材料和试剂
1.方盘120 × 120 × 17 mm（Greiner Bio-One GmbH，目录号：688102）
2.带盖的平底6孔，12孔和24孔板（Stemcell Technology，目录号：100-0096）
3.胶粘剂或任何可用的胶带
4. 2毫升Eppendorf管
5. 15或50 ml的猎鹰管（Stemcell Technology，目录号：38010，100-0090; 38009，100-0092）
6.铝箔
7.封口膜“ M”（默克，目录号：P7543-1EA）
8. SuperFrost显微镜载玻片（Thermo Scientific，目录号：12362098 ）
9. Coverslips（Thermo Scientific，目录号：12393138）
注意：协议所需的材料如图1所示。

10.夹室玻璃盖（VWR，腔室一体式腔室，Nunc TM Lab-Tek TM ，目录号：734-2056）
11.拟南芥种子
生长条件：在半强度MS琼脂方形平板（45.5 ml）上播种表面灭菌的拟南芥种子。在黑暗中于4°C下将板分层2天，然后在21°C在16小时光照/ 8小时黑暗的光周期下转移至生长室。让幼苗在垂直放置的板上生长5天。

注意：5天大的幼苗是我们实验设置中幼苗的标准年龄。幼苗的年龄可以根据实验进行调整。

12. Milli-Q水（H 2 O）
13.蔗糖（VWR International，目录号：27483.294）
14. Murashige和Skoog基础盐混合物（MS盐）（Duchefa Biochemie，目录号：M0221.0050）
15. 2- [N-吗啉代]乙磺酸（MES）（Duchefa Biochemie，目录号：M1503.0100）
16.琼脂（实验室M，目录号：MC029）
17.氢氧化钾（Merck KGaA，目录号：1.05021.1000）
18.乙醇（EtOH）（Sigma-Aldrich，目录号：32221-2.5L）
19.乳酸（Honeywell，Fluka TM ，目录号：15663630）
20.氟黄088（圣克鲁斯生物技术，目录号：81-37-8）
21.苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：66687-07-8），在MilliQ Water中为0.5％
22.用乙醇对种子进行灭菌（参见食谱）
23.半强度MS培养基（请参见食谱）
24. 0.03％氟黄088溶液（请参阅食谱）
25. 0.5％苯胺蓝溶液（请参见食谱）

图1.所需的材料和设备。A.五天大的拟南芥幼苗。比例尺：1厘米。B.染色样品所需的材料。C.在附有涡流混合器的50ml Falcon管中，将Fluol Yellow 088溶解在乳酸中，并用胶带将其混合。D.溶解的荧光黄（左）和苯胺蓝（右）溶液。

设备

用于种植植物材料的生长室（Percival，CLF，Plant Climatics，AR75-L3）
涡旋混合器（Instrumentfirman Labor a，型号：Vortex-Genie 2）
水浴（Fisher Scientific）
不锈钢软镊子（3B DISSECTION SOFT TWEEZERS ，LABWORLD）
倒置共聚焦显微镜（Zeiss ，型号：LSM880）
注意：执行平铺扫描图像采集实验需要完全电动的X，Y，Z扫描台。

物镜：10 ×或20 × （适用于监视整个标本或根，例如，图3C）。对于更高分辨率的图像，需要更高的放大倍率，例如40 ×或63 × （图3D）
用于GFP和其他荧光报告基因的荧光信号检测系统（Shaner et al。，2007）

软件
共聚焦显微镜操作软件
ImageJ（Abràmoff等，2004）
Microsoft Excel
棱镜（GraphPad）

程序
样品染色
向每个装有2 ml荧光黄088（FY088）的孔中加入15-20株幼苗（例如，根据样品数量，为12孔板）（图2A）。
关闭盖子，并用封口膜密封板。将板放在70°C的铝箔筏上的水浴中20分钟（图2B-2D ）。
注意：弯曲铝箔的边缘以防止下沉。在FY088溶液中孵育期间，请准备0.5％苯胺蓝溶液，并在室温下保持黑暗直至使用。

将幼苗从FY088解决方案转移到一个新的12孔板中，其中装有2 ml水，并在室温下孵育1分钟（图2E）。
通过移液除去水，然后向每个样品中加入2 ml 0.5％的苯胺蓝溶液（图2F）。孵育在20分钟内将在室温下黑暗。
在苯胺蓝温育后，将苗到一个新的- ，12-含2和24孔板- 3毫升水（图2G），孵育在10分钟的黑暗。

图2.样本染色。A.在2 ml FY088溶液中包含拟南芥幼苗的十二孔板。B.用石蜡膜密封的板。C.将密封好的孔板放在铝箔筏上。D.将样品置于70℃的水浴中20分钟。E.将幼苗在2毫升水中洗涤。F.含有2ml苯胺蓝溶液的孔板，带有幼苗。G.在2 ml水中洗涤苯胺蓝。H.准备带有石蜡膜条的显微镜载玻片，以制成“间隔物”。

