材料和试剂
1. 100毫米底盘（猎鹰，目录号353003）
2.玻璃巴氏移液器（Fisherbland ，目录号：13-678-20C）
3. 200μl移液器吸头（Greiner，目录号：739291）
4. 6孔板（Falcon，目录号：353046）
5. 15 ml锥形管（CORNING，目录号：430791）
6. 10毫升移液器（VIOLAMO，目录号：2-5237-04）
7.玻璃底盘（Matsunami Glass Ind。，目录号：D1113OH ）
8.冷冻的（Nunc，目录号：340711）
9. Geltrex hESC合格，即用型，降低生长因子的地下室膜基质（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：A1569601）
10. IV型胶原酶（1 mg / ml）（STEMCELL Technologies，目录号：07909）
11.不含CaCl 2和MgCl 2的PBS （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：14190）
12. Accutase细胞解离试剂（Funakoshi，目录号：AT104-500）
13.台盼蓝溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15250061）
14. ROCK抑制剂Y27632（PeproTech，BioGems，目录号：1293823）
15. NaCl （WAKO，目录号：198-01675）
16. KCl （WAKO，目录号：163-03545）
17. CaCl 2 · 2H 2 O （和光，目录号：033-25035）
18. MgCl 2 · 6H 2 O （WAKO，目录号：135-00165 ）
19. NaHCO 3 （WAKO，目录号：191-01305 ）
20.葡萄糖（WAKO，目录号：049-31165 ）
21.聚乙烯亚胺（WAKO，目录号：167-17811）
22. DMEM / F12（SIGMA，目录号：D8900-1L）
23.非必需氨基酸（× 100）（SIGMA，目录号：M7145）
24. 200 mM L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：25030-081）
25.剔除血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10828-028）
26. 2-巯基乙醇（和光，目录号：131-14572）
27. bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）（和光，目录号：060-04543）
28. BSA（牛血清白蛋白）（和光，目录号：012-23381）
29. PSC神经诱导培养基（由神经基础培养基和神经诱导补充剂组成，50 × ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：A1647801）
30.先进的DMEM / F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12634）
31. DMSO（二甲基亚砜）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
32. B-27补遗（50 × ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：17504044）
33. Hoechst 33258（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：H3569）
34. Anti-SOX1（细胞信号技术，目录号：4194S）
35.反NESTIN（R＆D系统，目录号：MAB1259）
36. Anti-PAX6（外壳，目录号：PRB-278P）
37.抗聚唾液酸（PSA）-NCAM（MilliporeSigma，目录号：MAB5324）
38.抗Tuj1（MilliporeSigma，目录号：MAB1637）
39.抗MAP2（MilliporeSigma，目录号：Ab5622）
40. Alexa 488结合的驴抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A21206）
41.与Alexa 488结合的山羊抗小鼠IgM（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A21042）
42.与Alexa 594结合的驴抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A21207）
43.与Alexa 594结合的山羊抗小鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A11005）
44. FM1-43（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：T3163）
45. 4％多聚甲醛磷酸缓冲溶液（WAKO，目录号：161-20141）
46.海卫一X-100（纳卡莱，目录号：35501-15）
47.双纽鲍尔计数室套件（NIPPON Genetics ，目录号：15170-089）
48. iPSC介质（请参阅食谱）
49.神经感应培养基（请参阅食谱）
50.神经膨胀培养基（见食谱）
51. NSC冷冻介质（请参阅食谱）
52.聚乙烯亚胺（PEI）溶液（请参阅食谱）
53.神经元培养基（见食谱）
54.神经元成熟培养基（见食谱）
55.人工脑脊液（请参阅食谱）

设备

生物安全柜（道尔顿，型号：DFC79 ）
移液器（Fisher，目录号：4680100）
水浴（AS ONE，型号：TR-3α ）
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：CKX53 ）
保温箱（Thermo Fisher，货号：51030287 ）
离心机（久保田，型号：6200 ）
Milli-Q（MILLIPORE，型号：C79625 ）
荧光显微镜（徕卡，型号：DMi8 ）

