材料和试剂
移液管头（10 μ升，200 μ升，1 ，000 μ升）（STARLAB，目录号：S1111-3700，S1111-0706，S1111-6701）
60 mm细胞培养皿（Falcon，Corning ，目录号353004 ）
15 ml锥形管（Corning，目录号：352096）
50 ml锥形管（Corning，目录号：352070）
格雷纳蜂星®多孔培养板24个孔（TC与盖处理的）（Merck公司，目录号：M8812）
Thermo Scientific TM SuperFrost Plus TM粘合玻片（Thermo Scientific Fisher，目录号：10149870）
圆形盖玻片，24毫米（Th.Geyer，货号：7629906）
鼠
乙醇70％（VWR，目录号：20821.330）
FBS（Merck，Biochrom，目录号：S 0615）
不含钙和镁的DPBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190169）
DMEM，低葡萄糖，GlutaMAX，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：21885108）
II型胶原酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：17101015）
真菌区-两性霉素B（Thermo Fisher Scientific，目录号：15290018）
青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific ，目录号：15140122）
吐温® 20分子生物学（APPLICHEM，目录号：A4974）
甘氨酸 ≥99％，印迹等级（Carl Roth，目录号：0079.3）
ROTI ® Histofix 4％（卡尔罗斯，目录号：P087.3）
的Triton ® X-100分子生物学级（APPLICHEM，目录号：A4975）
Alexa Fluor TM 488鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific ，目录号：A12379）
Invitrogen TM DAPI（4'，6-Diamidino-2-Phenylindole，Dilactate）（Thermo Fisher Scientific ，目录号：D3571）
荧光固定剂（安捷伦，目录号：S3023）
孵育胶原酶培养基（请参见食谱）
透化缓冲液（请参见配方）
阻塞缓冲区（请参见食谱）

设备

一个通道移液器（体积1-10 μ升）仪（Eppendorf，目录号：3124000024）
一个通道移液器卷10-100 μ升）仪（Eppendorf，目录号：3124000075）
一个通道移液器（卷100-1 ，000 μ升）仪（Eppendorf，目录号：3124000121）
血细胞计数器 Neubauer计数室（品牌，目录号：717805）
P IPET-男孩acu2 （Integra Biosciences ，目录号：155000 ）
镊子Shandon，10英寸（Thermo Scientific Fisher ，目录号：6306）
精细弹簧剪刀，小刀片，直，8厘米（精细科学工具，目录号：15000-03）
一次性手术刀，第20号（Paragon，neoLab，目录号：1-1565）
高压灭菌器（VWR，Tuttnauer，货号：481-0585）
天平（KERN＆SOHN，目录号：PBJ 4200-2M）
离心机，带有摆桶式转子和用于15 ml和50 ml锥形管的适配器（Eppendorf，型号：5810，目录号：5810000320）
将加湿的细胞培养箱设置为37°C和5％CO 2 （Thermo Fisher Scientific，Heracell TM 150CU，目录号：50116047）
光学显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM IRB）
安全柜（Thermo Fisher Scientific，型号：Safe 2020，目录号：51026638）
水浴（GFL，目录号：1012）
蔡司细胞观察器电动宽视野显微镜（蔡司）

程序

˚F igure 2 。程序时间表

准备鼠标
设置一个手术台与上述设备。
通过颈脱位使小鼠安乐死。如果获得安乐死，可以使用其他方法。
用70％乙醇喷涂要处理的表面。用乙醇喷洒小鼠的腹部。
注意：乙醇不仅可以清洁老鼠的腹部，还可以固定毛皮。钍是避免小号HAV ING头发的制备领域。

放置在外科公猪鼠标d在一个与向外伸展上肢和下肢仰卧位置。
用四根固定针固定动物四肢的位置。

鼠主动脉的制备和提取（参见图1步骤s A + B）
使用镊子和鼠标打开鼠标的毛皮和皮肤层剪子。
为此，在剑突上方大致在鼠标的中线切开，并在上下两个方向上扩大初始切口。
保持胸腔和腹腔闭合，解剖所有皮肤层，露出腹膜和胸腔区域。
现在用镊子和剪刀打开腹腔。强烈提起腹膜层，以确保不切入肠子。
注意：对于清洁皮肤解剖以及开幕胸腹CAV ，两者均，它是建立在th足够的张力的关键与钳到E组织干净开刀。特别是在打开腹腔的同时，您可以避免刺穿肠道，从而避免肠道细菌污染样品。

在那之后，打开通过解剖隔膜胸腔，B ē注意不要隔膜的解剖过程中刺破心脏。
移开肺部。逐瓣抓住叶片，并用剪刀修剪。
移开腹部器官以看到主动脉。最初不要使用手术刀或剪刀切除腹部器官。取粗糙的组织，然后平稳地将肠道和其他器官散布到两侧。
注意：一旦器官位于小鼠两侧的腹膜腔外部，则可以使用手术刀或剪刀将器官从它们的连接组织和内观中剥离出来。即使在此步骤中刺伤了肠道或其他腹部器官之一，也可以避免由于先前的步骤而污染将来的样本。

切开两条股动脉，使血液和溶液在灌注过程中流出。
插管左心室，并用10 ml冰冷的PBS + P / S / F灌注。
现在提取鼠主动脉（见V IDEO 1 ）。为了尽可能清晰地切除主动脉，用镊子将其固定在远端，然后将其牢固向上提起。然后切下应随时处于张力下的组织。
注意：由于血管在这些区域非常牢固地附着在其周围组织上，因此在肾动脉的分支处以及主动脉穿过隔膜的穿过点最困难。