样品制备/安装
切下两条封口膜，并在显微镜载玻片的两端缠绕2-3次（图2H和3A）。
在两个封口膜条之间的玻片中央添加几滴水（30-50μl ）。使用镊子将幼苗放置在该液体上，并盖上盖玻片（图3A和3B）。
有关使用一个孔腔盖玻璃和定位苗的说明，请遵循协议先前描述：Marhavý和Benková ，（2015 ）。

样品成像
准备倒置共焦显微镜以供使用；设置激光器（对于GFP：488 nm激发，发射500-550 nm）和物镜。
注意：要全面了解根中的suberin定位，我们建议使用10倍或20倍物镜（在干式或水浸模式下）执行平铺扫描成像。对于更高分辨率的图像，我们建议使用浸入水或油中的40 ×或63 ×物镜。

在Zeiss LSM 880上图像捕获的参数如图3C所示：图像大小 – x：21793.72 µm，y：18702.12 µm；缩放比例X – 1510 µm，缩放比例Y – 1510 µm；平铺扫描– tile1，重叠百分比：20.0，平铺模式：矩形网格（拼接图像）；扫描模式–平面，缩放1.1；像素停留– 0.85 µs；主增益– 482；数字增益– 1.5；数字偏移量– 0.00；过滤器– SP 555；分束器– MBS：MBS 488 nm，MBS_InVis：平板，FW1：后部。

注意：应根据所用样品调整参数。

将载有苗的载玻片或培养皿安装在共聚焦显微镜的载物台上。
激活位置列表和瓷砖扫描（25个 ×与图像之间的20％的重叠34块）。
笔记：

根据大致扫描区域调整瓷砖数量。或者，激活自动缝合（也可以稍后使用共聚焦软件来完成）。
参数应根据样本的大小进行调整。
找到最靠近扫描区域中心点的根并标记位置。
停用位置并开始扫描。
注意小号：

使用上述参数，大约需要15分钟才能获得最终图像。如上所述，这提供了足够的时间来准备下一个样品。
如果实验室没有合适的共聚焦显微镜，则可以使用带平铺扫描选项的全电动荧光立体显微镜拍摄图像。
以TIF F或JPEG格式导出共焦图像。在ImageJ或其他软件中打开图像并分析您的图像（图3C，3D）。
注意：在每个步骤的时间安排和步骤上都必须准确，以确保结果的可重复性。

图3 。样品制备和成像。A. A 30 μ的升降水放置在两个封口膜条之间的显微镜载玻片上。B.在每张玻片上放10-15棵幼苗，并盖上盖玻片。C.对染色的拟南芥幼苗进行平铺扫描。黄色荧光表明木脂蛋白在根中沉积。白色框包围在D中展开的区域，以获得细木素薄片的详细图像。比例尺：1毫米。D.内胚层根细胞中的Suberin薄片的详细图像。比例尺：100μm。

数据分析

以Ima geJ Set比例打开图像；已知距离长度单位（毫米或厘米）；单击/标记全局，然后按确定。转到ImageJ，选择绘图线（分段或徒手画线），然后沿着根部从基部到尖端绘制一条线，按“ M”以测量根部长度。重复该过程以测量根部浸入区域的长度。将结果复制到Excel或Prisma GraphPad进行进一步处理（例如，计算根中的suberin占用率）。

注意：我们不建议您分析FY荧光强度，因为这可能会受到染色时间，洗涤和/或成像差异的影响。

菜谱

乙醇种子灭菌
将种子转移到2 ml Eppendorf试管中（每个试管中要灭菌的种子的最大量不得超过试管底部3 mm）

加入1 ml 70％乙醇，摇晃5秒钟，让种子沉降10分钟

在干净的长凳上干燥种子

半强度MS培养基（1升）
合并10克蔗糖，2.3克MS盐和0.5克MES，用KOH调节pH值至5.9，加入8克琼脂并用ddH 2 O填充至1升

高压灭菌介质20-30分钟，然后冷却至55 浇板前的°C

0.03％氟黄088溶液
在每次实验之前，必须新鲜制备室温下含乳酸的氟黄088（图1C，1D）。

注意：要加快将FY 088溶解在乳酸中，请将50 ml Falcon管连接到带有胶带的涡旋混合器上，并涡旋10-15分钟（图1C）。

0.5％苯胺蓝溶液
苯胺蓝在Milli-Q水

室温存放在阴暗处

致谢

我们AR （E T）^ h ankful来讨论尼科Geldner所有，并反馈给开发该协议。这项工作得到了瑞典研究委员会的PeterMarhavý的启动资助。沙希德·西迪克（Shahid Siddique）得到了美国农业部的资助（项目编号CA-D-ENM-2562-RR）。

该协议是基于Lux等人先前发表的工作改进的。（2005 ）。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突。

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