软件

Excel 2019（Microsoft，https://www.microsoft.com/zh-cn/microsoft-365/excel）
徕卡应用套件X（LAS X）（徕卡，https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/）

程序

图1示出的示意图用于neu的RAL分化使用经由人类iPSC的NSCs /的NPC 。

图1.来自人类iPSC的神经感应（针对NSC / NPC和神经元）的示意图。显示了分化的时间点，相应的步骤和培养条件。A.神经干细胞/ NPC的感应从iPSC的（天小号-1 - 7）。B.与NSC / NPC的神经元分化（神经元第0天：N0 - N56）。

制备用于神经分化的人iPSC （约-1天）
使用前，将生物安全柜内的工作区域暴露于紫外线下1小时，以对其进行消毒，然后用70％的乙醇擦拭安全柜中使用的工具和用品。
开始与高-生长在质量人类iPSC（没有分化的集落）的细胞饲养mitomycinC -上的100毫米培养皿（图2A）中的iPSC培养基处理MEF（配方1）。iPS细胞每3代-当他们达到707天- 80％汇合。
注意小号：

如果你认分化克隆的iPS细胞，取出用玻璃的区分区域p保持在倒置显微镜下asteur吸管或200μL枪头在生物安全柜。
成功的神经诱导的效率取决于iPSC的质量。牛逼herefore，我们建议您检查多个IP SC线神经分化。

图2.代表相-从iPSC的神经分化期间细胞的对比图像在到神经干细胞/的NPC。A.在开始神经诱导之前，未分化的iPSC集落保留在MEF饲养细胞上。B.在开始诱导的当天，Geltrex包被的孔上有iPSC菌落。C.成功诱导神经的第7天，准备好收获和扩大形态均匀而紧凑的P0 NSC / NPC。D.神经诱导失败的第7天。细胞群由形态异质的扁平非神经细胞（由红色箭头指示）和紧凑的NSC / NPC（由蓝色箭头指示）组成。为了净化，需要拾取紧凑的NSC / NPC。E.收获后24小时P1 NSC / NPC和P0 NSC / NPC通过。˚F 。P2 NSC / NPC表现出均匀的形态并以蜂窝状结构生长。比例尺，500 μ米。

预涂以及š用1ml Geltrex一个6孔板，孵育在37℃，5％CO的2为至少1小时的孵化器。
当的iPSC培养物达到70 - 80％汇合时，分离的iPSC集落用胶原酶IV溶液。即，吸出iPSC培养基，用5 ml PBS洗涤一次，然后向细胞集落中加入4 ml胶原酶IV溶液。
将细胞与胶原酶IV溶液在37°C，5％CO 2培养箱中孵育30分钟。
注：如果有必要，孵化10 - 15分钟的时间，但不超过60分钟，以防止红眼和灰细胞活力。

当菌落边缘开始卷起时，移出胶原酶IV溶液并添加10 ml iPSC培养基以稀释并洗去胶原酶IV 。
Ç ollect分离的菌落（后温和漂洗用的iPSC介质ü唱10ml的移液管）到15毫升锥形管中。
要除去MEF饲养细胞，请将装有细胞悬液的试管放置10分钟。然后，吸出含有MEF的上清液，而不会干扰iPSC沉淀。
注意：iPSC集落在重力作用下沉降到底部，而MEF单细胞则不能。

