材料和试剂
NMJ免疫组化的材料和试剂
1. 0.5毫升试管（Sarstedt，目录号：72.699）
2. 2.0毫升试管（Eppendorf，目录号：0030120094）
3. Whatmann定性滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1001917）
4.显微镜载玻片Superfrost Plus（Thermo Fisher Scientific，目录号：J1800AMNT）
5.玻璃盖玻片（电子显微镜科学，目录号：72210-10）
6.聚苯乙烯培养皿（94毫米，Greiner，目录号：633180）
7.小型聚苯乙烯盘（35毫米，CytoOne，目录号：CC7672-3340）
8.果蝇果蝇三龄幼虫
注意：可以从Bloomington Drosophila畜牧中心（https://bdsc.indiana.edu/），京都畜牧中心DGRR（https://kyotofly.kit.jp）获得野生型菌株，如Canton S或Oregon R或特定品系。/cgi-bin/stocks/index.cgi），从VDRC（https://stockcenter.vdrc.at/control/main）和从FlyORF（https://www.flyorf.ch/）。

9. 0.7％琼脂糖平板，以保留选定的幼体（发行培养皿60 x 15 mm（猎鹰，目录号：353004 ），超纯琼脂糖（Thermo Fischer，目录号：16500100）。在4°C的冰箱袋中
10. 16％多聚甲醛（电子显微镜科学，目录号：15710 ），保持500个μ升等分试样在2ml管中于-20℃下
11. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
12.二水氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
13. HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：H3375）
14. HEPES钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
15.氯化镁溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
16.氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
17.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
18.碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
19.蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S1888）
20.海藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：T9531）
21.普通山羊血清（VectorLabs，目录号：S-1000），等分于-20°C
22. AffiniPure兔抗辣根过氧化物酶（杰克逊免疫研究，目录号：323-005-021）
23. Cy3-Affinipure山羊抗HRP（Jackson Immunoresearch，目录号：123-165-021）
24.山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21428），等分储存4°C，避光
25.山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11008），等分储存4°C，避光
26.山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21244），等分储存4°C，避光
27.山羊抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21422），等分储存4°C，避光
28.山羊抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11001），等分储存4°C，避光
29.山羊抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21235），等分储存4°C，避光
30. Alexa Fluor鬼笔环肽555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A34055），储存在-20°C，等分试样，受光保护
31. Alexa Fluor鬼笔环肽350（Thermo Fisher Scientific，目录号：A22281），储存在-20°C，等分，有光保护
32. Alexa Fluor鬼笔环肽488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A12379），储存在-20°C，等分，有光保护
33.慢速褪色金（Thermo Fisher Scientific，目录号：S36936），存储在-20°C
34.弹性体（Sylgard 184固化剂弹性体，Down Corning，目录号：DOWC6341655）
35.木炭-Darco-100目粉末（Aldrich，目录编号：242276）
36.透明和黑色的Sylgard解剖板（请参见食谱）
37. HL-3-Ca 2+游离溶液（请参阅食谱）
38. 4％PFA （请参阅食谱）
39. PBS 1 ×（请参阅食谱）
40. PBT（请参阅食谱）
41. 5％NGS（请参阅食谱）

NMJ电生理学的材料和试剂
银线（世界精密仪器，目录号：AGW2030）
柔性针电极Microfil（世界精密仪器公司，目录号：MF34G-5）
用于细胞内微电极的玻璃毛细管（长度100毫米，内径0.86毫米，外径1.50毫米；科学产品，目录号：GB150F-10）
用于刺激抽吸微电极的玻璃毛细管（长度100毫米，内径1.05毫米，外径1.50毫米；科学产品，目录号：GB150TF-10）
具有用于抽吸微电极的压力端口的微电极支架（WPI，目录号：MEH6SFW）
用于细胞内微电极的微电极支架（ALA科学仪器，目录号：BNC-PPH-0P-1.5）
氯化铁（III）（FeCl 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：451649）
氯化银（AgCl）（Sigma-Aldrich，目录号：204382）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化镁，标准溶液1 M（MgCl 2 ）（Honeywell International，Fluka，目录号：63020）
二水合氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
氯化氢（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
醋酸钾（CH 3 COOK）（Sigma-Aldrich，目录号：P3542）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3784）
海藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：T9531）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S1888）
细胞内微电极填充溶液（请参阅食谱）
Sylgard解剖板（请参阅食谱）

