材料和试剂
1. 1.5毫升管
2.移液器技巧
3.蛋糕
4. 0.22微米过滤器
5. W303酵母细胞（基因库编号：JIUU00000000）
6. 1中号二硫苏糖醇（DTT，钍ermoFisher ，目录号：P2325）
7.焦碳酸二乙酯（Sigma，目录号：40718 ）
8. UltraPure TM不含DNase / RNase的蒸馏水（ThermoFisher ，目录号：10977015）
9.酵母提取物（西格玛，目录号：Y1625）
10.蛋白ept（Sigma，目录号：P0556）
11. d - （+） -葡萄糖（Sigma，目录号：G8270）
12.腺嘌呤（Sigma，目录号：A8626）
13. N-月桂酰基肌氨酸钠盐，Sarkosyl（Sigma，目录号：L9150）
14.盐酸卓玛® （Sigma，目录号：T5941）
15.氯化钾（西格玛，目录号：P9333）
16.氯化镁（西格玛，目录号：M8266）
17.生物素化核苷酸（Jena Bioscience，目录号：NU系列）
18.小鼠RNase抑制剂（NEB，目录号：M0314L）
19.焦碳酸二乙酯，DEPC（Sigma，目录号：40718）
20.液化苯酚（西格玛，目录号：P9346）
21.乙酸钠（Sigma，目录号：S2889）
22.乙二胺四乙酸，EDTA（Sigma，目录号：EDS）
23.十二烷基硫酸钠（西格玛，目录号：L3771）
24.氯仿（Sigma，目录号：C2432）
25. GlycoBlue TM共沉淀剂（ThermoFisher ，目录号：AM9515）
26.纯乙醇（西格玛，目录号：E7023）
27.氢氧化钠（西格玛，目录号：S8045）
28. Triton TM X-100（Sigma，目录号：X100）
29.君主® RNA纯化试剂盒（NEB，目录号：T2030L）
30. Dynabeads TM M-280链霉亲和素（ThermoFisher ，目录号：60210）
31.氯化钠（西格玛，目录号：S7653）
32. TRIzol TM试剂（ThermoFisher ，目录号：15596018）
33. Ambion TM T4 RNA连接酶（ThermoFisher ，目录号：AM2141）
34. T4多核苷酸激酶（NEB，目录号：M0201S）
35.聚乙二醇8000（西格玛，目录号：1546605）
36. 5'-三磷酸腺苷，ATP（NEB，目录号：P0756S）
37. dNTP Mix（ThermoFisher ，目录号：18427088）
38.随机六边形底漆（ThermoFisher ，目录号：SO142）
39. SuperScript TM III第一链合成系统（ThermoFisher ，目录号：18080051）
40. NEBNext ®超TM II定向RNA第二链合成模块（NEB，目录号：E7550L）
41. MinElute PCR纯化试剂盒打印（QIAGEN，目录号：28004）
42. NEBNext ®超TM II DNA文库制备试剂盒对于Illumina公司® （NEB，目录号：E7645L）
43. Qubit TM dsDNA HS检测试剂盒（ThermoFisher ，目录号：Q32851）
44. YEPD培养基（请参阅食谱）
45. 2.5×转录缓冲区（请参阅食谱）
46. AES缓冲区（请参阅食谱）
47.洗珠缓冲液（请参阅食谱）
48.结合洗涤缓冲液（请参见配方）
49.低盐洗涤缓冲液（请参阅食谱）
50.高盐洗涤缓冲液（请参阅食谱）
51. DEPC-H 2 O（请参阅食谱）
52. 1 M乙酸钠溶液（请参阅食谱）

