材料和试剂
1.一次性比色皿2.5 ml大型PMMA（品牌，目录号：7591 05）
2. 50 ml离心管（VWR，目录号：525-1099）
3. 2毫升Eppendorf管（默克，目录号：BR780546-500EA）
4.移液器吸头0.5-5毫升（Roth，目录号：HL73.1）
5.移液器吸头200 µl（Th。Geyer，目录号：7695843）
6.用于电磁搅拌器的荧光比色杯，10 × 4 mm（Hellma ，目录号：119004F-10-40）
7.圆形盖玻片Ø15毫米（齿，目录号：P232.1）
8. BL21（DE3）感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：EC0114 ）
9. Milli -Q水
10. Agar-Agar，BioScience （Roth，目录号：6494.1）
11.单硫酸卡那霉素（MP Biomedicals ，目录号：11476412）
12.氯化钠（Roth，目录号：9265.1）
13.氯化钾（Roth，目录号：6781.1）
14.磷酸氢二钾（VWR，目录号：71003-452）
15.磷酸二氢钾（VWR，目录号：BDH9268-500G）
16.胰蛋白（（MP Biomedicals ，目录号：1010817）
17.酵母提取物粉末（MP Biomedicals ，目录号：103303）
18.异丙基- β - d -硫代半乳糖苷（MP Biomedicals公司，目录号：102101）
19.液氮（林德）
20.不含硅的实验室润滑脂（VWR，目录号：DECO514215.00-CA15）
21.双酵母胰蛋白（（DYT）培养基（请参阅食谱）
22.盐溶液（请参见食谱）
23.磷酸盐缓冲液50 mM ，pH 8.0，NaCl 300 mM （请参阅食谱）

设备

1.移液器2-20 µl（品牌，目录号：705870）
2.移液器20-200 µl（品牌，目录号：705882）
3.移液器0.5-5毫升（品牌，目录号：705882）
4.锥形瓶500毫升（Roth，目录号：C139.1）
5.带有锥形锥的锥形烧瓶（Roth，目录号：C139.1）（自制锥形锥）
6.电磁搅拌棒Ø3-4 mm，长度6-7 mm（Hellma ，目录号：323-300-VE10）
7. Multitron标准培养箱（INFORS HT ）
8.冷藏离心机，Multifuge 3 LR （Thermo Fisher Scientific，目录号：10563772 ）
9.离心机，Mikro 200（海蒂诗，目录号：2405 ）
10.细胞密度仪，Ultrospec 10（Biochrom ，目录号：80-2116-300）
11.荧光光谱仪，分光荧光计FP-8300 （Jasco ）
12.吸收性中性密度滤光片，Schott NG 4，直径25毫米，厚度3毫米，2.6％（Edmund Optics，目录号：14-091）
13. FTIR光谱仪，IFS 66v或IFS 66 / s（布鲁克）
14. FTIR光谱仪的ATR单元，MIRacle基本光学元件/平台组件（Pike Technologies，目录号：025-1850 ）
15.带槽的九反射金刚石/ ZnSe性能晶体板（Pike Technologies，目录号：025-2218 ）
16.红外带通滤光片，在5.35 µm处切入5％，在9 µm，Ø25 mm处切入5％（激光组件，目录号：3007570）
17.干燥空气发生器，露点-70 °C（Balston ）
18.水晶板的水冷装置（家用），可替换：数字温度控制模块（Pike Technologies，目录号：076-1220和076-1420 ）
19.冷冻循环器，数字温度控制器（PolyScience ）
20.样品上的451 nm LED，60 mW·cm -2 ，Luxeon Star / O（Phillips Lumileds ）（可能适用于LOV以外的感光体）
21. LED灯座（家用）
22.光整形扩散器，5°，扩散器套件，圆形光整形，缩小，Ø 25.4毫米（纽波特，目录号：10DKIT-C1）

软件

OPUS 7.5（布鲁克，www.bruker.com）
OriginPRO 2020（OriginLab，www.originlab.com）

程序

蛋白质表达（可能适用于LOV以外的感光体）
用所需质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞，并在琼脂平板上用50 µg / ml卡那霉素作为选择抗生素使其生长。
从琼脂平板上挑出一个菌落，然后将其转移到200 ml的DYT培养基中，其中含有50 µg / ml的卡那霉素作为选择抗生素，放在没有锥孔的锥形瓶中。
在37°C和120 rpm下过夜孵育细胞（约15小时）。
将2 ml细胞培养物转移到200 ml新鲜的DYT培养基中，该培养基中含有50 µg / ml卡那霉素作为选择抗生素，置于带有锥孔的锥形瓶中。
在37°C和120 rpm下孵育。
当细胞培养物的OD 600为0.5时，将温度降低至18°C 。用细胞密度计和一次性比色皿检查光密度。
添加异丙基- β - d -硫代半乳糖苷（终浓度10μM）时细胞培养物达到OD 600为0.8。
在黑暗中于18°C和120 rpm孵育细胞培养过夜（约18 h）。
从现在开始，所有准备步骤都需要在黑暗中使用红色大灯或在非常低的光强度下进行。