设备

NMJ解剖设备
不锈钢Minutien销（FST，目录号：26002-10）
一把镊子Dumont n。°5学生标准笔尖0.1 × 0.06，用于操纵幼虫和大头针（FST，目录号：91150-20）
两个镊子Dumont n。°5细镊子尖端0.05 × 0.01（FST，目录号：11254-20）用于解剖
弹簧剪刀2.5毫米直刀片（FST，目录号：15000-08）
Pipetman Classic P200（Gilson，目录号：F123601）
移液器吸头200（Sarstedt，目录号：70.760.002）
立体解剖显微镜（徕卡，目录号：MZ7.5）
鹅颈2臂（Leica，货号：30130021）
如有需要，可通过带有紫外线的荧光体视显微镜选择幼体（徕卡，目录号：MZ12.5）

NMJ免疫组织化学设备
螺帽混合器（LabNet，GyroMini，货号：S0500）
Pipetman Classic P10（Gilson，目录号：F144802）
Pipetman Classic P200（Gilson，目录号：F123601）
Pipetman Classic P1000（Gilson，目录号：F123602）
移液器吸头10（Sarstedt，货号：70.1130）
移液器吸头200（Sarstedt，目录号：70.760.002）
移液器吸头1000（Sarstedt，目录号：70.762.100）
共焦激光显微镜（Zeiss ，型号：LSM880 ）

NMJ电生理学设备
电生理设置

防震表（Vision IsoStation，纽波特，https: //www.newport.com.cn/ ）
用于电生理设置的立体显微镜（Leica Microsystem，型号：Leica MZ125，数值孔径0.8，平面复消色差物镜1.6 × ）
细胞内记录电极的液压微操纵器（NARISHIGE，型号：MHW-103，三轴水力液压微操纵器）
刺激电极微型操纵器（手动微型操纵器，MÄRZHÄUSERWETZLAR，型号：MM 33）
法拉第笼
刺激器：S88刺激器（美国罗得岛州沃里克市的格拉斯）
放大器：细胞内桥式放大器（Npi E lectronic，型号：BA-01X）
移液器（P-97火焰状/棕色微移液器）（Sutter Instruments，型号：P-97）
A / D接口（National Instruments，型号：PCI-6221）和与该软件兼容的计算机
用于记录信号在线可视化和记录轨迹离线分析的PC
软件

ImageJ（Wayne Rasband，NIH，https: //imagej.nih.gov/ ）
棱镜（GraphPad ，https : //www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
WinEDR软件（http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm）

程序

NMJ免疫组化
幼虫选择
使用解剖钳收集爬行的幼虫（L3），将它们放在黑色的sylgard板上的一滴水中，以清除残留的食物。注意避免幼虫损坏。
如果有必要针对荧光平衡剂进行选择，则将Sylgard板移至荧光立体显微镜下，然后选择您感兴趣的幼虫。
可以将雄性和雌性幼虫分开（基于雄性幼虫可见的睾丸）。
将选定的幼虫转移到0.7％琼脂糖板上。
幼虫解剖的免疫组织化学
选择一个幼虫，并将其放在干燥的黑色sylgard板上，您已经在该板上固定了几组，每组6个针脚。每个幼虫需要6个销钉进行解剖。在立体显微镜下转移sylgard板。
幼虫必须与背侧起来，其可以由两个可见侧气管的存在来识别被钉扎（左和右）跨越的整个纵向轴线的背侧幼虫区域。首先，将销钉放置在非常靠近幼虫嘴钩的位置，以免中枢神经系统受损。随后将幼虫的尾巴轻轻地钉住，并稍微拉伸幼虫（图2 -1和V ideo 1 ）。