设备

1.的Eppendorf ®研究®加移液器仪（Eppendorf，目录号：EP系列）
2. MaxQ TM 6000温育/冷藏可堆叠摇床（ThermoFisher ，目录号：SHKE6000）
3.的Eppendorf BioPhotometer生物分光光度计®仪（Eppendorf，米Odel等：D30）
4. Megafuge ® （贺利氏，米Odel等：1.0R）
5. 5升通用水浴锅（PolyScience ，目录号：WBE05A11B）
6. NEBNext ®磁分离架（NEB，目录号：S1515S）
7.鼓式摇精灵® （ZYMO研究，目录号：S5008）
8. ProFlex PCR系统（ThermoFisher ，目录号：4484075）
9. 5200片段分析仪系统（安捷伦，目录号：M5310AA）

软件
1 ProSize （安捷伦，https: //explore.agilent.com/Software-Download-Fragment-Analyzer-Prosize）
2. Python（2.7.12版，https： //www.python.org/ ）
3. Cython （版本0.23.4，https： //cython.org/ ）
4. NumPy（版本1.11.0，https： //numpy.org/ ）
5. SciPy（版本0.17.0，https： //www.scipy.org/ ）
6. Burrows-Wheeler Aligner（版本0.7.17-r1188，http：//bio-bwa.sourceforge.net/ ）
7. samtools （1.9版，http： //www.htslib.org/ ）
8. pysam （版本0.15.0 ，https： //pysam.readthedocs.io/en/latest/installation.html ）
9. matplotlib（版本2.2.2，https: //matplotlib.org/ ）

程序

准备酵母细胞进行核运行分析
在5 ml YEPD培养基中接种单个酵母菌落。
在30 °C的培养箱中以200 rpm的转速孵育过夜。
测量每种细胞培养物的光密度（OD 600nm ）。
将酵母稀释并重新接种到OD 600为0.2的10 ml YEPD培养基中。
将酵母细胞在30 °C的培养箱中孵育，直到OD 600为0.4-0.6。

酵母核试验
1.在4 °C下以2,000 × g离心酵母细胞5分钟，并去除上清液。
2.上下吹打，用5 ml ice- d d DEPC-H 2 O洗涤细胞沉淀。
3.将酵母细胞在4 °C下以2,000 × g离心5分钟，并吸出上清液。
4.用4.75 ml冰冷的DEPC-H 2 O重悬细胞沉淀。
5.添加250μl的10％Sarkosyl溶液并轻轻混合。
6.在冰上放置20分钟。
7.在4 °C下以400 × g离心酵母细胞5分钟，并除去上清液。
8.重悬带120中的细胞沉淀微升2.5×转录缓冲液，6微升的0.1M DTT的，3.5微升每种1米的中号生物素NTP，和3微升RNA酶抑制剂与总体积为143微升。
9.添加142微升DEPC-H 2 O和15微升10％的十二烷基肌氨酸钠溶液中，并轻轻混合。
10.将混合物在30 ° C下温育5分钟，并在一半时间点（2.5分钟）上下轻轻吸打。

新生RNA提取
1.在4 °C下将反应混合物以400 × g离心5分钟，并除去上清液。
2.快速重悬沉淀在500微升液化苯酚。
3.加入500微升AES缓冲液和PIP ETTE上下破裂的细胞。
4.将混合物在65 °C下每分钟涡旋孵育5分钟。
5.将混合物在冰上孵育5分钟。
6.向其中加入200μl氯仿，涡旋30秒钟。
7.将混合物在室温下孵育2分钟。
8.在4 °C下以14,000 × g离心5分钟。
9.排出水层，然后将其放入另一个新管中（注意避免接触）。
10.广告d 1M乙酸钠溶液到水层中，以200的终浓度毫米。
11.将混合有乙酸钠的RNA水溶液分成两个1.5 ml试管。
12.添加1微升的GlycoBlue TM共沉淀和3×体积的100％乙醇为两个1.5含水层毫升管小号TEP C11（这mixtu重可存储过夜）。
13.在4 °C下以14,000 × g的速度离心混合物30分钟，并除去上清液（注意避免干扰蓝色沉淀）。
14.用新鲜制备的无RNase的5％乙醇洗涤沉淀。
15.在4 °C下以14,000 × g离心5分钟，并除去上清液。
16.让粒料干燥5分钟，并在20重悬它微升DEPC-H的2 O.