视频1.主动脉提取。（此视频是根据德国癌症研究中心和海德堡动物护理大学的指南在德国海德堡研究癌症中心制作的，并经德国癌症研究中心海德堡动物研究伦理委员会根据协议DKFZ 244批准。）

清洁和切割鼠科主动脉
将提取的主动脉放在60毫米的培养皿上（使用培养皿的顶部，以免侧壁干扰您的准备工作）（请参见图1的C1步骤）。
如果可能的话使用弯钳和删除所有的周围的脂肪和fibrose组织和外膜（见V IDEO 2 ）（参见图3的最终结果）。
注意：由于分支结构，在胸部的清洁比在主动脉的腹部要容易得多。

图3 。去除外膜后清洁主动脉。比例尺为1厘米。

视频2.清洁

现在，将清洁的主动脉放在新鲜的60毫米培养皿上，将其切成小环。我们建议使用两个手术刀的切割（见V IDEO 3 ）。实践表明，就切屑的细度而言，这种方法优于使用一把镊子和一把手术刀（参见图1的C2和图2 ）。
加入2毫升的DMEM + 15％FCS + P / S / F（PenStrep，两性霉素B）+胶原酶（浓度为10毫克/毫升，所以在这种情况下，20毫克）（参见图1小号TEP D1和图2 ）。
37温育过夜℃下用5％CO 2 （参见图1小号TEP D2）。

V IDEO 3.切割

血管平滑肌细胞的培养
第二天：上下吸移包含主动脉组织的培养基，并彻底冲洗培养皿。这有助于通过剪切力破坏粘合力。
将带有样品组织的培养基转移到15 ml Falcon中，并以18 0 × g离心5分钟（请参见图1的D3步骤）。
弃去上清液，并用DMEM + FCS + P / S / F重悬沉淀，然后将其铺在新的细胞培养皿中（参见图1的EEP）。
注意：此时，您可能希望将细胞从两个到三个鼠科动物主动脉合并。一个主动脉的产量应该足以用于简单的程序，例如qPCR或免疫组织化学。但是，我们建议从至少两只小鼠中提取提取的细胞，用于需要更多VSMC的更复杂程序。所有合并的细胞应一起培养在一个培养皿中。为了实现在最佳结果，我们推荐使用60毫米的最大盘大小的细胞，你会被提取赢得的数量细胞的培养之后的预计不会是100毫米的菜足够高。应该使用组织培养皿来确保粘附，皿的多余涂层是不必要的。

3-5天后检查（见图2），血管平滑肌细胞是否粘附在培养皿底部（此时请勿更换培养皿或培养基）（见图4）。

图4 。分离后4天后的细胞。可见细胞如何从主动脉块脱离。比例尺为100 µm。

CH折边的培养基（DMEM + 15％FCS），每2天传代，只有当汇合达到细胞。

质量控制
为了知道细胞是否处于适当的状态，可以对肌动蛋白纤维进行染色。我们将简要描述丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）的染色方案（见图5）。
将获得的血管平滑肌细胞以24孔格式接种在含有15％FCS的DMEM中的玻璃盖玻片上。
2-7天后，在室温下用Histofix（或4％多聚甲醛）固定附着的细胞10分钟。
通过用PBS洗涤除去Histofix。
为了通透，将细胞与通透液一起在缓冲液中孵育（见配方2）10分钟。
用PBS洗涤。
为防止抗体非特异性结合，请使用封闭缓冲液封闭30分钟（请参阅第3章）。
将细胞与封闭缓冲液中的Alexa Fluor TM 488 Phalloidin （1：200）在室温下于黑暗中孵育1小时。
注意：从现在开始，应将曝光量减少到最小程度，以免发生光致漂白。由于大多数不希望的细胞类型的存在于外膜，细胞留在媒体和内膜，这是被处理时，将限制对内皮细胞和平滑肌细胞（部分见步骤小号C1- Ç 2）。考虑到主动脉与胶原酶一起孵育，内皮细胞需要胶原蛋白涂层才能粘附在板上，因此内皮细胞不可能粘附在板上。此外，内皮细胞需要非常特殊的培养基才能存活。这是非常不可能的，他们会被污染后的培养小号TEP D5。但是，如果要评估污染物，可以将细胞用CD31染色以检测内皮细胞。这种单次染色不仅可以控制细胞状态，还可以证明培养物的纯度。由于主动脉从所有周围组织（清洁见步骤小号C1- Ç 2）仅血管平滑肌和内皮细胞预期进行培养。内皮细胞将无法存活，因为它们需要某些条件，因此清洁步骤可确保纯度。

洗涤3 ×，用PBS。
在室温下，用DAPI在PBS（终浓度2 µM）中孵育10分钟。
洗涤3 ×，用PBS。
用荧光固定剂将盖玻片固定在载玻片上。储存直至在4°C进行分析。
在荧光显微镜（例如，蔡司细胞观察仪）上分析染色（参见图5）。

图5 。鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）对F-肌动蛋白染色的血管平滑肌细胞。比例尺：50 µm。

菜谱

孵育胶原酶培养基
确保将样品孵育过夜的培养基中胶原酶的终浓度为10 mg / ml 。

较低的浓度会深刻影响您的细胞数量。

通透缓冲
PBS

5％FBS

0.01％吐温20

0.75％甘氨酸

0.1％的Triton-X 100

阻塞缓冲区
PBS

5％FBS

0.01％吐温20

0.75％甘氨酸

致谢

这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft的支持（SFB1366编号394046768项目C4和项目编号419966437）。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

所有动物实验均已由负责机构批准。使用批准文号DKFZ244进行动物实验。

参考文献

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