˚F igure 2 。连续步骤说明果蝇果蝇第三龄幼虫的解剖

视频1.幼虫解剖

加40 μ l的HL-3钙2+游离溶液以浸没幼虫。
做横向切割在邻近的尾，输入与一个剪刀切到钩（图2，2-7）。
用HL-3-Ca 2+游离溶液上下吹吸清洗，以除去器官。使用P200移液器（图2，8-10）。
销钉以打开幼虫，最好在齿质带附近（图2、11-16），如果仍然存在一些器官，则将其除去，并小心除去前列腺和气管，以免在随后的免疫染色步骤中漂浮样品。
除去HL-3-Ca 2+游离溶液，干燥样品，用滤纸轻轻接触其附近。
加入80μl4 ％PFA溶液。
修复20分钟。
通过使用移液管P200取出4％PFA溶液，取出销，和幼虫圆角转移到0.5毫升管填充有400 μ冰镇的升HL-3钙2+游离溶液。将鱼片放在冰中，直到解剖所有样品。不要超过3小时的时间间隔。
注意：具有以上闪电的立体显微镜可能足以进行幼虫解剖，但是，对于某些操作员而言，使用光纤投影仪进行的额外后期照明可能更舒适。

免疫染色
用PBT重复3次洗涤，每次5分钟，将试管保持在室温的章动混合器中，以使组织完全透化。
在400μl的5％NGS中将鱼片孵育30分钟，以去除PBT并阻断非特异性位点。
根据供应商公司的要求，用5％NGS稀释您的一抗。考虑到任何样品都需要约300μl的体积，因此请准备唯一稀释的一抗，以在所有样品中均分。将样品留在4°C的章动混合器中过夜。
移去一抗（您可以将其储存在-20°C处作第二次使用），并在室温下在章动混合器上用PBT重复3次每次400μl的洗涤。
在添加二抗之前，用5％NGS重复30分钟封闭。
同时，稀释您的一抗所需的二抗。根据我们的经验，这里的Alexa报告说在5％NGS中以1：500稀释时效果很好。
在室温下在章动混合器中孵育2小时。
丢弃二抗溶液，并用PBT清洗幼虫鱼片15分钟。重复三遍。
取出所有PBT，添加30μl慢速淡金溶液，并在安装前保持4°C的光照。
将所有幼体鱼片放在不带电的显微镜载玻片的角上，然后轻轻地将其一一对准在显微镜载玻片上。尝试将所有鱼片保持在相同的方向上，从侧面或背面固定在载玻片上，并在相同的方向上使用钩子，这将有助于共聚焦采集。盖上几滴慢褪色剂，然后轻轻盖好盖玻片，避免气泡和幼虫鱼片移位。
图像在免疫组织化学样品一个共焦显微镜。

