材料和试剂
参比电极– Dri-Ref（世界精密仪器，目录号：DRIREF-2）
玻璃微纤维过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1820047 ）
1.5毫升安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120086）
带有10毫米圆形腔体的亚克力矩形皿（定制），相当于玻璃底皿的商业用途（Cellvis，目录号：D35-10-1-N）
盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-545）
玻璃注射器（汉密尔顿，货号：80600）
硅胶（Sigma-Aldrich，目录号：13767）
银/氯化银丝（Fisher Scientific，目录号：AA41390G2）
硼硅酸盐玻璃毛细管（世界精密仪器公司，目录号：TW150-4）
N，N-二甲基三甲基甲硅烷基胺（Sigma-Aldrich，目录号：41716）
氢离子载体II鸡尾酒A（Sigma-Aldrich，目录号：95297）
氯化物离子载体I鸡尾酒A（Sigma-Aldrich，目录号：99408）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
硫酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：746452）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙烷磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
聚-L-赖氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
琼脂糖低胶凝温度（Sigma-Aldrich，目录号：A9045 ）
发芽培养基（请参见食谱）
储备溶液（请参阅食谱）

设备

pH计
涡流
微波
烤箱
干燥器
细针尖镊子（Sigma-Aldrich，目录号：T4537）
台式微量离心机（Eppendorf，型号：5415D）
微量移液器拉拔器（萨特仪器公司，型号：P-97）
离子选择振动探针（系统适用电子产品，型号：SIET扫描离子选择电极技术）
倒置显微镜（尼康，型号：Eclipse TE300）
显微镜光源电源（尼康，型号：TE-PS100）
相机（Andor，型号：iXon3）
60x / 1.40物镜浸油（尼康，型号：Plan Apo）

程序

该过程描述包括详细编萌发培养基，实验菜，花粉收集，离子选择性微电极，和盐水桥（仅用于阴离子通量）的制备。Ť他发芽协议从Boavida和麦考密克（2007）进行了优化。至关重要的是，在使用离子选择性振动探针技术时，必须尽可能降低离子背景浓度，以将背景噪声降至最低。因此，萌发培养基的所有组分的浓度被减小的目标是达到最小，但功能，培养基足以花粉萌发同时增加了信噪比。

菜肴准备
笔记：

保持库存溶液在-20以下 ℃。
在实验当天准备新鲜的发芽培养基。
由于拟南芥花粉晶粒的尺寸减小，玻璃微电极很容易接触玻璃底部并破裂。为了解决这个问题，液体琼脂的薄层OSE被放置在玻璃上，就足以覆盖它。干燥后，在琼脂OSE垫涂覆有聚-L-赖氨酸，以增加附着花粉避免荷兰国际集团花粉管浮动。理想的条件是具有花粉管生长附着于琼脂OSE垫便于探头定位。花粉粒在琼脂上不搅动数小时仍会附着在琼脂上。
聚-L-赖氨酸应适当除去以避免毒性。

从储备溶液中制备新鲜的液体发芽培养基。
用直径10毫米的丙烯酸矩形皿固定在圆形腔室底部的盖玻片（使用商用等效物时不需要）。
将0.01％的低熔点琼脂糖在安全锁定管（1.5 ml）中的1 ml发芽培养基中融化，在微波炉中加热30 s 。
加50 μ升到培养皿的底部，并除去过量的液体，具有一玻璃微纤维过滤器仅保留体积足以覆盖玻璃表面，而且产生的琼脂糖垫。
添加50 μ聚-L-赖氨酸的升琼脂上的顶部OSE垫。
等待5分钟。
除去聚-L-赖氨酸。
用液体介质洗涤两次，以除去过量的聚-L-赖氨酸，但仍保持粘合性能。