样品制备
ICIRD光谱的样品制备
将离心机预冷至4 °C。
转移45 ml的所述的细胞培养物至50ml离心管中。
将细胞培养物在4°C和3500 × g下离心15分钟。
弃去上清液，加入30 ml预冷的盐溶液。
通过用5 ml移液器上下移液轻轻重悬细胞沉淀。
将细胞悬液在4°C和3500 × g下离心15分钟。
再重复两次步骤B1d，B1e和B1f。
丢弃上清液，并用200 µl移液器除去剩余的上清液。
加入200微升盐溶液。
通过用移液器吸头搅拌细胞，轻轻重悬细胞沉淀。
将细胞放在冰上。在同一天使用样本进行调查。
用于验证表达的样品制备（如果感光体显示荧光）
将离心机预冷至4°C。
转移45 ml的的细胞培养至50ml离心管中。
将细胞培养物在4°C和3500 × g下离心15分钟。
弃去上清液，加入30 ml预冷的磷酸盐缓冲液。
通过用5 ml移液器上下移液轻轻重悬细胞沉淀。
将细胞悬液在4°C和3500 × g下离心15分钟。
再重复两次步骤B2d，B2e和B2f。
丢弃上清液
将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，并将细胞悬液稀释至OD 600为1.5。
将细胞放在冰上。在同一天使用样本进行调查。

用荧光光谱法验证表达水平（如果感光体显示荧光）
用磁力搅拌棒将1.5 ml来自步骤B2的细胞悬液转移到荧光比色皿中。
将磁力搅拌器设置为800 rpm。
用2.6％的透射滤光镜减少激发光，以防止光漂白。
将温度控制设置为20 °C。
将荧光比色杯放入荧光光谱仪中并记录发射光谱。对于结合黄素的感光体，例如LOV，应用表1中的设置。

表1.细胞内荧光光谱设置

励磁缝宽度

2.5纳米

发射缝宽度

20纳米

扫描速度

5 ，000纳米·分钟-1

响应

1秒

光电倍增管电压

600-700伏

激发波长

448纳米

测量范围

475-700纳米

温度

20 °摄氏度

数据间隔

0.2纳米

快门控制

打开快门仅用于测量

每隔30分钟重复一次测量，直到荧光发射恒定为止。
将发射光谱与纯化蛋白质的文献数据进行比较。一次使用非转化细胞检查自身荧光。
每个细胞的蛋白质拷贝数可以通过细胞计数并将荧光强度与蛋白质浓度相关联来确定（Goett-Zink等，2020）。

ICIRD光谱
用液氮冷却碲化汞镉检测器，并使其平衡30分钟。
放置IR滤波器在ATR单元以阻挡光≥ 2 ，000个厘米-1 （参见图1B，红色箭头），而将伸缩管（参见图1C）。

图1.安装了晶体板和水冷却单元的ATR单元。ICIRD光谱学的ATR单元以顶视图（A），侧视图（B）和已安装的伸缩管（C）显示。（B）中的红色箭头指示安装IR滤镜的位置。

将带有晶体板的ATR单元放在红外光谱仪中，并对准最大数量。
用干燥的空气吹扫ATR单元，然后将冷冻循环器连接到水冷却单元。
将晶体板冷却至10 °C。
选择FTIR experim以下设置的ENT （表2）：

表2. ICIRD光谱实验的设置

扫描仪速度

150 kHz的

检测器设定

MCT

高频极限

2256厘米-1

低频限制

0厘米-1

切趾功能

Blackman-Harris-3-Term

解析度

4厘米-1

相分辨率

32

相位校正模式

默兹

零填充系数

4

扫描次数

1 ，024扫描

低通滤波器

打开

记录1 ，backgr的024次扫描的空晶体的ound强度。
将15 µl来自步骤B1的细胞悬液放在晶体板上，并确保晶体完全被样品覆盖。
在圆形盖玻片的边线上放入不含硅酮的实验室润滑脂，将其放在水晶板上，并确保润滑脂完全封闭了隔室，以防止蒸发。
安装与用于晶体板与记录1中的水冷却器单元的顶部的圆形光整形漫射器（5°）的LED ，所述细胞的样品强度的024次扫描。确保在所得的吸收光谱中，酰胺I /水与酰胺II之比≥2.2，以确保样品充分水合。盐溶液中大肠杆菌细胞的典型吸收光谱如图2所示。