NMJ电生理
细胞内刺激性微电极制备
一种。在实验前约一小时，使用柔性针头将微胞内的微电极填充液充满微电极（请参见材料）。将填充的微电极保持安装在特定的微电极固定器上，氯化银线一侧浸在微电极内部，另一侧连接到细胞内放大器。通过在10 mM FeCl 3 / HCl溶液中将涂有银的电极进行化学氧化来制备氯化银（AgCl）导线，将电极浸入溶液中10 s。
b。使用P97拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出细胞内微电极（外径：1.5 mm；内径0.85 mm），并带有内玻璃丝，以帮助用细胞内微电极填充溶液填充微电极。实验者应通过方便地更改不同的参数（速度，拉力，时间，步数，加热）来调整拉马设置。一个好的开始方法是利用制造商提供的细胞内微电极的Puller设置，并获得拉动数十个微电极以单个更改每个参数的经验。将拉出的微电极保存在室温下。
C。刺激或“抽吸”电极按照制备到的上述步骤（b），以获得约7-10微米的较大的尖端直径改变牵拉设置。将拉出的微电极储存在室温下。
d。在次试验的时刻riment，装入抽吸电极的特定保持器，然后降低它，使用显微操作，到填充有其中HL3溶液SYLGARD板钉扎幼虫体壁进行解剖。
e。在HL3溶液中时，在压力端口上施加轻微的负压（使用连接有硅胶管的小注射器），将溶液吸入抽吸电极，直到内部氯化银灯丝完全浸入。
注意：用于幼虫NMJ制备的良好细胞内微电极应具有约15-20 MOhm的电阻，通常对应于约0.5μm的尖端直径。电极电阻由浸渍在浴中的微电极和使用的具体的电路测得的细胞内放大器。
体墙准备
如之前在步骤“幼虫选择”中针对NMJ免疫组织化学所述收集幼虫，并按照与先前所述类似的方式进行解剖。
将选定的幼虫放在装有1 ml冷（4°C）HL-3-Ca 2+游离溶液的sylgard板（35 mm）上。Ca 2+的缺乏会减少幼虫体壁肌肉的间接（神经诱发的激活）和直接激活，从而使可能干扰解剖的幼虫运动最小化。
如前所述，将幼虫的头和尾钉在涂有sylgard的陪替氏培养皿上。
将头和尾钉固定后，用细镊子抓住幼虫背壁并平稳提起，以利于用弹簧剪刀将其剪下。将剪刀的一个尖端插入幼虫背孔中，首先对幼虫头进行纵向背，然后对幼虫尾部进行纵向背。背壁的完整切开通常与内脏的“溢出”有关。
通过抓住并握住尾部附近的纵向背侧切口的边缘将销钉固定，左边缘和右边缘都平整到P etri盘底部（图2-12）。对于幼虫头部附近的纵向背侧切口的左右边缘，用另外两个销钉重复（图2-14和2-15）。用6个销钉完成幼虫的开口，使内脏易于接近。
在该第三龄幼虫体内，中枢神经系统被放置在腹侧位置，和内部内脏在予以背侧卧。要访问的神经系统，因此，内部内脏（主要是，肠，唾液腺，和主横向右侧和左侧气管）必须被移除。这可以通过用弹簧剪刀从幼虫的尾巴开始切开肠和左右气管来实现。掌握和保持用细镊子切割主气管的一个，并轻轻（从朝向幼虫头幼虫尾）的整个内内脏（肠，唾液腺除去，和气管）从主气管切割外围tracheolae始发。在幼虫头部末端附近，应特别注意避免中枢神经系统受损。消化道，气管，和唾液腺，必须围绕中枢神经系统的切换，而抓持，并用细镊子解除他们。
去除内脏后，通过切割和去除残留的内脏来完成并改善解剖，留下由中枢神经系统（视神经叶和腹神经节），节段周围神经和腹原完整段肌纤维制成的清晰制剂。
用新鲜的冷HL-3-Ca 2+游离溶液1 ml冲洗样品3次，然后在立体显微镜下检查解剖的质量。最佳解剖的幼虫体壁准备应充分透明，没有任何肌肉损伤的迹象。通过聚焦在透射光上，健康的肌肉纤维明亮，透明并清晰地横纹。损坏的纤维断裂，和/或乳白色和不透明。为了做好准备，应在几乎所有的幼虫纵轴上保持分段纤维图案。神经系统和节段神经也应完好无损。对幼体壁准备进行仔细的显微镜检查以确认解剖结构的完整性是获得良好而可靠的电生理记录的基本步骤。更好地放松时间并减少分析动物的数量，而不是在几乎不可靠的电生理记录中浪费时间。
电生理记录
通过刺激节段神经记录诱发的神经递质释放
在室温（20-22°C）下，对游离于HL-3-Ca 2+溶液中的三龄幼虫的体壁制剂进行实验。
用细镊子抓住并保持中枢神经系统，同时用弹簧剪将节神经切入靠近腹神经节的部位。
去除中枢神经系统（视神经叶和腹神经节）。
用不含HL-3-Ca 2+的溶液冲洗3次，除去最后的洗液，然后添加补充有Ca 2+ 1 mM终浓度的HL3溶液。在开始电生理记录之前，请至少孵育10分钟。
将带有固定的幼虫体壁制剂的Sylgard P etri皿转移到电生理装置的法拉第笼内。
将Sylgard P etri碟放在立体显微镜的台下，并使用光纤投影仪从上方对其进行照明。
在聚焦标本之前（即一直用立体显微镜），将细胞内微电极放置在细胞内放大器探头的支架上。
注意：电子设备对静电敏感，并可能被静电损坏。触摸放大器前端时，可以通过触摸接地的法拉第笼来避免最后的情况。

