板5 × 10 5的50的体积内每孔的细胞在96孔圆底板微升为phosphoflow RPMI 2％FBS。
暂停点：在进行步骤B1的磷酸流操作之前，可以将细胞在4 °C下保持1-2 h 。

收集小鼠器官（时间：每只小鼠15分钟）

颈脱位法处死小鼠。该协议允许其他不影响目标器官解剖区域的牺牲方法，包括涉及麻醉剂的方法。
腹膜灌洗。在腹部上做一个中线切口，以使皮肤缩回，保持腹部完整。的10ml注射器，含有5ml冰冷的PBS和5ml空气，被附接到25号× ⅝英寸针头。腹膜随后通过洗涤gentl ÿ冲洗并在完全注射1分钟摇动。之后，通过用10 ml注射器抽吸腹腔收集腹腔灌洗液。灌洗液收集在15毫升试管中，并置于冰上进行进一步处理。
脾。可以打开腹膜腔以小心地取出脾脏。脾脏位于腹部的左侧腹，可以用镊子拔出。
其他器官。Ñ分机，淋巴集结可以使用弯曲顶端镊子小肠中分离。最后，通过两次切开骨盆骨和使膝盖脱位来抽出股骨。先前已描述了其他各种解剖隔室的收获，包括支气管肺泡灌洗（BAL），肺和淋巴结肿大（Li等，2017）。将所有器官置于冰冷的PBS中进行进一步处理。

制备各种鼠类器官的单细胞悬液（时间：每只小鼠15分钟）

使用50 ml管上的100μm细胞过滤器和2 ml注射器的柱塞机械破坏脾脏组织。在脾脏处理过程中和之后，用5 ml RPMI 1640 Glutamax TM冲洗过滤器，并补充2％（vol / vol）FBS（RMPI-2％FBS）以获取所有细胞。淋巴集结以类似的方式进行处理，使用100 μ米细胞过滤器和皮氏培养皿。用最大200μl的RMPI-2％FBS冲洗过滤器，以获取所有细胞。
CRITICAL：立即把管在冰上或代替它们在冰箱在4单细胞悬浮液回是很重要℃下处理之后。

用研钵和研棒处理股骨，压碎骨头，并在3 ml RMPI-2％FBS中获得骨髓细胞。骨髓细胞悬液通过50毫升试管上的100微米细胞过滤器转移，以确保没有骨部分的单细胞溶液。将骨髓细胞悬液保存在冰上，以备后用。
将腹膜灌洗细胞在4 °C下以400 × g离心7分钟，并弃去上清液。将腹膜灌洗细胞沉淀重悬于1 ml的RMPI-2％FBS中，并保存在冰上以备后用。
从所有器官中采集细胞计数样品，以确定每个样品中的确切细胞数量。
至关重要：要测量离体的基础磷酸化水平，将细胞保持在冰上，无需任何刺激。立即进入步骤C1 。

暂停点：在进行磷流方案之前，可以将细胞在4 °C保持1-2小时。

体外单细胞悬液的刺激（时间：30分钟- 6小时）
刺激和细胞的染色在96孔圆底平板中进行，使用5- × 10 5每孔（200,000 - 1,000,000个细胞在技术上是最优化的）。5 × 10 5细胞每孔中50的体积被转移μ升每孔在冰上，保持单元中的所有时间，在4 ℃下。
如果刺激时间少于1小时，则将96孔圆形底板置于37 °C的水浴中。确保仅孔的底部与水接触。对于长于1 h的刺激时间，在细胞在冰上的同时添加刺激，然后在37 °C和5％CO 2下孵育。原始论文（Rip et al。，2020）和表2列出了人类和鼠类样品中磷酸靶的最佳刺激时间。
关键：鼠B细胞中的一些磷酸化靶标，主要是下游信号分子，如NF-κB和AKT / S6，可以接受由于单细胞分离而产生的温度变化和机械应力。在刺激之前，将这些样品在37 °C下放置3 h ，最好在CO 2培养箱中放置3 h。这对于优化检测和下游信号读出的灵敏度至关重要。不建议在冷冻的PBMC上对这些靶标进行预孵育，因为与新鲜材料相比，这些细胞的活力较低。