图2 。表达LOV蛋白的大肠杆菌BL21的FTIR吸收光谱。酰胺I带和酰胺II带出现在大约1 ，640厘米-1和1 ，550厘米-1分别叠加由强水贡献在约1 ，650厘米-1 。酰胺I /水与酰胺II的比率必须高于2.2，以确保样品充分水合。没有针对穿透深度的波长依赖性来校正光谱。

让该样品的至少30分钟，并且记录基线用3样品均衡，直到差值吸光度072扫描（背景和样品强度无光照）在1区域接近零，800-1 ，200厘米-1 。代表性基线如图3所示。
记录3 ，背景强度的072次扫描，直接照射样品2-10秒（保持光照时间尽可能短）和事后记录3 ，样品强度的072次扫描。结果差吸收光谱显示特征差信号。从aureochrome1a的LOV域的单个实验东城ö dactylum藻示于图3 。
等待感光器恢复为暗状态，然后重复步骤D12。如果光感受器的恢复时间过长（超过一小时）或不可逆转，请清理晶体板，然后再次从步骤D7开始进行新的样品制备。平均足够的差吸收光谱以获得良好的信噪比。

图3.大肠杆菌BL21细胞中LOV蛋白的光诱导FTIR差异光谱。一个细胞进行3,072次扫描后，每个细胞的总拷贝数为500,000个LOV蛋白已经足以在差异谱中看到小但特征性的光诱导的LOV结构响应信号（红色箭头）。在差异频谱中，信号源自通过照明改变的振动模式。正信号代表照明后样品的贡献，负信号代表照明前样品的贡献。可以从使用3072次扫描测得的基线估算噪声水平。

验证蛋白质在细胞内的定位以及细胞的完整性（可能适用于LOV以外的光感受器）
差异吸收实验后，从晶体板上移去凹穴。
将800 µl盐溶液加到放置在晶体板上的细胞中（步骤I12中的ICIRD实验之后），然后通过上下移液轻轻重悬细胞。
将细胞悬液转移至50 ml离心管中，并用盐溶液将悬液稀释至OD 600为1.5。
TR ansfer在荧光比色皿中的稀释的细胞悬浮液用磁力搅拌棒。
将磁力搅拌器设置为800 rpm。
使用2.6％的透射滤光镜减少激发光。
将温度控制设置为20 °C。
将荧光比色杯放入荧光光谱仪中并记录发射光谱。使用表1中的设置。
从荧光比色皿细胞悬液转移到一个2 ml的微量离心管中并在3离心细胞悬浮液，500 ×克为15分钟。
将上清液转移到干净的荧光比色杯中，并记录发射光谱。如果在细胞悬浮液中检测到荧光发射，但在上清液中未检测到荧光发射，则细胞完整无缺，蛋白质位于细胞内。

数据分析

使用OPUS评估差异光谱并平均代表性光谱。
使用OPUS工具进行橡皮筋基线校正，以校正平均差异谱以解决可能的基线漂移。
可以绘制光谱并最终确定以与OriginPRO 2020一起发布。
如果体外感光体的差异光谱是阿瓦伊LA BLE，通过缩放到辅因子的信号与在细胞差异光谱进行比较。

笔记

请勿用移液器吸头接触晶体板。仅可使用Milli -Q水，乙醇（pa）和精密抹布清洁晶体板。
差异吸光度测量的基线中的酰胺I和酰胺II区中的正信号是由细胞沉降引起的。发生沉淀时，请勿记录任何差异光谱。如果这些信号在一小时的平衡后仍未消失，请更换细胞样品。
吸收差光谱是根据照明I暗前的强度光谱和照明I照后的强度光谱使用以下公式计算得出的：

F中所得到的差频谱igure 3 SH OWS吸光度的差甲作为波数的函数。

菜谱

DYT培养基（高压灭菌）
5克酵母提取物粉末

10克胰蛋白Try

5克氯化钠

填充到1 ，000毫升用的MilliQ水

盐溶液（经过滤灭菌）
8.766克氯化钠

0.373克KCl

填充到1 ，000个ml的用的MilliQ水

磷酸盐缓冲液50 mM ，pH 8.0，NaCl 300 mM （过滤灭菌）
0.819克K 2 HPO 4

0.041克KH 2 PO 4

17.532克氯化钠

填充到1 ，000个ml的用的MilliQ水

致谢

这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant KO3580 / 7-1和Heisenberg Fellowship KO3580 / 4-2的支持。我们感谢Ina Ehring的技术支持，并感谢Carolin Metzger设计插图。该方案已被用于研究LOV感光体（Goett-Zink等，2020）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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