添加6毫升iPSC培养基以产生细胞悬浮液，然后按照以下步骤A9a-A9d估算细胞浓度。
将一部分悬浮液（1 ml）转移到新的15 ml锥形管中。
从9a中以200 ×g离心15 ml锥形管3分钟，然后吸出上清液。
要将iPSC簇解离成单个细胞，请向15 ml锥形管中加入1 ml Accutase，然后在37°C下孵育5分钟。
上下移液后，通过您喜欢的方法（例如，锥虫蓝排除法）进行细胞计数。
从步骤A3吸出Geltrex包被缓冲液，然后将2.5 ml iPSC培养基添加到6孔板的包被孔中。
轻轻摇动含有得自步骤A9的iPSC的悬浮液中的锥形管中，并培养板上的细胞上的孔在2.5 × 10 5 - 3×10 5细胞/孔。
注意：用于神经分化的iPSC应准备成簇。单个iPSC在本协议中将无法生存。

向孔中的细胞悬液中加入ROCK抑制剂Y27632，使其终浓度为10μM。
以往复方式和并排方式轻轻摇动板，以均匀分布细胞。
注意：请勿使板旋转，因为这会导致iPSC簇的分布不均匀。

放置板并在37°C，5％CO 2培养箱中孵育细胞过夜。

iPSC的诱导为神经干/ N eural祖细胞（NSCs / NPC S）（日小号0 - 7）
1.在第二天（第0天）（图2B），在板上吸出iPSC培养基，然后向6孔板的孔中加入2.5 ml预热的神经诱导培养基（NIM；配方2）。然后，将板放回培养箱。
2.在第2天，每孔用2.5 ml预热的新鲜NIM更换培养基。
3.在第4天，每孔用2.5 ml预热的新鲜NIM更换培养基。
4.在第6天，每孔用2.5 ml预热的新鲜NIM更换培养基。
5.在第7天，准备收获和扩大NSC / NPC（确定为第0代； P0）（图2C）。
注意：分异ED细胞的形态应该是均匀致密当神经干细胞/ NPC的被成功地诱导。

NSC / NPC的扩增和冷冻保存（日期7〜）
确认所得NSC / NPC的形态为均匀紧凑的形状。如果您观察到具有异质性蠕变学的扁平非神经细胞（图2D中的红色箭头），请按照以下步骤C2a-C2g从无n神经细胞中纯化NSC / NPC 。
以与上述相同的方式用Geltrex预涂6孔板的孔。
从步骤C1a吸出Geltrex，然后将2.5 ml含5μMY27632的预热神经膨胀培养基（NEM；请参阅食谱）加入6孔板的包被孔中。
在生物安全柜中的倒置显微镜下，用20μl移液器吸头以物理方式刮擦紧凑型NSC / NPC（图2D中的蓝色箭头）。
将细胞转移到步骤C1b中包含NEM的孔中。
重复步骤s C1c-C1d几次以收集井中的NSC / NPC。
注意：没有紧凑型NSC / NPC的最小或最大数量，可以在一口井中进行传输。但是，我们建议您尽可能多地收集细胞。

以前后和左右的方式轻轻摇动板，使细胞均匀分布，然后将板置于37°C，5％CO 2的培养箱中。
过夜孵育后，换成没有Y27632的新鲜NEM，然后将板放回培养箱中，再孵育NSC / NPC一天。
第二天，确认细胞的形态为均匀紧凑的形状。
以与上述相同的方式用Geltrex预涂6孔板的孔。
从含有NSC / NPC的孔中吸出培养基，然后轻轻加入2 ml PBS冲洗细胞。
吸出PBS; 然后，向6孔板的每个孔中加入1 ml Accutase，并在37°C下孵育5分钟，以使细胞与孔表面分离。
在6孔板的孔中加入1 ml PBS后，将细胞悬液转移到15 ml锥形管中，然后上下轻轻摇打3次以破坏细胞团块。
将试管以300 ×g离心5分钟。
吸出上清液，将细胞重悬于3 ml PBS中，并以300 ×g离心5分钟。
吸出上清液，将细胞重悬于1 ml预热的NEM中。
通过首选方法（例如，锥虫蓝排除法）执行细胞计数。
稀释用预热NEM细胞悬液至2×10 5 - 4×10 5细胞/ ml。
吸出Geltrex FR OM小号TEP Ç 2和板2.5毫升细胞悬浮液到井的（2.5×10 5 - 3×10 5细胞每孔）。
将Y27632添加到细胞悬液中，使其终浓度为5μM。
摇动平板克ently以来回的往复和侧到另一侧的方式均匀地分布的细胞。
注意：请勿旋转板，以防止细胞分布不均。