可选：对于包括用BCR信号抑制剂体外处理样品的实验，将细胞悬浮液与BCR信号在37 °C下孵育3小时，以进行有效的预处理。如果发信号目标需要休息，则可以在此休息时间内进行预处理。

在水浴中刺激细胞时，请等待1-2分钟，使样品达到37 °C 。吹打50添加刺激剂μ升刺激到含50孔μ升样品。未刺激的对照样品补充有50 μ升RMPI-2％FBS作为刺激控制。此外，添加10 μ升RPMI-2％FCS包含可固定的活/死染色存活固定之前10分钟。
关键：由于可固定的活/死活力染色剂对光敏感，在RPMI培养基中并非最佳，因此应重新制备此溶液，并在制备后15分钟内添加到细胞中。

用随附的稀释剂将eBioscience FoxP3固定液和通透缓冲液1：1稀释。当刺激时间结束时，加入100固定细胞μ升在37稀释的固定和透化缓冲液中10分钟℃下。
注意：本产品包含有毒和致突变性的多聚甲醛（PFA）。应小心处理，并作为危险废物丢弃。
注意：随附的固定缓冲液浓度为4倍，并通过等体积混合在稀释液中稀释。将稀释的固定液按等体积加入细胞中，以达到推荐的工作浓度（在RPMI中的100 µl细胞中加入50 µl 4 ×固定缓冲液+ 50 µl稀释剂）。

固定10分钟后，在4 °C下以400 × g离心3分钟。小心除去上清液。
在所有孔中加入200 µl eBioscience洗涤缓冲液进行洗涤，并在4 °C下以400 × g离心3分钟。然后小心除去上清液。执行两次此步骤。进行步骤D1 。
关键：两次清洗对于去除所有固定液和通透性缓冲液至关重要。

暂停点：直接进行染色以进行流式细胞术或将细胞保持在4 °C的200 µl eBioscience Wash Buffer体积中。这种细胞在4 °C下最多可以保存5天，而不会影响样品的质量。

固定单细胞悬液以进行离体测量（时间：30分钟）
与受刺激的细胞平行，将每孔5 × 10 5个细胞转移到96孔圆形底板中，每孔100μl的体积放在冰上，使细胞始终保持在4 °C 。
批判：该程序必须始终在4 °C下进行，因为这是对离体激活的一种读出，温度变化的影响可能很大。

在固定之前，将样品在黑暗中于4 °C下用可固定的活/死生存力染色剂染色10分钟。
关键：由于在RPMI培养基中固定的活/死活力染色并非最佳，因此应重新制备此溶液，并在制备后15分钟内添加到细胞中。

用100 µl稀释的固定液和通透缓冲液在4 °C下固定细胞10分钟。
固定10分钟后，在4 °C下以400 × g离心3分钟。小心除去上清液。
在所有孔中加入200 µl eBioscience洗涤缓冲液进行洗涤，并在4 °C下以400 × g离心3分钟。然后小心除去上清液。执行两次此步骤。
关键：两次清洗对于去除所有固定液和透化缓冲液至关重要。

暂停点：直接前进到染色用于流式细胞术或使细胞保持在200的体积微升eBioscience的洗涤缓冲液，在4 ℃下。这种细胞在4 °C下最多可以保存5天，而不会影响样品的质量。

流式细胞仪程序（时间：1-2小时）
在步骤B6或步骤C5进行最后一次清洗后，去除上清液，并可以添加染色混合物。细胞与40 μ升组合，以用于细胞表面标记，如CD3，B220 / CD19，IgD和IgM抗体eBioscience的洗涤缓冲液胞内染色。将FcR阻断剂添加到染色混合物中，以避免抗体的非特异性结合。将细胞在黑暗中于4 °C孵育30分钟。
注意：叠氮化钠有剧毒，对环境有害。应小心处理，并作为危险废物丢弃。