碱基水解产生的RNA片段化
1.在65 °C下加热变性RNA溶液40 s，然后将其放在冰上。
2.加入5微升冰冷的1 N氢氧化钠，在冰上孵育10分钟。
3.添加25微升1所述的1M Tris-HCl（pH6.8）中。
4.纯化，用君的RNA ® RNA纯化试剂盒（10微克）用20的洗脱体积微升。
5.加入1微升RNA酶抑制剂。

生物素标记的新生RNA提取
洗30微升的链亲和素M280珠子用500微升通过添加和混合的珠子洗涤缓冲液，1分钟上的磁体和设置在抽出上清液的珠子洗涤缓冲液。
用500μl100 mM NaCl溶液洗涤小珠两次，操作与S tep E1相同。
将小珠重悬于50μl的结合洗涤缓冲液中。
将D部分中的纯化RNA与结合洗涤缓冲液混合至50μl 。
将RNA溶液与重悬的磁珠混合。
将混合物在室温下在旋转器上孵育20分钟。
将混合物放在磁铁上1分钟，然后吸出上清液。
重悬珠子500微升高盐洗涤缓冲液中。
将珠子放在磁铁上1分钟，然后吸出上清液。
重复步骤E8-E10。
用500洗珠两次微升结合洗涤缓冲液中。
用500洗珠两次微升低盐洗涤缓冲液中。
重悬珠子300微升的TRIzol试剂TM溶液。
将混合物在冰上孵育3分钟。
添加60微升氯仿到混合物中并充分涡旋，然后至少20秒。
将混合物在20,000 × g下于4 °C离心5分钟。
纯化在水层中（小心，以避免界面）与君主的RNA ® RNA纯化试剂盒（10微克）用20的洗脱体积微升。

RNA样品的环化
将纯化的RNA在65 °C加热变性1分钟，然后将其置于冰上。
加入下列试剂，以19微升RNA溶液：4微升10×T4连接酶I反应缓冲液，2微升T4连接酶I酶，2微升PNK酶，1微升RNA酶抑制剂的，8微升50％PEG8000和的4微升的10mM ATP的溶液。
将混合物在25 °C下孵育2小时或在16 °C下孵育过夜。
净化与君主的混合物的RNA ® RNA纯化试剂盒（10微克）用20的洗脱体积微升。

滚动循环反转录
1.加入下列试剂到9微升RNA溶液：4微升的10mM的溶液的dNTP，4微升50纳克/的微升随机六聚体和3微升的无RNA酶的水。
2.将反应混合物在65 °C下加热变性1分钟，然后将其置于冰上2分钟以上。
3.添加下列物质到反应混合物：8微升5×第一链合成缓冲液，4微升的0.1mM的DTT溶液，4微升的的SuperScript III酶和Wa的8μL叔
注意：此处使用的缓冲液和酶来自SuperScript TM III第一链合成系统试剂盒。

4.将混合物在25 °C孵育10分钟，然后在42 °C孵育20分钟。
5.净化与君主的混合物的RNA ® RNA纯化试剂盒（10微克）用20的洗脱体积微升。
6. 20添加μ升的无RNase水到RNA溶液。

第二链合成
1.加入38μl具有以下材料的RNA溶液：8μl10 ×第二链合成缓冲液，4μl第二链合成酶混合物和30μl无RNase的水
注：该缓冲液和酶使用，这里是来自NEBNext ®超TM II定向RNA第二链合成模块套件。