第二天，将培养液吸到板上，然后向6孔板的孔中加入2.5 ml不加Y27632的预热新鲜NEM。每隔一天必须用2.5 ml新鲜的预热NEM更换细胞的培养基。
当NSC / NPC汇合时，可以按照上面的步骤C2-C14进行进一步扩展，冷冻保存，分化为神经元或通过免疫荧光进行分析（图3）。
注意小号：

这是非常重要的通道以0.5×10的密度将细胞5 - 1×10 5个细胞/ cm 2 （2×10 5 - 4×10 5个细胞/ ml），因为它们很容易失去其多能分化为神经元/神经胶质细胞，如果它们以低密度生长。
在传代时，我们建议您将Y27632应用于培养基以防止细胞死亡。第二天应通过更换新鲜培养基来除去Y27632。

˚F igure 3.免疫荧光染色NSC S /筹备与抗体对神经干细胞标记物。iPSC衍生的NSC / NPC （P1）用抗SOX1（绿色），抗NESTIN（红色）（A）和抗PSA-NCAM（绿色），抗PAX6（红色）抗体（B）免疫染色。通过Hoechst染色（蓝色）鉴定出细胞核。比例尺，200 μ米。

当准备好冷冻保存NSC / NPC时，可以按照上面的步骤C3-C9卸下它们。在此之后，在NSC化妆细胞悬浮液冷冻培养基（见以2×10食谱）6 - 4×10 6 -80个细胞/ ml，并分配1ml细胞悬浮液加入每个离心管并冷冻细胞℃过夜。如有必要，将冷冻小瓶冷冻至少24小时后，将其转移到液氮储存罐中。

NSC / NPC中神经元的分化和成熟（神经元第0天：N0 - N56）
起始神经元分化，预涂前的玻璃底培养皿的表面用0.2ml聚乙烯亚胺（PEI）溶液（2.8  ×  10 2和孵化在室温下过夜;配方5μM）。
在开始神经元分化的当天（N0天），用高压灭菌的水清洗PEI涂层的盘子至少5次。在使用前，请在最后的洗涤步骤后将碗盘表面用水覆盖。
注意小号：

必须彻底冲洗掉剩余的PEI溶液，以减少过量PEI引起的细胞毒性。
PEI涂层的碗碟在室温下最多可保存2天。
从含有NSC / NPC的6孔板的孔中吸出培养基，然后轻轻加入2 ml PBS冲洗细胞。
Aspira te PBS。然后，向6孔板的每个孔中加入1 ml Accutase，并在37°C下孵育5分钟，以使细胞与孔表面分离。
在6孔板的孔中加入2 ml P BS后，将细胞悬液转移到15 ml锥形管中，然后轻轻地上下吸移3次以破坏细胞团块。
将试管以300 ×g离心5分钟。
吸出上清液，将细胞重悬于3 ml PBS中，并以300 ×g f或5分钟离心细胞。
吸出上清液并将细胞重悬于1 ml预热的Neuronal培养基（NM；配方6）中。
使用您喜欢的方法（例如，锥虫蓝排除法）执行细胞计数。
稀释用预热NM细胞悬浮液至5 ×10 5个细胞/ ml（需要0.2毫升用于阱的玻璃底皿）。
从步骤2中吸出水在PEI包被的培养皿上，然后在每个培养皿上铺板0.2 ml细胞悬液（每个培养皿1×10 5个细胞：1×10 5细胞/ cm 2 ）。
将Y27632添加到细胞悬液中，使其终浓度为5μM。
以前后和左右的方式轻轻摇动碟子，以均匀分布细胞。
注意：请勿旋转培养皿，以防止细胞均匀分布。