关键：小心地将沉淀重悬于40μl混合物中，确保所有细胞均处于悬浮状态。

注意：也可以在黑暗中于室温（RT，〜20 °C ）下进行15分钟的染色。

样品通过加入200洗涤微升在400 eBioscience的洗涤缓冲液到所有孔中，并离心×克在4 3分钟℃下。然后小心除去上清液。
将样品与40μl含所选磷酸目标抗体的eBioscience Wash Buffer在黑暗中于室温孵育30分钟。
可选：如果磷酸化目标抗体已被缀合物标记，则在孵育时间结束后继续执行步骤D6。

样品通过加入200洗涤微升在400 eBioscience的洗涤缓冲液到所有孔中，并离心×克在4 3分钟℃下。然后小心除去上清液。
当磷蛋白涉及未结合的兔衍生抗体时，与驴抗兔PE结合抗体在黑暗中于室温孵育15分钟。
样品用MACS缓冲液（PBS中的0.5％BSA和2 mM EDTA）洗涤，并在4 °C下以400 × g离心3分钟。除去上清液并重新悬浮于50微升MACS缓冲液。将样品转移到插入管中，并在1天内使用流式细胞仪进行测量。
在测量之前，通过补偿在磷酸染色中使用的所有结合物来校准LSR-II。优选使用与染色混合物中使用的抗体相同的抗体，并根据制造商的说明将其添加到UltraComp eBeads（Invitrogen）中，以校准流式细胞仪。
获取足够数量的细胞以执行B细胞亚群分析。这意味着每个样品采集20,000-50,000个B细胞就足够了。
关键：由于固定和通透性方案，与非固定细胞相比，细胞大小将减小。相应地增加前向散射区（FSC-A）的电压。

使用FlowJo v9或v10软件执行分析。

数据分析

在该协议手稿中，我们包括原始论文中描述的靶标（Rip等，2020），并提供了对我们最近建立的其他几个磷酸化靶标进行分析的指导。

对于每个目标，至关重要的是首先找到最佳刺激并确定最佳刺激时间。表2提供了有关原始论文中提到的BCR信号分子的最佳刺激时间的指导（Rip等，2020），以及小鼠和男性中的其他磷酸化靶标。在优化子集和磷酸化目标染色过程中，应通过包括同种型和荧光减一（FMO）对照来验证所有抗体，从而验证信号强度。用流式细胞仪采集细胞后，可以在必要时使用FlowJo 10软件程序检查和调整补偿。
作为数据分析示例，图1概述了未受抗IgM F（ab'）2片段或重组CD40L刺激或刺激的人PBMC组分在B细胞中各种BCR信号分子的磷酸化状态分析。在对B细胞亚群进行门控之前，我们首先选择了活的单个淋巴细胞，然后用pan-B细胞标记CD19鉴定B细胞（图1A）。我们在染色包括CD3，使B细胞CD19的精确门+ CD3 -细胞。此外，由于T细胞对抗IgM刺激无反应，因此CD19 - CD3 + T细胞级分可以用作BCR信号分子磷酸化分析的有用阴性对照。在活的CD19 + B细胞中，过渡性B细胞和成浆细胞的群体分别被鉴定为CD27 - CD38 +和CD27 + CD38 +细胞。B细胞与低CD38表达随后被分成娜我已经CD27 - IGD + B细胞和CD27 + IGD -记忆B细胞（图1A ）。