2.在将热循环仪盖设置在50 °C的情况下，将反应混合物在16 °C孵育2 h 。
3.使用MinElute PCR纯化试剂盒纯化混合物中的DNA 。

为NGS准备和提交图书馆
1.使用Qubit TM dsDNA HS检测试剂盒在步骤H3中测量cDNA的浓度。
2.用准备测序文库NEBNext ®超TM II DNA文库制备试剂盒对Illumina公司®根据最终准备，接头连接，大小选择和PCR富集制造商的说明。
3.以单端300个碱基对的长度将cDNA文库提交给MiSeq Illumina平台，以进行下一代测序。

数据分析

1.使用Ubuntu 16.04 LTS（Xenial Xerus）运行脚本。
2.从GitHub（https://github.com/ustsam/Em-PC_seq）下载脚本。
3.解压缩文件。
4.确保已安装“软件”部分中的所有软件。
5.打开终端并输入脚本目录
6.编译代码通过键入“蟒setup_newreloc.py build_ext -就地”中的终端。
7.使用终端中的命令调用该函数：

“ ./run_noQsfilter.sh {输出目录的路径} {参考文件的路径} {脚本目录的路径} DUMMY 2 $ {最大读取长度的两倍} $ {数据文件以gzip压缩的形式的路径}。”

8. data.sam.gz可以在输出目录y中找到。“ data.sam.gz”包含共识生成步骤之后的所有转录本。该文件为压缩的sam格式。要解压缩该文件，可以在linux终端中键入以下命令：
gunzip data.sam.gz

9.在输出目录中运行命令以执行数据分析：

“ bash data_analysis.sh {输出目录的路径} {参考文件的路径} {脚本目录的路径} 1 {每个站点的最大深度} {最低的基本质量} {最低的映射质量} {生成的仿真fastq文件的数量}。”

模糊度定义为将转录物定位到参考基因组的方式的数量（Cheung等人，2020）。我们使用了最严格的阈值，即模糊度= 1，最小映射质量= 30，最小基本质量= 30。

10.运行以下命令以重现分析（假设脚本和输出目录以及参考fasta文件位于当前目录中）：

“ bash data_analysis.sh”。/ ./rDNA1.fasta ./ 1 500000 30 30100。”

11.运行以下命令以预处理“ data_analysis.sh ”脚本的输出以进行绘图：

“ bash plot.sh {到输出目录的路径} {到参考文件的路径} {到脚本目录的路径} {模糊度阈值} {每个站点的最大深度} {最低基本质量} {最低映射质量} 1. ”

12. （的plot.sh文件附图中的输出PNG格式）如下：
一种。“ Distribution_NumberOfWaysToMap.png”：转录本可以映射到参考基因组的方式数量的分布（歧义）。y轴是笔录数量，x轴是模棱两可。下面显示一个示例（图2）。

图2.具有特定歧义性的笔录百分比图的示例。歧义性是转录本可以定位到参考基因组的方式的数量。由于实验过程中的环化步骤，导致缺乏有关转录起始信息的歧义。

b。“ MutationTypeSpectrum.png”：RNA转录物中每种突变类型的突变频率。突变频率是错误数除以相应参考碱基的覆盖率。例如：A的数目 Ç误差由基体A的覆盖范围划分的例子如下所示（图3）。

图3.突变谱图的一个例子。显示了RNA链上每种取代类型的突变频率。

C。“ Muta_Frequency_inChrom _ ***。png ”：实验和模拟数据沿染色体位点的突变频率。“ ***”是染色体的名称。富含转录错误的基因组基因座（TEEL）显示为红点。下面显示了一个示例（图4 ）。

图4.整个基因组位点的突变频率图的示例。染色体中每个位点的突变频率显示为红线。通过仿真获得的背景误差显示为灰线。标识为TEEL的位置显示为红点。

d。“ ErrorRate_per_PositionInTranscripts.png”：笔录中每个位置的错误率。位置0对应于转录本的3'端。下面显示了一个示例（图5）。