将抽吸电极放在与刺激器相连的支架上。
使用微操纵器，缓慢推进靠近幼虫体壁的细胞内和抽吸电极。当它们缓慢靠近幼虫体壁放置时，请使用体视显微镜聚焦于细胞内和吸引电极。当细胞内电极和抽吸电极都非常靠近幼虫肌肉时，纤维会停止其微定位。
通过使用steromicroscop Ë焦点和光折射整个试样，识别A4-6节段性神经（图3），PLA CE抽吸电极尖端靠近的切割端的神经绘在电极中的神经断端。另一种方法是将电极的尖端靠近神经干并拉起神经，使其在电极内部形成一个环。

图3 。刚剥离后的幼鱼片示意图。腹段（A1-A7）和肌肉1的位置的位置4，6和7中示出。大脑以星号（*）标记。

将抽吸电极稍微向后移动，以更好地观察其支配的特定腹部的纤维6或7。
通过作用在微操纵器上，控制细胞内微电极在x，y轴上的定位，并向前移动微电极，直到非常靠近光纤6或7膜为止。当细胞内电极尖端和肌肉纤维都处于同一焦点时，细胞内微电极与肌纤维膜非常接近。选择腹段A2 - A4的肌肉6、7是因为它们具有特定的突触类型（I型是谷氨酸能的[ Keshishian等，1996 ] ）。
打开细胞内放大器并检查微电极偏移：微电极接地电位应为零。
慢慢地推进微电极在检查记录上潜在的一个电脑屏幕。记录的电位突然下降至负值（通常为-60/70 mV），表明肌肉膜被刺穿并且微电极位于细胞内环境中。
膜电位低于-60 mV的肌纤维应丢弃。通过电流注入将-60 mV或更高的膜电势调整为-70 mV。在这种方式，它不是记录突触电位膜电位必要的脱机收集。
将刺激器设置为单个方波刺激。
通过通过SIU连接到Grass S88刺激器的吸引电极刺激节段神经（方波刺激，持续时间0.5 ms，x1.5阈值电压；阈值电压是引起突触电位的最小电压）。
应用单个刺激并在PC屏幕上检查它是否引起突触。突触电位记录为持续约50 ms的约30-40 mV振幅去极化电位（兴奋性连接电位或EJP）。神经刺激后的幼虫肌纤维不会产生类似于哺乳动物肌纤维的动作电位。因此，可以直接记录突触电位而无需添加任何电压通道阻断剂。而且，肌肉长度常数比肌肉纤维纵向长度长。这种生物物理特性可防止突触电位沿肌肉纵轴衰减。因此，靠近突触钮扣和靠近肌肉纤维末端的突触电位振幅不变。
记录自发性神经递质释放
通过长时间记录通过与一个神经递质囊泡的突触前神经元膜自发融合在肌肉突触后膜中诱导的微型兴奋性连接电位或极小值，来分析自发性突触活动。这些微型的平均幅度约为0.5 mV，其频率约为1 Hz。
要录制迷你后续小号TEPSα-α我到A-十六。因为自发突触的神经递质释放被记录，没有必要对利用抽吸电极。
穿刺肌肉纤维并将膜电位调节至-70 mV后，记录120 s的膜电位，并在无任何神经刺激的情况下记录最小电位。