花粉的收集和发芽
笔记：

增长荷兰国际集团优先在短日照条件下光照的拟南芥植物的花粉提高质量和稳定性，实现高发芽率（> 90％）。虽然，也可以使用在其他光周期条件下生长的花朵。
从第10个角果树开始收集花朵。第一长角果具有一个低花粉的密度和发芽率降低。
收集的花朵，直到下午1点，否则，花开始关闭和花粉活力降低;
密度对于拟南芥花粉萌发非常重要。每个直径10毫米的菜收集20-25朵花。
用200重悬沉淀花粉μ与第一毫米升尖端切成放大其孔径，以避免花粉粒损坏。
要准备湿室，请使用带滤纸的P etri皿，将滤纸浸入蒸馏水中，以避免在花粉萌发过程中介质蒸发。

在短时光周期条件下（12小时光照/ 12小时黑暗周期）于22 °C ，湿度为70％，光强度为〜100μmolm -2的条件下，在生长室中种植拟南芥植物直至开花（生态型Columbia - Col-0）。s -1改善花粉的完整性和密度。
收集花后立即nthesis（阶段13 -史密斯等人，1990），使用薄的镊子和转移到1.5ml管（每管不超过100鲜花-使用每皿20-25花）。
加入1毫升发芽液体培养基。
以高速（〜2500 rpm）涡旋30-40 s 。
以1600 x g离心3分钟。
去除花和上清液。
轻轻重悬在100花粉沉淀μ液体介质的升。
在实验皿中加入一滴（〜25μl ）花粉沉淀。
加入200 μ液体介质的升得非常缓慢，以保持polle Ñ附着到琼脂晶粒OSE垫。
将碟子在22 °C的潮湿箱中孵育，最好在黑暗中孵育。
后2-3小时生长花粉管与≥200 μ长度的米可用于检测。

该过程是在图1中示出。

图1.采花和样品制备步骤的示意图。该图显示了如何从花中获取花粉，然后重悬和孵育花粉粒以促进花粉萌发。最后，可以在足够长的拟南芥花粉管中进行细胞外离子测量。

玻璃微硅烷化和我上-选择性探针制备
笔记：

根据所需的移液器配置优化拉拔器参数，以获得离子选择性探针。末端孔应具有〜1-3 μ直径用于测量两个质子和阴离子的米，而锥形稍长为阴离子降低离子载体泄漏（见希普利和费JO，1999为参考ENCE）。
离子载体是由不同的品牌，是纯度和能够根据制造商急剧变化，质量的重要因素商品化具有由电极测量的能斯特值影响。此外，能斯特值的差异可能表明离子载体过旧或被污染。

拉质子和阴离子专用的微量移液器。
将微量移液器放置在能使空气流通的铁丝网或特氟龙室中（图2）。

图2.使用金属丝网或特富龙室对玻璃微量移液器进行硅烷化。A.将微型移液器放在特氟龙室进行硅烷化。注射器表示施加N，N-二甲基三甲基甲硅烷基胺的孔径。B.密闭室准备进行硅烷化程序。C.将微量移液器放在丝网上进行硅烷化。D.密闭室准备进行硅烷化程序。

将微量移液器在210 °C的烤箱中过夜。
添加90 μ N个升，N -dimethyltrimethylethylsilamine用玻璃注射器。
等待30分钟。
让微量移液器在烤箱内冷却。
将硅烷化的微量移液管存放在装有硅胶的干燥器中。
使用注射器，回填用40mM KH的20-25毫米柱的微小电极2 PO 4 / 15mm以上的KCl，pH 7.5和前加载有〜25 μ氢或氯化物离子载体鸡尾酒的m个列。

离子选择探针校准
笔记：

Ç使用用于h alibration溶液+通量测量为pH 5,6 ，和7及0.1，1 ，和10mM KCl的阴离子测量。
由于氯化物离子载体检测除了氯以外的阴离子- ，估计被称为阴离子通量代替氯化物通量。
稳定的H +电极可用于4-5小时的测量；建议通过每2小时测量一种校准溶液来检查其稳定性。
校准前应准备好阴离子电极并使其稳定约2 h。电极稳定化包括在0.1 mM KCl校准溶液中对电极进行密封。此外，经过稳定和校准后，阴离子电极只能使用1小时，以确保可靠的测量。
参比电极（Dri-Ref）应保存在3 M KCl中，并在使用前用水正确冲洗。
连接到移液器支架的银/氯化银导线在使用前必须经过电氯化处理。该过程包括用一小片薄砂纸去除导线上的任何涂层残留物。之后，将9 V电池连接到双鳄鱼夹电缆，其中一端连接有粗银线，另一端具有移液器支架的金属销。两条导线两端必须在1米氯化钾的溶液的同时被浸入一个几秒钟。当移液器支架的银线变深时，就可以使用了。