将细胞培养皿置于37°C，5％CO 2的培养箱中过夜。
接下来的一天，吸出文化前进重新介质和加入2mL预热新鲜NM而不Y27632到碗碟。将培养皿放回37°C，5％CO 2的培养箱中。
直到第N28天，每周必须用新鲜的预热NM小心轻柔地更换细胞的一半培养基（1 ml）。
注意：分化的神经元很容易通过诸如移动培养皿和去除培养基等物理力而从培养皿表面脱离。因此，执行介质更换操作时必须格外小心。

在神经元分化4周后（第N28天），用神经元成熟培养基（NMM;食谱7）更换一半的培养基。
继续改变一半的培养基用新鲜NMM一次或每周两次另外4周（至少直到一天N56）神经元垫uration 。
4周神经元成熟（天N56〜）后，将神经元准备通过免疫荧光（图4）和功能分析如FM1被分析- 43胞吐成像。

图4.从NSC / NPC分化出的神经元的免疫荧光染色。iPSC衍生的神经元用抗Tuj1（红色）（A）和抗MAP2（绿色）抗体（B）免疫染色。细胞核也用赫斯特染色（蓝色）。比例尺，200 μ米。

免疫荧光法（视频1）
1.吸取培养基而不会使细胞脱落。
注意：分化后的细胞，尤其是神经元，很容易通过物理力从培养皿表面脱离；因此，添加和删除缓冲区时必须格外小心。

2.在室温下用4％低聚甲醛磷酸缓冲溶液固定细胞15分钟。
3.吸出多聚甲醛溶液后，用PBS冲洗细胞3次。
4.在室温下用0.1％Triton X-100的PBS溶液渗透细胞10分钟。
5.抽吸通透缓冲液后，在室温下用5％BSA的PBS溶液封闭细胞60分钟。
6.吸出封闭缓冲液后，用在封闭缓冲液中稀释的一抗在4°C下对细胞进行免疫染色。抗SOX1（兔;稀释1：100），抗-巢蛋白（小鼠IgG; 1：500），抗PSA-NCAM（小鼠IgM; 1：400）和抗PAX6（兔;稀释1：1 ，000 ）的TI博二ES用于神经干细胞/ NPC的，和抗TUJ1（小鼠IgG; 1：;：500）1 500），抗MAP2（兔antibod IES为神经元，分别。
7.吸出一抗后，用PBS洗涤细胞3次以冲洗掉未结合的一抗。
8.将细胞与在PBS中稀释的相关荧光标记的二抗在室温下于黑暗中孵育60分钟。的Alexa 488缀合的抗兔IgG（1：1 ，000），Alexa的488缀合的山羊抗小鼠IgM（1：1 ，000），Alexa的594缀合的驴抗兔IgG（1：1 ，000），和Alexa 594缀合的抗小鼠IgG（1：1 ，000）被使用。
9.吸出二抗后，用PBS洗涤细胞3次以冲洗掉未结合的二抗，最后一次洗涤中，用Hoechst 33258（1μg/ ml）对细胞核进行复染。
10.在荧光显微镜上分析细胞。

视频1.免疫荧光教程。在本教程中，我们将介绍使用第一抗体和荧光标记的第二抗体进行免疫染色的细胞的基础知识。

FM1-43荧光染料对成熟神经元的功能分析。
除去叔他神经元培养米edium保持在玻璃-使用1000微升-微量而不逐出所述细胞底菜。
注意：使用微量移液器去除培养基很重要。请勿使用抽吸器，因为在此过程中会损坏神经元。