数据分析

NMJ电生理分析

离线分析记录的信号
使用模数接口将放大的电生理信号馈送到PC，然后使用WinEDR软件进行可视化和保存，该软件也可用于离线信号分析。
记录的EJP的基本分析在于测量：
突触电位振幅：甲静息膜电位之间测量以mV mplitude前刺激开始和峰突触电位。这基本上是融合的囊泡的数量或突触后受体的数量的量度（参见下文，迷你图）。
最大去极化相：V在去极化的最陡相位测量去极化的elocity。这是神经动作电位到达突触后的囊泡融合时间和同步性的量度。
衰减时间：é xponential衰减突触潜力。它是突触后受体功能的量度。
注意：值得一提的是，由于有许多可用的脚本（电生理工具），Matlab（https://it.mathworks.com/products/matlab.html）也是一种可能的分析工具。或者，可以购买电生理专用软件，例如PClamp（https://www.moleculardevices.com/products/axon-patch-clamp-system/acquisition-and-analysis-software/pclamp-software-suite）。

记录的迷你唱片的基本分析在于测量：
在整个记录的迹线中（120 s）的微小频率：这是自发性神经递质释放的量度。
的分配迷你振幅：中号INIS通过与突触前膜的单个囊泡的融合产生。因此，它们的振幅应以高斯模式分布，且均值应接近平均值。有时，两个或三个以下囊泡融合在一起，产生振幅为振幅平均值两倍或三倍的振幅的振幅。当迷你频率很高时，这些多个整数迷你频率更高。因此，在这些情况下，可能以多高斯模式分布最小幅度，其平均值等于最小平均最小幅度的1 × ，2 × ，3 × 。平均最小最小振幅（即，单个囊泡融合产生的突触后电位的振幅）对于评估EJPs振幅极为重要（参见1b）。将EJPs振幅除以平均最小最小值，可得出神经刺激后融合囊泡的数量。如果平均最小最小振幅与对照相似，则任何EJP的降低都可能是由于突触前的改变。如果平均最小最小振幅与对照组不同，则任何EJPs的降低都可能是突触后损伤的结果。
一个小数与下一个小数之间的间隔：这是对这些事件的随机性的一种度量。这些间隔的分布应遵循泊松分布。

笔记

免疫组织化学

抗HRP
抗辣根过氧化物酶（HRP）的抗体与果蝇神经元膜结合，后者是一种特定的神经元标记（Jan和Jan，1982年）。如果未缀合（Jackson Immunoresearch，目录号：323-005-021），则必须与抗HRP抗体一起添加抗体（稀释度1:50 ），而Cy3偶联形式（Jackson Immunoresearch，目录号：123-165-021）必须用作第二抗体（稀释度1：150）。

鬼笔环肽
鬼笔环肽是一种有毒的肽（从蘑菇伞形毒蕈中分离），其荧光偶联物为肌动蛋白丝的可视化提供了方便的探针（Adams and Pringle，1991）。可以在第二抗体孵育期间将其添加到样品中（稀释度为1:50）。

菜谱
希尔卡德解剖板
对于合适的印版强度，每100克弹性体使用8.8克固化剂（Sylgard 184固化剂弹性体）
如果需要，加入1克活性炭-Darco-100目使其变黑
倒入大的聚苯乙烯培养皿（94 mm ）和小的聚苯乙烯培养皿（35 mm）
PBS 1 ×成分
137毫米氯化钠

10 mM磷酸盐缓冲液

2.7 mM氯化钾，pH 7.4

高压灭菌并在4 °C下储存

PFA 4％
制备2毫升4％PFA中添加500 μ PBS 1升×和1毫升水至500 μ 16％多聚甲醛的升

PBT
PBS 1 ×终浓度为0.1％的Tween-20

用0.22消毒μ米过滤和储存在4 ℃下

HL-3-Ca 2+游离溶液
70毫米氯化钠

5毫米氯化钾

20毫米MgCl 2

5 mM海藻糖

115毫米蔗糖

2.5毫米HEPES-HCl

2.5毫米HEPES-NaOH

使用NaHCO 3将B调节至pH值为7.2

解决方案必须是新鲜的

注意：对于电生理记录，将1 mM Ca 2+添加到溶液中。的Ca 2+从2加入中号的Ca 2+在去离子水中的储备溶液保持在4℃下（Stewart等人，1994）。