图5.笔录中每个位置位的错误率图示例。实验数据中每个位置的错误率显示为红点。模拟数据中每个位置的错误率显示为蓝点。x轴是笔录中的位置，其中位置0对应于笔录的3'末端。通过暂停RNA聚合酶可以增加错误率，但是在此实验中无法确定事件的顺序。有两种情况可以拟合观察到的数据，要么是RNA聚合酶暂停以纠正错误，要么是由于错误掺入而导致RNA聚合酶暂停。

13.如果希望使用其他软件工具，则用于绘制图形的输出文本文件为：
一种。“ Distribution_of_Ambiguity.txt”可用于绘制步骤12a中描述的图形。
b。“ MutationTypeSpectrum.txt”可用于以绘制在步骤12b中所描述的图中。
C。“ MutationalFrequency_Exp_chrom _ ***。txt”可用于绘制步骤12c中所述的图形，“ MutationalFrequency_Sim_chrom _ ***。txt”是分别包含用于实验和模拟的染色体中每个位点的Mutational Frequency的文件。“ MutationalFrequency_TEEL_chrom _ ***。txt”包含被视为TEEL的位点的突变频率。第一列是染色体中的位置，第二列是突变频率。
d。“ MutationalFrequency_PerPositionInTranscript.txt”可用于绘制步骤12d中描述的图形。第一列是笔录中的位置。第二列和第三列是模拟数据的平均值和标准偏差。第四和第五列是实验数据的平均值和标准偏差。实验数据的平均和标准偏差是根据最大似然估计的错误率二项式分布计算得出的。

笔记

1. RNA消化：由于RNA的类型和预期的最终大小会影响要使用的测序技术，因此有几种其他的RNA片段化方法。例如，超声处理被广泛用于NGS测序文库的DNA片段化，并且也可以针对RNA片段化进行优化，但是，产物的大小约为100-200 nt ，在尝试获得超过200 nt时需要仔细考虑。在滚环反转录过程中重复2个串联。同时，另一种使用RNase III酶的生物消化方法可以将RNA分子片段化为较小的大小（60-120 nt ），但回收率相对较低（约10％）。
2. RNA电泳：我们建议在每个步骤收集RNA样品以进行故障排除。RNA电泳可以测定RNA的大小和数量。对于少量的RNA的大于200个碱基，但小于6 ，000碱基对，片段分析器（安捷伦）可以被使用，因为它需要不超过2纳克RNA的并且能够产生RNA样品的全面尺寸/量谱。
3. RNA纯化：君主® RNA纯化试剂盒用于替换乙醇沉淀，因为它是更快和更容易用多个样品进行操作。如果RNA净化试剂盒不可用但水层的不当的相分离可导致乙醇沉淀仍可使用contaminati上用的TRIzol TM 。
4.文库制备：在这个协议中，我们使用NEBNext ® UltraTM II DNA文库制备试剂盒的Illumina ®以制备cDNA文库进行测序。Ť这里是也用于文库制备如的Ovation其他替代试剂盒®超低V2 DNA-SEQ文库制备试剂盒和KAPA HTP / LTP文库制备试剂盒。同时准备使用不同的cDNA文库的步骤文库制备试剂盒是相似的，有几点是需要ED被提及。首先，根据用于文库制备的cDNA的比重，这些试剂盒中衔接子的稀释度和PCR富集周期是不同的。例如，NEBNext ®超TM II DNA文库制备试剂盒用于Illumina公司®需要适配器的25倍稀释液和10个PCR循环，如果样品质量为约1毫微克。其次，不同的文库制备试剂盒具有指定的索引引物，应该考虑到每个试剂盒可能根据cDNA样本数量对索引组合有自己的要求。例如，NEBNext ®超TM II DNA文库制备试剂盒用于Illumina公司®表明几个独特的组合，当cDNA样品的数量小于7 。
5. DEPC操作：固体DEPC有毒有害。因此，在使用固体DEPC进行任何操作时，应有适当的眼罩，面罩，全面罩呼吸器，手套和化学防护罩。
6.数据分析：由于环化，有关转录本转录方向和起点的信息未知。所准备的脚本专门用于处理rRNA转录本，其中它们假定所有转录本均沿负方向转录，即起始位置为转录本的3'末端。共识生成步骤（步骤s 7和8）适用于所有原始数据，并且不取决于转录方向。但是，从第9步开始，我们假设转录的方向是负的，因此需要进行更改才能将脚本通用化为其他转录本。需要修改以下文件：“ data_analysis.sh”，“ pysam_make_pileup.py”，“ simulation.py”，“ binomial_distribution.py”，“ plotting.py”和“ plotting_preprocess.py”。另外，由于在数据处理过程中的重新定位而产生歧义。歧义定义为转录本可以定位到参考基因组的方式的数量（Cheung等，2020）。该脚本假设最严格的要求，其中在分析中仅考虑歧义性等于1的成绩单。