轻轻洗涤细胞一次用200μl p重新温热人工脑脊液（ACSF;配方8）使用一个1000微升-微量而不撞出细胞。
孵育2细胞00含有FM1的5μM微升ACSF - 43一小时在37℃，5％CO 2培养箱中。
卸下FM1 -使用1000微升-微量而不干扰细胞43溶液。
轻轻洗涤细胞用200μl的3倍p重新使用1000微升-微量温热ACSF而不逐出所述细胞，如在步骤2中描述。
浸入用2ml细胞新鲜ACSF而不FM1 - 43。
分析FM1 -在荧光显微镜（Leica）细胞的43强度。
注：FM1 - 43应使用488nm的激发（波长）的蓝色光激光器及其发射（520纳米）的获取每秒作为一系列图像小号通过× 40倍的物镜。为了分析，FM1的淬火- 43引起由治疗用在50mM的高氯化钾（KCl）溶液可被认为是胞吐活性。

图5的功能分析人类神经元FM1 - 43荧光染料。成熟的神经元被用来与FM1功能分析- 43成像，一个强大的工具，以确定胞吐活性。A.明亮和f luorescent图像小号神经元的装载有FM1 - 43染料刺激之前诱导细胞去极化。B.刺激后60 s 。比例尺，25 μ米。C. FM1的强度的时间-过程-前和刺激后43荧光。FM1的还原- 43强度可以识别为胞吐作用。加入高氯化钾溶液（最终50 mM）以引起细胞去极化。

数据分析

所述帧内的改变蜂窝FM1 -测定43荧光期间的之前和之后的去极化刺激用50mM HK + 。FM1的发射- 43被捕获每一个秒OND和作为使用LAS X成像系统层叠图像存储。通过该协议对iPSC诱导的神经元的详细分析可以在我们最近的出版物中找到（Kajihara等人，2020年的补充信息）。

菜谱

iPSC培养基
DMEM / F12 400毫升
非必需氨基酸（X100）5毫升
200毫米L-谷氨酰胺5毫升
淘汰血清替代品100毫升
0.1 M 2-巯基乙醇/ PBS 500μl
0.1％BSA / PBS中的10μg/ ml bFGF / 200μl
总计：510.7毫升

培养基可以在2-8 °C的黑暗环境中保存2周。

神经感应培养基
神经基础培养基49毫升
神经感应补充剂（× 50）1毫升
总计：50毫升

培养基可以在2-8 °C的黑暗环境中保存2周。

注意：使用前，将介质在37°C的水浴中加热5-10分钟。但是，请勿将介质在37°C水浴中加热10分钟以上，因为介质中的成分可能会变质。

神经膨胀培养基
神经基础培养基24.5毫升
高级DMEM⁄F12 24.5毫升
神经感应补充剂（× 50）1毫升
总计：50毫升

培养基可以在2-8°C的黑暗环境中保存2周。

注意：使用前，将介质在37°C的水浴中加热5-10分钟。但是，请勿在37°C水浴中加热培养基10分钟以上，以免损坏培养基中的成分。

NSC冷冻培养基
神经膨胀培养基9毫升
DMSO 1毫升
总计：10毫升

聚乙烯亚胺（PEI）溶液
聚乙烯亚胺1毫升
H 2 O，经Milli-Q过滤的499 ml
总计：500毫升

神经元培养基
神经基础培养基49毫升
B27补充剂（× 50）1毫升
总计：50毫升

培养基可以在2-8°C的黑暗环境中保存2周。

神经元成熟培养基
DMEM 40毫升
KnockOut血清替代品10毫升
总计：50毫升

培养基可以在2-8 °C的黑暗环境中保存2周。

人工脑脊液
氯化钠7.3克
氯化钾0.1864克
氯化钙2· 2H 2 O 0.294克
MgCl 2 · 6H 2 O 0.2024克
NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 0.195 g
碳酸氢钠3 2.1 g
葡萄糖4.5克
ħ 2 O，的Milli-Q过滤的高达1 ，000毫升