下一步，在门控B细胞亚群中分析BCR信号分子的磷酸化。例如，我们筛选了CD27 - IgD +幼稚B细胞，并分析了PLCγ2（Y759）的磷酸化。对于该分析，毗邻FMO或同种型对照，门控的T细胞用作阴性染色对照，因为PLC γ 2没有在T细胞中表达。直方图overla在图1B YS表明，在p幼稚B细胞的PLCγ2荧光信号在抗IgM刺激强烈增加，未刺激相比NA我已经B细胞。值得注意的是，未刺激的细胞通常显示出低水平但可检测到的各种BCR信号蛋白的离体磷酸化。磷酸化信号通过几何平均荧光强度（g MFI）值进行量化，因为在pPLCγ2的情况下，我们观察到了刺激诱导的单个峰强度变化（图1B）。相反，当观察到双峰分布时，磷酸化通过计算阳性细胞的比例来量化（例如，核糖体蛋白S6的磷酸化（图1C）。我们通常还包括一条垂直线作为参考，该垂直线设置为（i）在当刺激导致单个峰的强度移动时，未刺激对照计数的最大峰值;或（ii）指示背景信号，当刺激增加双峰染色分布中阳性细胞的数量时（如pS6）。

其他示例包括分析CD79a和核糖体蛋白S6（AKT信号通路的下游靶标）的总CD19 + B细胞的磷酸化水平（图1C ）。最后，我们显示了磷酸化目标的直方图叠加图，Rip等人以前没有对此进行过描述。（2020 ），包括激活的Y418（在小鼠B细胞中为Y424）和对Src家族激酶，PI3K p85亚基（Y458）和具有Src同源区域2域的磷酸酶-1（SHP-1； Y564）的抑制性Y507。（图1D）。

图1. PBMC衍生的B细胞中BCR分子的磷酸化。A.外周血单核细胞（PBMC）部分中活单淋巴细胞的门控策略。在淋巴细胞，我们门控CD19 +细胞（CD19 + CD3 - ）。过渡B细胞（反式）和浆（PB）的排除后，我们门控幼稚B细胞（CD19 + CD38 - IGD + CD27 - ）和IgD阴性的记忆B细胞（CD19 + CD38 - IGD - CD27 + ）。乙。抗IgM刺激5分钟后，幼稚B细胞中pPLCγ2的直方图叠加图。Ç 。抗IgM或重组人CD40配体（CD40L）和IL-4刺激30分钟后pS6的直方图叠加图，总CD19 + B细胞中抗IgM 1分钟后的pCD79a的直方图叠加图。d 。抗IgM刺激1分钟后的pSRC-Y418和抗IgM刺激3分钟后的pSRC-Y507，pPI3K p85和pSHP-1的总CD19 + B细胞的直方图叠加图。将直方图中的竖线设置在未刺激的控件上作为刺激的参考，从而指示通过几何平均荧光强度（g MFI）进行的定量。仅对于显示双峰分布的核糖体蛋白S6，通过计算阳性细胞的比例（C）定量磷酸化。图代表2-10个独立实验的代表性直方图，每组每个实验有2-20个健康供体。

在图2中，我们提供了一些先前经过验证的平行磷酸分析（Rip等，2020）和鼠B细胞的新型靶标。我们通过门控活B220选择活脾B细胞+细胞，并随后为NA我已经通过IgD和IgM的雷杰普B细胞TOR表达（图2A ）。内娜我已经B细胞，我们选通滤泡和边缘区（MZ）B细胞，使用CD21和CD23（图2A ）。抗IgM刺激后，卵泡B细胞中PLCγ2的磷酸化增加了约2.5倍（图2B ）。同样地，以下的CD79A健壮磷酸化抗IgM刺激和S6的下列抗IgM，抗CD40或脂多糖（LPS）刺激检测NA我已经B细胞（图2C ）。在抗IgM刺激后，另外的BCR靶标也显示了响应性，对于pSrc激酶（对于Y424和Y507而言）在5分钟时，对于pPI3K p85和pSHP-1在1分钟时具有最佳信号（图2D ）。