菜谱

1. 1 L YEPD培养基
一种。加入10克酵母提取物
b。加入20克蛋白ept
C。加入850毫升dH 2 O
d。在新瓶中将20 g葡萄糖溶于100 ml dH 2 O中
e。在新瓶中将40 mg腺嘌呤溶解在50 ml dH 2 O中
F。将上述试剂在120 °C下高压灭菌15分钟
G。待冷却后，将葡萄糖和腺嘌呤溶液添加到预培养基中
2. 2.5×转录缓冲液
一种。加入Tris-HCl（pH = 7.7）至终浓度为50 mM
b。加入KCl至终浓度为500 mM
C。加入MgCl 2至终浓度为12.5 mM
d。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml
3. AES缓冲区
一种。加入乙酸钠（pH = 5.3）至终浓度为50 mM
b。加入EDTA至终浓度为10 mM
C。加入SDS至终浓度为1％（w / v）
d。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml
4.洗珠缓冲液
一种。加入NaOH至终浓度为0.1 N
b。加入NaCl至终浓度为50 mM
C。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml
5.结合洗涤缓冲液
一种。加入Tris-HCl（pH = 7.4）至终浓度为10 mM
b。加入NaCl至终浓度为300 mM
C。加入Triton TM X-100至终浓度为0.1％（v / v）
d。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml
6.低盐洗涤缓冲液
一种。加入Tris-HCl（pH = 7.4）至终浓度为5 mM
b。加入Triton TM X-100至终浓度为0.1％（v / v）
C。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml
7.高盐洗涤缓冲液
一种。加入Tris-HCl（pH = 7.4）至终浓度为50 mM
b。加入NaCl至终浓度为2 M
C。加入Triton TM X-100至终浓度为0.5％（v / v）
d。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml
8. DEPC-H 2 O
一种。向不含RNase的水中添加0.1％（v / v）DEPC
b。混合过夜，然后高压灭菌
C。过滤灭菌使用0.22的溶液微米过滤器
d。在室温下储存长达一年
9. 1 M醋酸钠溶液
一种。加入4.1克固体乙酸钠
b。加入DEPC-H 2 O至总体积为50 ml

致谢

这项工作得到了深圳市科学技术创新委员会（JCYJ20170413173837121），创新技术委员会（ITCPD / 17-9），香港研究资助局（HKUST C6009-15G，AoE / P-705 / 16，T13-605）的支持/ 18-W）到XH; PPC的GRF 16301319；国立卫生研究院GM25232至JL NSFC（31922088）；香港国际贸易中心（ITCPD / 17-9，ITS / 480 / 18FP）; 获JWBJ资助的香港研资局（26102719，N_HKUST606 / 17，C6002-17GF，C7065-18GF，R4017-18）得到了高级研究所（IAS）博士后研究金的支持。

该协议源自Cheung等。（2020年）

利益争夺

所有作者均声明无利益冲突。

参考

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