致谢

这项研究得到了日本科学促进协会KAKENHI的18K15369和20K06857资助的部分支持。我们感谢小田春树博士对神经诱导的建议。该协议源自我们先前的工作（Kajihara等人，2020年）。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

使用人iPSC的本方案是根据熊本大学基因分析和基因组研究伦理委员会的批准执行的。获得所有受试者的知情同意。

参考文献

钱伯斯（Chambers，SM），加利福尼亚州法萨诺（Fasano），加利福尼亚州帕帕佩特鲁（Papapetrou），密西西比州富岛（Tomishima），密西根州萨德莱恩（Sadeelain）和路易斯安那州斯图德（Studer）。（2009）。通过双重抑制SMAD信号传导对人类ES和iPS细胞进行高效的神经转化。Nat Biotechnol 27（3）：275-280。
Dimos，JT，Rodolfa，KT，尼亚坎，KK，Weisenthal，LM，Mitsumoto，H.，Chung，W.，Croft，GF，Saphier，G.，Leibel，R.，Goland，R.，Wichterle，H.， CE的Henderson和K.的Eggan（2008）。ALS患者产生的诱导性多能干细胞可以分化为运动神经元。科学321（5893）：1218-1221。
邓恩（NR），文森特（SD），奥克斯堡（Oxburgh），罗伯逊（EJ）和比科夫（Ek）（2004）。Smad2和Smad3的组合活动调节小鼠胚胎中胚层的形成和模式。发展131（8）：1717-1728。
T.Era，N.Izumi，M.Hayashi，S.Tada，S.Nishikawa和SI.Nishikawa（2008）。多个中胚层亚群产生内皮细胞，而造血细胞仅与胚胎干细胞分化培养中的受限亚群区分开。干细胞26（2）：401-411。
福克（Falk，A.），科赫（Koch），P。凯萨万（J.Kesavan），高岛（Y.Takashima），拉德维格（Ladewig），J。亚历山大（Alexander），M。维斯科（Wiskow），O。裁缝（Tailor），J。 Smith，A.和Brustle，O.（2012年）。从多能干细胞中捕获神经上皮样干细胞为体外生产人类神经元提供了一个多功能系统。PLoS One 7（1）：e29597。
Inoue，H.，Nagata，N.，Kurokawa，H.和Yamanaka，S.（2014年）。iPS细胞：改变未来医学的游戏规则。EMBO J 33（5）：409-417。
R.Kajihara，R.，Numakawa，T.，Odaka，H.，Yaginuma，Y.，Fusaki，N.，Okumiya，T.，Furuya，H.，Inui，S.和Era，T.（2020）。新型药物候选者通过自噬激活改善GM1神经节苷脂模型中神经节苷脂的积累和神经功能障碍。干细胞报告14（5）：909-923。
川崎（H.），佐佐木（Mizuseki），西川（S.Ishikawa），金子（S.），桑名（Kuwana），中西（Nakanishi），西川（S.I.）和Sasai，Y.（2000）。基质细胞衍生的诱导活性从ES细胞诱导中脑多巴胺能神经元。神经元28（1）：31-40。
Kido，J.，Nakamura和K.Era（2020）。诱导多能干细胞在溶酶体贮积病中的作用。摩尔细胞神经科学103540。
Lee，H.，Shamy，GA，Elkabetz，Y.，Schofield，CM，Harrsion，NL，Panagiotakos，G.，Socci，ND，Tabar，V.和Studer，L.（2007）。定向分化和人类胚胎干细胞移植-衍生的运动神经元。干细胞25（8）：1931-1939。
李威，孙威，张瑜，魏威，Ambassudhan，R。夏萍，塔兰托娃，M。林T.，金洁和王X.（ 2011）。小分子抑制剂可快速诱导人胚胎干细胞中的原始神经前体并对其进行长期自我更新。美国国家科学院院刊108（20）：8299-8304。