图2.脾脏鼠B细胞中BCR分子的磷酸化。A.活的单个脾淋巴细胞的门控策略。在淋巴细胞，我们选通脾B220 +细胞（B220 + CD3 - ）。纯化后为NA我已经使用IgD和IgM的B细胞，我们门控边缘区（MZ）的B细胞（B220 + CD21 + CD23 - ）和滤泡（FOL）的B细胞（B220 + CD21-CD23 + ）。B. Fol B细胞中抗IgM刺激5分钟后pPLCγ2的直方图叠加图。C.抗IgM刺激5分钟后pCD79的直方图叠加图或抗IgM，抗CD40或脂多糖（LPS）刺激3小时后pS6的直方图叠加图。D.抗IgM刺激5分钟后，pSrc-Y424和pSrc-pY507以及pPI3K p85和SHP-1的总幼稚B细胞的直方图叠加图。将直方图中的竖线设置在未刺激的控件上作为刺激的参考，从而指示通过几何平均荧光强度（g MFI）进行的定量。仅对于显示双峰分布的核糖体蛋白S6，通过计算阳性细胞的比例（C）定量磷酸化。图代表> 3个独立实验的代表性直方图，每组各有5只小鼠；野生型小鼠为8-12周大。

笔记

定时为其他信令蛋白的磷酸化是在我们的最初的纸（图1-3和图S2的示意性概述）呈现（翻录等人，2020）。
不需要执行多个洗涤步骤，因为在单个或多个洗涤步骤的步骤之间我们没有发现染色质量的差异。因此，除非方法部分中另有说明，否则单步洗涤就足够了。
针对RPMI1640培养基开发并验证了phosphorflow方案。我们没有研究其他类型的培养基或补充剂（例如HEPES或2-巯基乙醇）的作用。
的在数据中示出的先前验证和额外的目标稀释和定时一个nalysis被包括在表2中。请注意，人和鼠样品之间的mAb稀释和磷酸化抗体的时间安排可能会有所不同。
STAT蛋白和读出为磷酸化的NF- κ乙小号应该使用其它协议如在我们的最初的纸（图中提到执行ignaling途径，小号2-3和图S1）（翻录等人，2020）。
在新鲜获得的鼠B细胞的下游信号传导途径中，由于单个细胞的分离，它们可以接受温度变化和机械应力。刺激前，最好将其置于37 °C的CO 2培养箱中。我们建议将样品静置3 h，因为这对于优化检测和下游信号读数的灵敏度至关重要。
不建议在冷冻的PBMC上预孵育下游信号，因为这会严重影响生存能力。在衍生自鼠类组织的冷冻脾悬液中，我们没有遇到这种生存能力的问题。

菜谱

解决方案未过滤；培养基，血清和缓冲液是无菌的，使用前将胎牛血清（FBS）在56 °C加热灭活1小时。

冷冻介质
80％胎牛血清

20％二甲基亚砜

RPMI-2％FCS
RMPI 1640

2％胎牛血清

RPMI-5％FBS
RPMI 1640

5％胎牛血清

MACS缓冲区
磷酸盐缓冲溶液

0.5％牛血清白蛋白

2 mM乙二胺四乙酸溶液

致谢

这些研究得到了荷兰癌症协会（KWF赠款2014-6564）和Target-to-B的部分支持，两者均授予RW Hendriks，以及AcertaPharma BV Oss的无限制赠款。

我们要感谢Allard Kaptein（AcertaPharma BV，奥斯），Stefan Neys和Marjolein de Bruijn（伊拉斯姆斯MC鹿特丹）以及EDC伊拉斯姆斯MC动物设施提供的巨大技术援助。

作者贡献

JR设计了研究，进行了实验，分析了数据并撰写了手稿。OC和RH为研究设计和手稿的撰写做出了贡献，并对研究进行了监督。所有合著者都批准了最终稿。

竞争我nterests

作者宣称没有经济利益冲突。

伦理

PBMC来自健康志愿者（荷兰鹿特丹中心）。实验程序已由Erasmus MC的道德委员会批准。
在进行动物实验之前，所有实验方案均由Erasmus MC动物实验委员会（DEC）和动物实验中央委员会（CCD）审查并批准，批准ID为AVD1010020173764 。CCD的批准有效期至2023年6月1日。

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