5％NGS
在PBT中稀释的正常山羊血清最高血清终浓度为5％
保持100个μ升100％正常山羊血清的等份于2.0ml管中在-20℃和添加，在使用中，1的时刻，900 μ PBT的升
细胞内微电极填充液
将溶解在去离子水中的3 M KCl和3 M CH 3 CO 2 K的溶液以1：2的比例稀释（Megighian等，2010）。

解决方案必须是新鲜的

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

参考文献

AE的Adams和JR的Pringle（1991）。用荧光染料偶联的鬼笔环肽对肌动蛋白染色。方法酶194：729-731。
Feiguin，F.，Godena，VK，Romano，G.，D'Ambrogio，A.，Klima，R.和Baralle，FE（2009）。TDP-43的消耗会影响果蝇运动神经元的终末突触和机车行为。FEBS Lett 583（10）：1586-1592。
哥德娜（VK），罗马诺（G.），罗马诺（G.），罗曼诺（M.），阿波切尔（Appocher），克拉米（R.），布拉蒂（E.），巴拉勒（Baralle）和FE。TDP-43通过调节Futsch / MAP1B水平和突触微管组织来调节果蝇神经肌肉接头的生长。PLoS One 6（3）：e17808。
Goel，P.，Li，X.，and Dickman，D.（2019年）。估计在果蝇幼虫神经肌肉交界处的易释放突触囊泡池。生物p rotocol 9 （1）：e3127。
扬（LY）和扬（YN）（1982）。作为果蝇和蚱hopper胚胎中特定神经元标志物的辣根过氧化物酶的抗体。美国国家科学院院刊79（8）：2700-2704。
Keshishian，H.，Broadie，K.，Chiba，A。和Bate，M。（1996）。果蝇神经肌肉连接：研究突触发育和功能的模型系统。神经病学年鉴（Annu Rev Neurosci）19：545-575。
Megighian，A.，Scorzeto，M.，Zanini，D.，Pantano，S.，Rigoni，M.，Benna，C.，Rossetto，O.，Montecucco，C.和Zordan，M.（2010）。SNAP-25的Arg206对果蝇果蝇神经肌肉连接处的神经胞吐作用至关重要。J Cell Sci 123（19）：3276-3283。
Romano G.，Klima R.，Buratti E.，Verstreken P.，Baralle FE和Feiguin F.（2014）。TDP-43在突触组织和机车控制中功能的时间要求。Neurobiol Dis 71：95-109。
Romano G.，Appocher C.，Scorzeto M.，Klima R.，Baralle FE，Megighian A.和Feiguin F.（2015）。Glial TDP-43通过自主和非自主机制调节轴突包裹，GluRIIA聚类和苍蝇运动。坎分子遗传学24 （21）：6134 - 6145。
NS，Sabeva和M.Bykhovskaia（2017）。果蝇神经肌肉连接处的FM1-43光转换和电子显微镜分析。生物p rotocol 7 （17）：e2523。
Strah，N.，Romano，G.，Introna，C.，Klima，R.，Marzullo，M.，Ciapponi，L.，Megighian，A.，Nizzardo，M.和Feiguin，F.（2020）。TDP-43通过调节果蝇骨骼肌中Disc-large表达来促进神经肌肉突触的形成。BMC生物学18 ：34。
Stewart，文学士，Atwood，HL，Renger，JJ，Wang，J。和Wu，CF（1994）。果蝇幼虫神经肌肉制剂在类血淋巴的生理溶液中的稳定性提高。J生理学杂志175（2）：179-191。