Marin Navarro，A.，Susanto，E.，Falk，A.和Wilhelm，M.（2018年）。使用患者衍生的多能干细胞对癌症进行建模，以了解儿童恶性肿瘤的发展。细胞死亡迪斯科夫4：7。
松下，K.，Numakawa，T.，Odaka，H.，Kajihara，R.，Soga，M.，Ozasa，S.，Nakamura，K.，Mizuta，H.和Era，T.（2019）。Tay-Sachs iPSC衍生的神经元的突触前功能障碍。神经科学414：128-140。
Morizane，A.，Doi，D.，Kikuchi，T.，Nishimura，K.和Takahashi，J.（2011）。小-骨形态发生蛋白的和激活/分子抑制剂节点信号促进由人多能干细胞高效神经诱导。J Neurosci Res 89（2）：117-126。
Nemati，S.，Hatami，M.，Kiani，S.，Hemmesi，K.，Gourabi，H.，Masoudi，N.，Alaei，S. and Baharvand，H.（2011）。长期可自我更新的无饲养员的人类诱导的多能干细胞来源的神经祖细胞。干细胞开发20（3）：503-514。
Nishikawa，S.-I.，Jakt，LM和Era，T.（2007）。胚胎干细胞培养作为发育细胞生物学的工具。纳特ř EV分子Ç ELL乙IOL 8（6）：502-507。
Raab，S.，Klingenstein，M.，Liebau，S.和Linta，L.（2014）。关于iPSC生成的人体细胞来源的比较观点。干细胞诠释2014：768391。
Saha，B.，Borgohain，M.，Dey，C.和Thummer，R.（2018）。iPS细胞的产生：当前和未来的挑战。Ann Stem Cell Res Ther 1（2）：1007。
Shi，Y.，Kirwan，P.和Livesey，FJ（2012）。将人类多能干细胞定向分化为大脑皮层神经元和神经网络。Nat Protoc 7（10）：1836-1846。
佐贺（男），石冢（Y.），滨崎（男），米田（K.），古屋（H.），松尾（M.），伊恩（Ihn），北佐佐木（Fusaki），北卡罗来纳州（Nakamura）和中田（N.） 2015）。HPGCD优于HPBCD作为尼曼的潜在治疗方法-在使用iPS细胞进行疾病建模期间选择C型疾病。干细胞33（4）：1075-1088。
Tada，S.，E.，T.，Furusawa，C.，Sakurai，H.，Nishikawa，S.，Kinoshita，M.，Nakao，K.，Chiba，T. and Nishikawa，S.I. （2005）。中胚层的特征：胚胎干细胞分化培养中定形内胚层和中胚层的分叉点。发展132（19）：4363-4374。
Takahashi，K.，Tanabe，K.，Ohnuki，M.，Narita，M.，Ichisaka，T.，Tomoda，K.和Yamanaka，S.（2007）。通过确定的因素诱导来自成年人类成纤维细胞的多能干细胞。细胞131（5）：861-872。
Wang L.和Chen Y.-G. （2016）。胚胎干细胞向中胚层分化的信号控制。分子生物学杂志428（7）：1409-1422。
严Y，申胜，贾，BS，刘庆，盛杰，李，F.，詹M.，戴维斯，J.，巴尔蒂，K.，曾X.，饶，M.，Malik，N.和Vemuri，MC（2013）。从人多能干细胞高效快速地衍生出原始神经干细胞并生成脑亚型神经元。干细胞Transl Med 2（11）：862-870。
Yu J.，Vodyanik，MA，Smuga-Otto，K.，Antosiewicz-Bourget，J.，Frane，JL，Tian，S.，Nie，J.，Jonsdottir，GA，Ruotti，V.和Stewart，R. （2007）。衍生自人体细胞的多能干细胞系。科学318（5858）：1917-11920。