将微电极连接到支架上，确保银/氯化银线与填充液接触。
将微电极放置在3个分别记录电压值的校准溶液中，以估算适当的能斯特电位拟合。
校准后，将微电极放入实验皿中。
将干燥的参比电极也插入培养皿中，以关闭电路（图3）。

图3.实验装置和样品盘。离子选择振动探针装置由参比电极（左），实验皿和连接到移液器支架的离子选择微电极组成。

将微电极放置在足够靠近花粉管质膜的位置，但避免触摸它（图4，视频1和2）。
测量的区域中的背景参考> 500 μ m距离任何花粉粒或花粉管程。

图4.质子和阴离子电极。放在拟南芥花粉管尖端前面的质子特异性电极（左）和阴离子特异性电极（右）的示例。阴离子专用电极具有更长的锥度和稍小的尖端孔径。

视频1.缩时从尖端细胞外质子测量拟南芥花粉管。以4 s的间隔采集100帧。

视频2.拟南芥花粉管尖端细胞外阴离子测量的时移。以4 s的间隔采集100帧。

数据处理
保存ASET软件的输出数据。
根据提供的Exce l文件中的设置，使用ASET输出中的数据来计算通量。电子表格具有作为输入下列常数：ë lectrode偏移，离子载体效率，扩散系数，斜率，以及校准曲线的截距。在常数下方的单元格中，应输入ASET“背景”和“电压差”测量值，这将在计算电子表格右侧的列中产生输出。然后，应选择输出的所有行并将其向下拖动，直到与输入行的末尾匹配为止。
电子表格从电压差记录中减去背景参考值，并使用菲克定律针对质子使用扩散系数9.37 x 10 -5 cm -2 s -1效率1来计算离子通量；对于氯化物扩散系数为-2.03×10 -5 cm -2 s -1和效率为0.5。

盐桥（仅用于阴离子通量测量）
注意：盐桥用于隔离从参比电极的生物样品，避免了与高浓度的萌发培养基污染的KCl ，泄漏荷兰国际集团从参比电极。否则，培养基中的氯化物浓度将大大增加，从而改变信噪比，从而在这些估计中产生错误的来源。盐桥在两个培养皿之间建立了电接触，但使参比电极与生物样品保持隔离，避免了污染以及与测量过程中离子浓度波动有关的不准确性。

通过加热玻璃毛细管的中心并使用两个镊子将其折叠以创建“ V”格式的桥来创建桥。
用含0.01％低熔点琼脂糖的发芽液体培养基的胶凝溶液填充桥。
代替一个部分的在桥上菜其中花粉管正在生长（其中离子选择性探头放置）和i桥的另一部分s前插入在其他盘仅与液体介质（其中，参考电极是填充放置）（图5）。

图5.用于测量阴离子通量的盐桥。将阴离子特异性电极放入实验皿中，而将参比电极置于充满发芽培养基的另一皿中。盐桥连接两个盘子，闭合测量电路。设置在右侧放大。

菜谱

发芽培养基
500μM氯化钾
500μM氯化钙2
125μM硫酸镁4
0.005％（w / v ）H 3 BO 3

125μM HEPES
16％（w / v）蔗糖
用NaOH将pH调节至7.5

储备溶液
股票KCl 100毫米
库存CaCl 2 100 mM
股票硫酸镁4 100mM的
股票H 3 BO 3 1％
库存HEPES 100 mM

致谢

JF实验室获得了美国国家科学基金会（MCB 1616437/2016和1930165/2019）和马里兰大学的资助。我们感谢Custódiode Oliveira Nunes和Michael A. Lizzio的照片。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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